摘要
目的：探讨淫羊藿苷（ICA）对脂多糖（LPS）诱导的人单核细胞系THP-1炎症反应的调控作用及其潜在分子机制。方法：采用CCK-8法筛选ICA的安全浓度后，将THP-1细胞分为对照组、LPS组（5 µg/mL）、ICA组（1000 nmol/L）及ICA + LPS组（ICA预处理1 h后加入LPS）。采用流式细胞术检测细胞吞噬功能、C C趋化因子受体2（CCR2）及巨噬细胞极化标志物（CD86/CD206）表达，qPCR和Western blot方法检测促炎因子[白细胞介素（IL）-6、IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF）-α]表达水平。结果：1000 nmol/L为ICA发挥作用的最适浓度。与对照组相比，LPS刺激24 h后THP-1单核细胞吞噬能力增强，CCR2、CD86和CD206表达均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）；与LPS组相比，ICA+LPS组THP-1细胞吞噬能力升高，CCR2、CD86和CD206表达水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。qPCR和Western blot结果显示，与对照组相比，LPS诱导单核细胞表达IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA和蛋白水平显著升高；与LPS组相比，ICA+LPS组上述促炎因子的表达水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：ICA可抑制LPS诱导的单核细胞促炎反应，其作用机制与调控单核细胞吞噬、趋化及巨噬细胞极化有关，可作为调控单核/巨噬细胞功能的候选药物开展后续研究。
Abstract
Objective To investigate the regulatory effects of icariin (ICA) on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response in THP-1 human monocytic cell line and its underlying mechanisms. Methods The safe concentration of ICA was screened using the CCK-8 method. Then THP-1 cells were divided into control, LPS(5 µg/mL), ICA(1000 nmol/L), and ICA+LPS(LPS added after ICA pretreatment for 1 h). The effects of ICA on phagocytic function (fluorescent latex beads), CCR2 chemokine receptor expression, and macrophage polarization markers (CD86/CD206) were evaluated by flow cytometry. qPCR and Western blot were used to analyze mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines (IL-6、IL-1β and TNF-α). Results The optimal concentration of ICA in this experimental system was determined to be 1000 nmol/L. The fluorescent latex bead phagocytosis assay showed that compared with the control group, the phagocytic capacity of monocytes was significantly increased after LPS stimulation for 24 h; compared with the LPS group, the phagocytic capacity was further significantly enhanced in the ICA+LPS group (P<0.05). Flow cytometry results revealed that compared with the control group, LPS stimulation upregulated the expression of CCR2 (indicating enhanced chemotactic ability) as well as CD86 and CD206 (indicating differentiation toward macrophages); compared with the LPS group, the ICA+LPS group significantly reversed the LPS-induced upregulation of CCR2, CD86, and CD206. qPCR and Western blot results demonstrated that compared with the control group, LPS stimulation markedly increased the mRNA and protein expression levels of IL-6, IL-1β, and TNF-α in monocytes; compared with the LPS group, the ICA+LPS group significantly reduced the expression levels of these pro-inflammatory cytokines (P<0.05). Conclusion ICA exerts anti-inflammatory effects by regulating monocyte phagocytosis, chemotaxis, and macrophage polarization. These experimental findings provide direct evidence for ICA's potential anti-inflammatory therapeutic application in monocyte/macrophage-mediated inflammatory diseases, suggesting it could serve as a candidate drug to modulate monocyte/macrophage functions for further studies.
牙周炎的核心病理在于牙菌斑中革兰阴性菌（如牙龈卟啉单胞菌）释放的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4），诱导单核巨噬细胞过度活化，释放肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6等细胞因子，促进炎症进展，导致牙龈炎症和牙槽骨吸收[1]。研究表明，敲除TLR4可显著抑制该通路，减轻多菌种感染引发的牙龈炎与骨破坏[2]，提示单核巨噬细胞活化在牙周炎免疫炎症中起核心作用。生物信息学分析显示，牙周炎中的巨噬细胞虽呈混合表型，却普遍来源于骨髓中的单核细胞谱系，单核细胞在巨噬细胞极化中受II类主要组织相容性复合体转录激活因子、核因子κB p65亚基等因子驱动[3]。临床上，虽有甲硝唑、氯己定等抗生素或局部递送系统（凝胶、薄膜），但因耐药性、菌群失调及药物浓度难以维持等问题，难以逆转牙槽骨吸收，亟需开发兼具抗炎与组织再生功能的新型治疗系统[4]。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿的主要黄酮类成分，近年来因其多靶点的药理活性受到关注[5]。ICA已被证实可抑制LPS诱导的炎症反应[6-7]，表现出良好的抗炎作用，但其作用机制有待阐明。本研究以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为模型，探讨ICA在LPS诱导的炎症环境下对单核细胞活力、趋化、吞噬、极化及促炎因子表达的调控作用，以阐明其在牙周炎症中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
ICA购自天津市药物检测所；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）荧光标记乳胶微球、LPS购自美国Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素购自美国Gibco公司。反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Ki和荧光PCR试剂盒TB Green® Premix Ex Taq™购自宝日医生物技术（北京）有限公司。PerCP/Cyanine5.5标记的人抗炎型标志物分化簇（cluster of differentiation，CD）206和CD14购自美国eBioscience公司，PE标记的人C-C趋化因子受体2（C-C chemokine receptor 2，CCR2）和PerCP/Cyanine5.5标记的人共刺激分子CD86购自美国BD公司，FITC标记的人细胞表面CD11b购自美国Biolegend公司。抗人IL-6和TNF-α购自北京博奥森生物技术有限公司，抗人IL-1β购自武汉三鹰生物技术有限公司，内参β-actin购自江苏亲科生物研究中心有限公司。THP-1人单核细胞系细胞购自武汉原生原代生物医药科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
THP-1人单核细胞系细胞置于含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养基中培养。参照文献[8]，在浓度筛选实验中，按照10倍梯度依次设置ICA的终浓度梯度为0、10、100、1000、10 000 nmol/L，每个浓度设3个复孔。将THP-1细胞以5×105个/mL、200 µL/孔接种于96孔板中，分别培养24 h或48 h后，添加20 µL CCK-8试剂，继续孵育2 h，于450 nm波长下测定光密度（OD）值。后续功能实验分为4组：对照组不加入任何干预因素；LPS组加入5 µg/mL LPS；ICA组加入1000 nmol/L ICA（溶于DMSO）；ICA+LPS组用ICA预处理1 h后加入5 µg/mL LPS。所有细胞均在37℃、5 %CO₂条件下培养。
1.2.2 吞噬功能检测
收集经各处理因素刺激24 h后的THP-1细胞，加入FITC标记的1.0 µm乳胶微球悬浮液，于37℃、5% CO2条件下孵育3 h。然后加入1 mL预冷磷酸盐缓冲盐水终止反应，以1000 r/min离心5 min（4℃），洗涤3次，最后用300 μL PBS重悬细胞。采用流式细胞仪检测各组样本，至少采集1×104个细胞，以FITC阳性细胞百分比表示单核细胞吞噬荧光乳胶珠率，即吞噬率。
1.2.3 流式细胞术检测细胞表面分子
收集各组处理48 h后的THP-1细胞，先加入可结晶片段阻断剂封闭15 min，再加入相应抗体冰上避光染色20 min。PBS洗涤2次后重悬，用流式细胞仪检测，每个样本至少采集1×104个细胞，以同型对照设置阳性细胞阈值，结果以FITC阳性细胞百分比表示。数据通过FlowJo-V10软件进行分析。
1.2.4 qPCR检测促炎因子水平
收集各组处理24 h后的THP-1细胞，Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA纯度及浓度。PrimeScript™ RT试剂盒进行cDNA反转录，采用TB Green®Premix Ex Taq™两步法实时荧光定量PCR系统进行扩增，引物序列如下：TNF-α：5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’； IL-6：5’-ATGAGGAGACTTGCCTGGTGAA CTCTGGCTTGTTCCTCACTACTCTC-3’； IL-1β：5’-CGGGACTCACAGCAAAAAA TTCAACACGCAGGACAGGT-3’。以β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析各因子的mRNA相对表达量。
1.2.5 Western blot法检测蛋白表达水平
LPS刺激48 h后收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液进行冰上裂解，离心获得总蛋白提取液。采用BCA法测定总蛋白浓度，取等量蛋白样品，经变性后进行SDS-PAGE电泳（浓缩胶80 V，分离胶120 V），随后将蛋白转印至NC膜（300 mA，约60 min）。经5%脱脂奶粉封闭2 h，与IL-6、TNF-α、IL-1β及内参β-actin的一抗于4℃孵育过夜，与相应二抗室温孵育1 h。最后经ECL化学发光显影，使用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示其相对表达水平。
1.3 统计学分析
实验数据采用GraphPad Prism8.0.1软件分析数据及绘图，计量资料以表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用Tukey检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 ICA对单核细胞活力的影响
CCK-8法检测结果显示，ICA处理24 h时，10、100、1000、10 000 nmol/L浓度组THP-1细胞活力与0 nmol/L组相比差异无统计学意义（P>0.05）。处理48 h时，10 000 nmol/L ICA组THP-1细胞活力显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），提示该浓度具有细胞毒性；而10～1000 nmol/L浓度组细胞活力均保持在90%以上，与0 nmol/L组相比差异无统计学意义（P>0.05），见图1。表明1000 nmol/L为本细胞培养体系中ICA的安全浓度上限，后续研究统一选用1000 nmol/L ICA进行处理。
图1不同浓度ICA对THP-1细胞活力的影响
2.2 ICA对单核细胞吞噬功能的影响
与对照组相比，LPS组THP-1细胞吞噬率显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；ICA组与对照组吞噬率差异无统计学意义（P>0.05）；ICA+LPS组吞噬率显著高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
图2各组单核细胞吞噬能力比较
2.3 ICA对LPS刺激下单核细胞趋化功能的影响
与对照组比较，LPS组和ICA组细胞表面CD14表达无明显变化（P>0.05），CCR2表达水平均显著上调，差异有统计学意义（P <0.05）；ICA+LPS组CD14和CCR2表达水平均显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与LPS组比较，ICA+LPS组细胞表面CD14表达无明显变化（P>0.05），CCR2表达水平显著下调，差异有统计学意义（P <0.05）；与ICA组相比，ICA+LPS组CD14表达水平显著上调，CCR2表达水平显著下调，差异有统计学意义（P <0.05），说明ICA能够显著抑制LPS对CCR2的诱导效应，对单核细胞的趋化具有明显的调控作用，见图3。
图3各组细胞趋化能力比较
2.4 ICA对LPS刺激下单核细胞向巨噬细胞分化的影响
与对照组比较，LPS组CD11b、CD86及CD206的表达水平显著上调，差异有统计学意义（P<0.05），提示LPS可有效诱导单核细胞向巨噬细胞极化。与LPS组相比，ICA+LPS组细胞表面CD11b、CD86及CD206的表达水平均出现显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）。表明ICA能够显著抑制LPS诱导的单核细胞向巨噬细胞的分化及活化过程，并对巨噬细胞的表型极化具有明显的调控作用，见图4。
图4各组单核表面表达巨噬细胞相关表型蛋白水平比较
2.5 ICA对LPS刺激下单核细胞产生促炎性因子的影响
与对照组比较，LPS组IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA和蛋白表达水平均显著升高，差异有统计学意义（P <0.05），表明LPS能有效诱导单核细胞分泌促炎性因子。与LPS组相比，ICA+LPS组IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），提示ICA对LPS诱导的炎症反应具有抑制作用，见图5。
图5各组单核细胞产生促炎性细胞因子水平比较
3 讨论
单核细胞作为机体固有免疫的重要组成部分，其吞噬功能是清除病原体、维持组织稳态的关键环节，而CCR2介导的趋化作用则调控单核细胞向炎症部位募集，参与炎症反应的启动与发展。在牙周炎病理过程中，单核巨噬细胞的吞噬能力是清除牙周袋内细菌及其代谢产物、阻断持续致病刺激的关键环节[9-10]；而CCR2与牙周骨丧失密切相关[11]，也是细菌诱导破骨细胞信号放大的重要来源[12]。本研究初步探讨了ICA在THP-1人单核细胞中对炎症反应的调控作用及潜在机制，结果显示，在安全浓度（1000 nmol/L）下，ICA能显著增强LPS诱导下单核细胞的吞噬能力，提示ICA能在炎症环境中增强单核细胞的防御功能，有助于清除病原体。与此同时，ICA能显著降低LPS诱导的CCR2表达，说明ICA能抑制CCR2介导的单核巨噬细胞趋化和迁移，从而可能减少炎症细胞的过度募集，达到减轻组织炎症损伤的目的。
单核细胞在炎症刺激下可分化为巨噬细胞，且巨噬细胞具有高度可塑性，主要分为促炎型（M1型）和抗炎型（M2型）两种极化表型，其表型平衡直接决定牙周炎症反应的走向[13-14]。本研究通过检测细胞表面CD86（M1型巨噬细胞标记物）与CD206（M2型巨噬细胞标记物）的表达评价ICA对LPS诱导单核细胞向巨噬细胞分化的影响。结果显示LPS刺激可同时上调CD86和CD206的表达，说明LPS在诱导促炎M1型极化的同时，也会激活一部分抗炎M2型极化通路，表现出一定的细胞群体多样性及适应性反应。而ICA与LPS共处理则能显著抑制上述标志物的上调，提示ICA能有效调控LPS诱导的巨噬细胞极化表型，而非单纯抑制其向促炎的M1型反应偏移，与已有研究相同[15-16]。LPS作为经典炎症刺激物，可通过激活核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路诱导巨噬细胞向M1型极化，并促进促炎因子释放[17]。ICA已被证实可抑制NF-κB p65核转位及核因子κB抑制因子α磷酸化降低炎症因子转录[18]，逆转巨噬细胞的异常极化趋势，维持M1/M2型巨噬细胞的表型平衡，进而发挥抗炎作用。本研究结果显示，ICA可显著降低LPS诱导的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平，显示出多靶点的抗炎潜力。
综上所述，在安全浓度下，ICA可通过多重途径发挥抗炎及免疫调节作用。后续研究需进一步构建牙周炎动物模型，并验证ICA在体内的抗炎效应及安全性；同时还需深入探究ICA调控炎症反应的具体分子靶点及信号通路，明确其作用机制；同时还需优化ICA的给药方式，探究其量效关系，为ICA的临床转化及提供更全面的理论和实验依据。