摘要
目的:探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录子1（lncRNA MALAT1）调控miR-181a-5p/血管内皮细胞黏附分子1（VCAM1）轴对肝癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响。方法：采用qRT-PCR检测肝癌组织、癌旁组织及人肝正常细胞HL-7702和肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-HEP-1中MALAT1、miR-181a-5p表达水平；将Huh7细胞分为5组：ctrl组、si-NC组、si-MALAT1组、si-MALAT1+anti-NC组、si-MALAT1+anti-miR-181a-5p组；采用qRT-PCR检测各组Huh7细胞中MALAT1、miR-181a-5p表达；CCK-8法、克隆形成实验检测Huh7细胞活力及增殖情况；流式细胞术检测细胞凋亡；划痕实验检测细胞迁移；Western blot检测Huh7细胞中VCAM1、增殖细胞核抗原（PCNA）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）蛋白表达；验证MALAT1、VCAM1分别与miR-181a-5p的关系。结果：与si-NC组和ctrl组比较，si-MALAT1组Huh7细胞的划痕愈合率、细胞活力、克隆形成数、MALAT1、VCAM1、PCNA、Bcl-2、Vimentin蛋白表达降低，miR-181a-5p表达、E-cadherin蛋白及细胞凋亡率上调（P<0.05）；与si-MALAT1+anti-NC组和si-MALAT1组比较，si-MALAT1+anti-miR-181a-5p组中MALAT1表达量变化无统计学差异（P>0.05），细胞活力、克隆形成数、划痕愈合率、VCAM1、PCNA、Bcl-2、Vimentin蛋白表达升高，miR-181a-5p表达、E-cadherin蛋白表达及细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05）；MALAT1与miR-181a-5p、VCAM1与miR-181a-5p均存在靶向负调控关系。结论：沉默MALAT1可能通过miR-181a-5p/VCAM1轴减弱Huh7细胞增殖、迁移，增强其凋亡行为。
关键词
Abstract
Objective To investigate the impact of lncRNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) on the proliferation, apoptosis, and migration of hepatoma cells by regulating miR-181a-5p/vascular endothelial cell adhesion molecule-1 (VCAM1) axis. Methods qRT-PCR was performed to measure MALAT1 and miR-181a-5p expression in liver cancer tissue, adjacent tissue and HL-7702, HepG2, Huh7, SK-HEP-1. The Huh7 cells were separated into five groups: ctrl group, si-NC group, si-MALAT1 group, si-MALAT1+anti-NC group, and si-MALAT1+anti-miR-181a-5p group; the MALAT1 and miR-181a-5p expression in cells of each group was measured by qRT-PCR; the cell proliferation was measured by CCK-8 assay and clone formation experiment; the cell apoptosis were measured by flow cytometry; the cell migration were measured by scratch assay; the protein expression of VCAM1, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), B cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2), E-cadherin, Vimentin in cells were measured by Western blot; relationship between MALAT1 and miR-181a-5p, between miR-181a-5p and VCAM1 were verified. Results Compared with ctrl group and si-NC group, the MALAT1, cell viability, number of clone formation, scratch healing rate, VCAM1, PCNA, Bcl-2, Vimentin protein expression in si-MALAT1 group decreased, the miR-181a-5p expression, E-cadherin protein and apoptosis rate increased (P<0.05); Compared with the si-MALAT1 group and the si-MALAT1+anti-NC group, there was no significant difference in the expression of MALAT1 in the si-MALAT1+anti-miR-181a-5p group (P>0.05), the cell viability, number of clone formation, scratch healing rate, VCAM1, PCNA, Bcl-2, Vimentin protein expression increased, the miR-181a-5p expression, E-cadherin protein and apoptosis rate decreased (P<0.05); MALAT1 and miR-181a-5p, miR-181a-5p and VCAM1 exhibit a negative regulatory relationship, respectively. Conclusion MALAT1 silencing may decrease the proliferation, and migration of Huh7 cells through miR-181a-5p/VCAM1 axis and enhance apoptosis.
肝癌是临床上常见恶性肿瘤，是我国癌症相关死亡的主要原因之一[1]。尽管近年来对肝癌的治疗有所改善，但肝癌患者的预后仍不令人满意[2]。相关研究显示，癌细胞的增殖、凋亡、迁移、免疫抑制参与肿瘤进展[3-4]。因此，探究调控肝癌细胞生物学行为、免疫抑制相关的分子机制对于肝癌的治疗具有重要意义。大量证据表明，lncRNA在肝癌的发生和进展中发挥重要作用。肺腺癌转移相关转录子1（MALAT1）是一种lncRNA，MALAT1在肝癌细胞中呈高表达，敲低MALAT1可以抑制肝癌细胞增殖与迁移[5]。lncRNA可以作为“miRNA海绵”调节下游基因的表达，lncRNA-miRNA-mRNA轴已成为阐明lncRNA分子机制的重要途径[6]。且MALAT1与miR-181a-5p可结合，miR-181a-5p与血管内皮细胞黏附分子1（vascular endothelial cell adhesion molecule-1，VCAM1）可结合。但MALAT1是否通过miR-181a-5p/VCAM1轴影响肝癌细胞生物学行为尚不清楚。因此，本研究旨在探究MALAT1对肝癌细胞生物学行为的影响及分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
选取2019年6月—2020年6月本院收集的42例肝癌患者的癌组织及其癌旁组织（距癌组织边缘2 cm）。所有患者未接受任何抗肿瘤治疗。收集的组织立即在液氮中冷冻并储存于-80 °C。本研究获得本院伦理委员会批准（审批号：20190506），患者均签署知情同意书。人肝正常细胞HL-7702及肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-HEP-1均购自上海富雨生物公司。
1.2 主要试剂
CCK-8试剂盒（货号：R2740）购自北京康瑞纳生物公司；兔源一抗VCAM1（货号：ab134047）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（货号：ab29）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）（货号：ab182858）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）（货号：ab231303）、波形蛋白（Vimentin）（货号：ab20346）、GAPDH（货号：ab8245）及二抗（货号：ab6721）均购自美国Abcam公司。
1.3 细胞培养及分组
将HL-7702、HepG2、Huh7、SK-HEP-1细胞在补充有10% FBS的DMEM中培养，培养条件为37°C、5% CO2。Huh7细胞分成si-NC组、si-MALAT1组、si-MALAT1+anti-NC组、si-MALAT1+anti-miR-181a-5p组，上述各组细胞分别转染si-NC、si-MALAT1、si-MALAT1+inhibitor NC、si-MALAT1+miR-181a-5p inhibitor 48 h，另取正常培养的Huh7细胞作为对照组（ctrl组），处理结束后用于后续研究。
1.4 qRT-PCR检测MALAT1、miR-181a-5p表达
TRIzol提取组织或细胞总RNA，2 μg RNA逆转录为cDNA，以cDNA为扩增体系中的模板进行qRT-PCR。以U6、GAPDH分别作为miR-181a-5p、MALAT1的内参，MALAT1引物：正向5ʹ-TGCGAGTTGTTCTCCGTCTA-3ʹ；反向5ʹ-TATCTGCGGTTTCCTCAAGC-3ʹ；GAPDH引物：正向5'-AATGGTGAAGGTCGGTGTGA-3'；反向5'-CGTGAGTGGAGTCATACTGGAA-3'；miR-181a-5引物p：正向5'-TTAGTGGCTGTCGCAACTTACAA-3'；反向5'-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3'；U6引物：正向5'-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3'；反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。通过2-ΔΔCt法计算MALAT1、miR-181a-5p的表达。
1.5 CCK-8检测细胞活力
将细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板（100 μL/孔），在37℃、5%CO₂条件下培养。待细胞贴壁后，分别培养48 h。随后更换为100 μL新鲜完全培养基，并加入10 μL CCK-8试剂。避光孵育2 h后，用酶标仪于450 nm波长处测定光密度值（OD值）以评估细胞活力。细胞活力（%）=（实验组OD值—空白组OD值）/（对照组OD值—空白组OD值）×100%。
1.6 克隆形成实验检测细胞增殖能力
将细胞以800个/孔的密度接种于6 cm培养板，培养10 d后，用4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色，观察单细胞克隆形成情况。最后，使用Image J软件统计克隆细胞数目，分析各组细胞的克隆形成能力。
1.7 流式细胞术检测细胞凋亡情况
将培养的细胞经胰蛋白酶消化成细胞悬液，用预冷PBS洗涤2次后调整密度至5×105个/mL。然后，将10 µL Annexin V-FITC添加到100 µL细胞悬液中，在4℃下避光孵育15 min。再加入380 µL结合缓冲液和10 µL碘化丙啶后立即进行流式细胞术分析。
1.8 细胞迁移检测
各组细胞（5×105个/孔）接种到6孔板中。随后，使用200 µL移液器吸头在达到95%~100%汇合的细胞上划痕。0、48 h观察划痕愈合情况，记录0、48 h的划痕面积分别为W0、W48。划痕愈合率（%）=（W0—W48）/W0×100%。
1.9 Western blot检测VCAM1、PCNA、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin表达情况
用RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，将蛋白通过BCA法定量、10% SDS-PAGE电泳、转PVDF膜、5%脱脂牛奶封闭后，将膜与一抗VCAM1、PCNA、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin、GAPDH在4℃下孵育过夜。初步孵育后，将膜用PBS洗涤两次，并与二抗共孵育2 h。加入ECL试剂显色蛋白条带，Image J软件评估蛋白灰度值。
1.10 靶向关系验证
分别构建MALAT1、VCAM1野生型质粒（WT）及突变型质粒（MUT），将上述质粒分别与miR-NC或miR-181a-5p mimic共转染于Huh7细胞48 h，检测荧光素酶活性。
1.11 统计学分析
使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。数据表示为，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MALAT1、miR-181a-5p在癌组织及细胞中的表达情况
肝癌组织中MALAT1表达高于癌旁组织，miR-181a-5p表达低于癌旁组织（P<0.05），见图1；肝癌细胞HepG2、Huh7、SK-HEP-1中MALAT1表达高于正常肝细胞HL-7702，miR-181a-5p表达低于HL-7702细胞，且Huh7细胞趋势最明显，因此，下文确定Huh7细胞为研究对象，见图2。
图1MALAT1、miR-181a-5p在癌组织与癌旁组织中的表达
图2MALAT1、miR-181a-5p在肝癌细胞与正常肝细胞中的表达
2.2 沉默MALAT1对Huh7细胞中VCAM1蛋白、MALAT1、miR-181a-5p表达的影响
与si-NC组和ctrl组比较，si-MALAT1组的VCAM1蛋白、MALAT1表达下调，miR-181a-5p表达上调（P<0.05）；与si-MALAT1组、si-MALAT1+anti-NC组比较，si-MALAT1+anti-miR-181a-5p组Huh7细胞中VCAM1蛋白上调，miR-181a-5p表达下调，差异有统计学意义（P<0.05），但MALAT1相对表达量无统计学差异（P＞0.05），见图3。
图3各组Huh7细胞中VCAM1蛋白（A）及MALAT1、miR-181a-5p表达（B）比较
2.3 沉默MALAT1对Huh7细胞增殖和凋亡的影响
与si-NC组和ctrl组比较，si-MALAT1组的细胞活力和克隆形成数下降，细胞凋亡率上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与si-MALAT1+anti-NC组和si-MALAT1组比较，si-MALAT1+anti-miR-181a-5p组细胞活力和克隆形成数上升，细胞凋亡率下调，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。
图4各组Huh7细胞活力（A）、克隆形成数（B）及细胞凋亡率（C）比较
2.4 沉默MALAT1对Huh7细胞迁移的影响
si-MALAT1组细胞划痕愈合率低于si-NC组和ctrl组，si-MALAT1+anti-miR-181a-5p组细胞划痕愈合率高于si-MALAT1+anti-NC组和si-MALAT1组，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。
图5各组Huh7细胞划痕愈合率比较
2.5 沉默MALAT1对Huh7细胞中PCNA、Bcl-2、Vimentin、E-cadherin蛋白的影响
si-MALAT1组PCNA、Bcl-2、Vimentin蛋白低于ctrl组和si-NC组，E-cadherin蛋白高于ctrl组和si-NC组，差异有统计学意义（P<0.05）；si-MALAT1+anti-miR-181a-5p组PCNA、Bcl-2、Vimentin蛋白高于si-MALAT1组和si-MALAT1+anti-NC组，E-cadherin蛋白低于si-MALAT1组和si-MALAT1+anti-NC组，差异有统计学意义（P<0.05），见图6。
图6各组Huh7细胞中PCNA、Bcl-2、Vimentin、E-cadherin蛋白表达比较
2.6 双荧光素酶报告基因检测结果
MALAT1与miR-181a-5p可结合，VCAM1与miR-181a-5p可结合，见图7。miR-181a-5p mimic和MALAT1-WT共转染组荧光素酶活性低于miR-NC和MALAT1-WT共转染组（P<0.05）；miR-181a-5p mimic和VCAM1-WT共转染组的荧光素酶活性低于miR-NC和VCAM1-WT共转染组（P<0.05），见图8。
图7结合位点图
图8两组Huh7细胞荧光素酶活性比较
3 讨论
肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、恶性程度高、易侵袭转移、患者预后差等特点[7]。虽然放疗、化疗等综合治疗手段在一定程度上提高了肝癌患者的生活质量，但无法有效避免肿瘤的转移[8-9]。调查显示，肝癌患者的5年生存率低至3%～5%[10]。因此，探究肝癌细胞转移的分子机制对于改善肝癌患者的生存率意义重大。
LncRNA在人类的正常发育和疾病的发生发展中发挥重要作用。LncRNA表达具有组织特异性，并且通常在各种类型的肿瘤中失调。MALAT1是一种在多种哺乳动物中广泛表达且进化保守的LncRNA[11]。已有研究表明，MALAT1在多种肿瘤中表达异常，如MALAT1在前列腺癌组织和细胞中高表达，沉默MALAT1可抑制前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭[12]；抑制MALAT1表达可促进结肠癌细胞凋亡并抑制细胞增殖[13]；在缺氧条件下敲低MALAT1可抑制肝癌Hep3B细胞的肿瘤生长[14]。以上研究证实了MALAT1在多种肿瘤中具有促癌作用。本研究显示，在肝癌组织及细胞中MALAT1上调表达，敲低MALAT1减弱了Huh7细胞增殖、迁移行为，促进细胞凋亡，同时抑制增殖相关蛋白PCNA、迁移相关蛋白Vimentin、抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达，促进迁移相关蛋白E-cadherin的表达。表明MALAT1在肝癌Huh7细胞中发挥癌基因的作用。提示MALAT1可能成为治疗肝癌的潜在有效靶点之一。
LncRNAs可通过调节miRNAs水平参与细胞的生理和病理过程[15]。据报道，敲低MALAT1可通过上调miR-194抑制下咽鳞状细胞癌细胞的恶性行为[16]；MALAT1通过海绵化miR-202促进骨肉瘤的肺转移[17]。本研究发现MALAT1与miR-181a-5p可结合。miR-181a-5p在乳腺癌细胞中低表达，上调其表达可抑制细胞增殖[18]；过表达miR-181a-5p可抑制肝癌细胞的增殖与转移[19]。本研究显示，抑制miR-181a-5p减弱了敲低MALAT1对Huh7细胞生物学行为的影响，且MALAT1可靶向负调控miR-181a-5p表达。提示沉默MALAT1可能通过上调miR-181a-5p减弱Huh7细胞的增殖与迁移，并增强其凋亡能力。
lncRNA-miRNA-mRNA轴是揭示lncRNA分子机制的重要途径。为探究沉默MALAT1影响Huh7细胞生物学行为的分子机制。本研究证实了miR-181a-5p可靶向调控VCAM1。VCAM1是免疫球蛋白超家族的重要成员，可促进结直肠癌细胞的转移[20]；上调VCAM1可促进肝癌的发生与转移[21]。本研究发现，沉默MALAT1后，miR-181a-5p表达升高，VCAM1蛋白表达降低，在沉默MALAT1后加入miR-181a-5p inhibitor进行干预，结果显示，miR-181a-5p表达下调，VCAM1蛋白表达上调；同时miR-181a-5p可靶向负调控VCAM1，提示敲低MALAT1抑制Huh7细胞增殖、迁移行为，促进细胞凋亡可能是通过调控miR-181a-5p/VCAM1轴实现的。最近的研究显示，沉默MALAT1在下调miR-146a表达的同时，上调PI3K/Akt/mTOR信号通路中关键信号分子的表达水平，继而抑制肝癌进展[22]。本研究与此研究均表明MALAT1通过竞争性结合miRNA促进肝癌发展，但靶向不同的miRNA-靶基因轴，反映了MALAT1在肝癌中的多效性调控网络。联合靶向这两条轴可能提供更全面的治疗策略。
综上所述，敲低MALAT1可能通过调控miR-181a-5p/VCAM1轴减弱Huh7细胞增殖、迁移，并增强其凋亡能力。MALAT1/miR-181a-5p/VCAM1轴可能是治疗肝癌的新靶点。
