摘要
目的：探讨莪术二酮对创伤性应激障碍综合征（PTSD）的治疗作用及其机制。方法：体外采用脂多糖构建小胶质细胞炎症模型，给予莪术二酮处理后，分别检测上清中炎症因子表达水平以及细胞炎症信号通路中p65和p38的磷酸化水平。采用单次延长应激（SPS）模型构建大鼠PTSD模型（模型组），分别给予莪术二酮低剂量（1 mg/kg）、中剂量（20 mg/kg）和高剂量（60 mg/kg）腹腔注射。通过条件恐惧试验、旷场实验等行为学检测莪术二酮对各组大鼠焦虑和抑郁样行为的作用。检测各组大鼠血清下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）相关激素皮质酮（Cort）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH），以及炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的含量，同时检测大脑皮质中5-羟色胺（5-HT）、5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）和去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（AD）的含量变化。结果：体外细胞实验结果显示：莪术二酮处理后，TNF-α、IL-1β、IL-6的表达明显降低，莪术二酮处理组p65和p38磷酸化水平显著降低。体内实验证实：注射莪术二酮可显著缩短大鼠在条件恐惧箱中的凝滞时间，与模型组比较，旷场实验莪术二酮组中央区域停留时间显著延长。血清Cort、CRH、ACTH及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6比模型组显著降低。莪术二酮组脑组织中的单胺类神经递质5-HT、5-HIAA含量显著降低。结论：莪术二酮能有效缓解PTSD大鼠的焦虑与抑郁样行为，其治疗机制可能与纠正HPA功能紊乱、抑制全身性及神经炎症反应，并调节脑内单胺类神经递质水平密切相关。
关键词
Abstract
Objective To explore the effect of curdione on post-traumatic stress disorder (PTSD) and its underlying mechanism. Methods An inflammatory model of microglia was constructed in vitro using lipopolysaccharide (LPS). After treatment with curdione, the expression levels of inflammatory factors in the cell supernatant and the activation levels of p65 and p38 in cellular inflammatory signaling pathways were detected, respectively. For in vivo experiments, a single prolonged stress (SPS) model was constructed to establish a rat PTSD model. Rats were given intraperitoneal injection of low-, medium-, and high-dose curdione, respectively. The effects of curdione on anxiety‑ and depression‑like behaviors in PTSD rats were determined by conditioned fear test and open field test. The serum levels of corticosterone (Cort), corticotropin‑releasing hormone (CRH), adrenocorticotrophic hormone (ACTH), TNF‑α, IL‑1β, and IL‑6 were measured. Meanwhile, the changes in 5‑hydroxytryptamine (5‑HT), 5‑hydroxyindoleacetic acid (5‑HIAA), norepinephrine (NE), and adrenaline (AD) in the cerebral cortex were examined. Results In vitro results showed that the expression of TNF‑α, IL‑1β, and IL‑6 were significantly decreased in the curdione‑treated groups, and the phosphorylation levels of p65 and p38 were also significantly reduced. In vivo behavioral tests confirmed that curdione administration significantly reduced the freezing time of rats in the conditioned fear box. Compared with the PTSD model group, the curdione‑treated groups showed significantly increased central zone residence time in the open field test. Serum levels of Cort, CRH, ACTH, and various inflammatory factors related to the hypothalamic‑pituitary‑adrenal (HPA) axis were correspondingly restored in curdione‑treated groups compared with the PTSD group. The contents of monoamine neurotransmitters 5‑HT and 5‑HIAA in the cerebral cortex were significantly reversed in curdione‑treated groups. Conclusion Curdione can effectively alleviate anxiety‑ and depression‑like behaviors in PTSD rats. Its therapeutic mechanism may be closely related to correcting HPA axis dysfunction, inhibiting systemic and neuroinflammatory responses, and regulating the balance of central monoamine neurotransmitters. This study provides experimental evidence for curdione as a potential therapeutic agent for PTSD.
创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）是个体经历手术打击、严重创伤等极端事件后出现的精神障碍，主要表现为创伤再体验、警觉性增高、回避或麻木三联征，症状一般在遭受创伤后数日甚至数月后出现，病程可达数年[1-2]。由创伤应激导致的恐惧记忆泛化是PTSD的病理核心和治疗难点[3]，严重影响患者的生存质量。目前PTSD的发病机制还不清晰，其功能研究主要集中在下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）、免疫失调等通路上。HPA是控制包括恐惧学习在内的应激反应的主要神经内分泌系统，其功能障碍已在应激相关的精神障碍如重性抑郁障碍和PTSD中被反复报道[4-5]。从发病机制角度研究显示，PTSD与免疫失调和炎症反应密切相关[6]，PTSD患者可表现出促炎标志物水平显著升高[7]，同时，有研究证实具有抗炎作用的药物可能是治疗PTSD的更好选择[8]。
莪术二酮又称莪二酮，是从中药莪术中提取的一种倍半萜类化合物[9]，具有神经保护、抗氧化、抗肿瘤等多重药理功效，是活血化瘀的经典中药[10]。莪术二酮可通过抑制炎症免疫反应、抗氧化和抗凋亡，减少神经功能缺损情况，促进认知功能恢复，具有神经保护作用[11-12]，然而，其对于PTSD是否具有治疗潜力，以及其作用是否涉及对PTSD核心病理环节——HPA和神经炎症的调控，目前尚不清楚。基于此，本研究提出科学假说：莪术二酮可能通过抑制神经炎症信号通路和稳定HPA功能，从而缓解PTSD的核心症状。本研究通过实验对其进行机制验证。
1 材料与方法
1.1 实验动物
50 只成年雄性SD大鼠，体质量220 g左右，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。12 h光照/12 h黑暗交替饲养，期间饮水进食自由。本研究通过武警特色医学中心实验动物伦理委员会审批（编号：2023-0011）。
1.2 主要仪器与试剂
莪术二酮（美国MCE公司，规格50 mg）、p65、pp65、p38、pp38抗体和细胞裂解液（美国CST公司），皮质酮（corticosterone，Cort）、肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）ELISA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），5-羟色胺（5-serotonin，5-HT）、5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）、肾上腺素（adrenaline，AD）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），小胶质细胞细胞系BV2（上海富衡生物科技有限公司），免疫印迹法（Western blotting）试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），条件恐惧箱系统、旷场实验（上海欣软信息科技有限公司），电泳仪、转膜仪（美国BioRad公司），酶标仪（美国赛默飞公司），凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。
1.3 脂多糖诱导BV2细胞模型的构建
选取小胶质细胞系BV2细胞，用脂多糖诱导BV2细胞构建炎症细胞模型。实验分为3组：对照组、模型组和莪术二酮组，对照组加入普通培养基；模型组和莪术二酮组加入1 μg/mL脂多糖，莪术二酮组同时加入60 μm/L莪术二酮，莪术二酮使用二甲基亚砜溶解。
1.4 Western blotting检测
各组细胞经转染或处理后，加入适量裂解液提取细胞总蛋白。取10 μg蛋白样品，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），而后分别加入以p65、p-p65、p38、p-p38和GAPDH一抗4℃过夜。次日加入HRP标记的二抗室温孵育1 h，采用化学发光法显影。以GAPDH为内参照，用Image J软件分析蛋白条带的灰度值。
1.5 造模
通过随机数字表法将50只大鼠随机分为对照组、模型组和莪术二酮低、中、高剂量组，每组各10只。除对照组外，其余4组均通过暴露于单一的长时间应激（single prolonged stress，SPS）构建大鼠PTSD模型，24 h后，莪术二酮低、中、高剂量组分别给予1、20、60 mg/kg莪术二酮腹腔注射，模型组给予等量生理盐水腹腔注射。各组大鼠放置约束器中，根据个体大小调整尺寸实现完全固定。强制束缚2 h。束缚完成后，每只大鼠被单独放置在圆筒状容器中（直径20 cm，高度45 cm，内含约25 cm的水，水温23~24 °C）强迫游泳20 min。恢复15 min后，分别进行吸入式麻醉直到完全麻醉。对照组大鼠放置于同一饲养环境，但不进行SPS造模。
1.6 条件恐惧试验
建模后第7天进行。训练阶段：将5组大鼠放入条件恐惧箱2 min（A相），记录这最初2 min内动物的凝滞时间作基线。接着加入条件声音，80 dB，30 s（B相）。紧接着再给予电击刺激，0.35 mA，2 s（C相），完成一轮训练。如需要多轮训练，则重复A、B、C三相训练即可。记录整个训练阶段动物凝滞时间，用以测量动物的非条件恐惧。测试阶段：训练24 h后将大鼠置于条件恐惧箱中，恐惧箱刺激条件A，B相不变，C相电击取消。重复A、B、C三相两次，记录大鼠的凝滞时间，并计算其与总测试时间百分比。
1.7 旷场实验
建模后第7天进行。测试前1 h让5组大鼠进入实验环境中适应，打开软件和实时监测视频。将实验大鼠从鼠笼中取出放置在旷场箱的中心区域，实验人员离开旷场箱周围以免干扰大鼠行为。大鼠在旷场箱里自由活动5 min后用视频收集系统收集行为轨迹，并运用系统软件分析记录大鼠的中央区域的活动时间，并计算其与总测试时间百分比。
1.8 取材
行为学实验结束后，每组10只中的5只用于取血清样本，另外5只用于制备大鼠脑组织匀浆样本。1）血清标本采集：5%异氟烷麻醉小鼠，摘眼球取血，常温静置30 min，以3500 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存。用于测量血清和细胞上清液中的肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、Cort、CRH及ACTH的含量。2）大鼠脑组织匀浆的制备：从液氮罐中取出预先冷冻保存的大鼠脑组织，将组织放入微量离心管，按1∶9的比例加入4℃预冷无菌生理盐水。将脑组织块和裂解液加入预冷的玻璃匀浆器套管，置于冰浴中充分研磨。将匀浆液转移至1.5 mL EP管中，以4000 ×g离心5 min。小心吸取上清，-80℃超低温冰箱备用。用于测量脑组织中5-HT、5-HIAA、NE、AD的含量。
1.9 ELISA检测
依照试剂盒说明书测量TNF-α、IL-1β、IL-6、Cort、CRH、ACTH、5-HT、5-HIAA、NE、AD水平。
1.10 统计学分析
采用 GraphPad Prism 8.0 统计软件对数据进行分析，计量资料均用表示，比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 莪术二酮对BV2细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响
ELISA结果所示，与模型组相比，莪术二酮组BV2细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.001），见图1。
图1三组BV2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平比较
2.2 莪术二酮对BV2细胞中炎症相关信号通路的影响
与模型组相比，莪术二酮组的p38和p65磷酸化水平降低，差异有统计学意义（P<0.001），见图2。
图2三组BV2细胞p38和p65的磷酸化水平比较
2.3 莪术二酮对PTSD大鼠焦虑和抑郁样行为学反应的影响
条件恐惧箱实验结果证实，与对照组相比，模型组凝滞时间明显升高（P<0.01）。与模型组相比，莪术二酮低、中、高剂量组均能显著降低大鼠在条件恐惧箱中的凝滞时间（P＜0.01）。旷场实验结果证实，与对照组相比，模型组中央区域的活动时间明显降低（P<0.01），与模型组比，莪术二酮低、中、高剂量组能显著提高大鼠在中央区域的活动时间（P<0.01），见图3。
图3各组大鼠行为指标凝滞时间和中央区域的活动时间比较
2.4 莪术二酮对PTSD大鼠血清中HPA轴激素含量的影响
与对照组相比，模型组大鼠血清中Cort、CRH和ACTH含量增加（P＜0.001）。与模型组相比，莪术二酮低、中、高剂量组大鼠血清中Cort、CRH和ACTH含量均下降（P<0.05）。与对照组相比，模型组大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平上调（P＜0.001）；与模型组相比，莪术二酮低、中、高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降（P＜0.01），见图4。
图4各组大鼠血清Cort、CRH、ACTH和炎症因子水平比较
2.5 莪术二酮对脑组织中单胺类神经递质含量的影响
与对照组相比，模型组大鼠脑组织中单胺类神经递质5-HT、5-HIAA含量显著降低（P<0.05）。与模型组相比，莪术二酮低、中、高剂量组5-HT水平升高，莪术二酮中、高剂量组5-HIAA水平升高，差异有统计学意义（P<0.05），而5组大鼠NE、AD含量差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1各组大鼠脑组织中单胺类神经递质含量比较
注：a与对照组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05
3 讨论
随着社会的进步和医学的发展，外科手术及严重创伤后的管理已成为外科领域的重要课题。手术或创伤后出现的PTSD发病率呈上升趋势。研究表明，麻醉可能导致神经损伤[13]。PTSD在很大程度上被认为是一种心理现象，但对PTSD神经生物学机制的理解，包括结构神经影像学、功能神经影像学、神经内分泌学、遗传学的相关研究近年来迅速增加，治疗PTSD的药物治疗方案仍然缺乏，包括美国食品和药物管理局在内的监管机构批准的只有两种选择性5-HT再摄取抑制剂：帕罗西汀和舍曲林，但其缓解作用大多不明显[14]，有研究结果证实，恐惧泛化是由中缝背核侧翼神经元神经递质表达的转变引起的，揭示了常用PTSD治疗药物无效的原因，为开发新的治疗手段提供了思路[15]。本研究采用国际科学学术会议于2005年制定的SPS流程构建PTSD大鼠动物模型[16]，SPS模型能够模拟人类 PTSD患者HPA轴改变，对生理和/或心理压力源产生应激反应，刺激HPA，促使下丘脑室旁核释放CRH和ACTH，进而诱导糖皮质激素（皮质醇）分泌。本研究通过体内外实验相结合的方式，系统评估了莪术二酮治疗PTSD的潜力。结果表明，莪术二酮不仅能显著改善SPS模型大鼠的恐惧记忆泛化与焦虑样行为，还能在神经内分泌（HPA轴）、免疫（神经炎症）及神经化学（单胺类神经递质）等多个层面发挥调控作用。这些发现为将莪术二酮开发为一种基于多靶点作用机制的PTSD新型治疗药物提供了坚实的实验依据。
HPA轴的活化和炎症反应之间相互作用在PTSD患者中起着关键作用[17]。PTSD患者中多种促炎血液生物标志物发生显著升高，抑制神经炎症对于治疗PTSD具有重要作用[7，18]。研究证实使用NF-κB抑制剂和高浓度的皮质酮可抑制大脑海马体中的NF-κB激活，并缓解PTSD样行为学改变[19]。因此本研究首先从小胶质细胞炎症模型入手，旨在观察莪术二酮是否存在缓解神经炎症的可能，模型组中炎症标志物水平显著升高，而经莪术二酮处理后，炎症水平均得到控制。同时，在PTSD大鼠模型中检测血清中的炎症标志物，经莪术二酮处理后，其水平均降低，而后在细胞模型中分析了炎症反应的经典信号通路NF-κB/p38，证实莪术二酮抑制炎症反应是通过抑制p65和p38的磷酸化来实现的。本研究提出了一个莪术二酮治疗PTSD的潜在作用网络模型：莪术二酮通过抑制NF-κB/p38信号通路，直接遏制小胶质细胞介导的神经炎症；炎症水平的下降有助于减轻对HPA轴的持续兴奋，促进其功能恢复正常；HPA轴的稳定与炎症的消退共同为神经元提供了更适宜的生存环境，进而促进前额叶皮质等关键脑区5-HT能神经传递的功能恢复。这三者之间可能存在积极的相互促进作用，共同构成了莪术二酮改善PTSD核心症状的协同机制。