摘要
目的：探讨三仙开心散对D-半乳糖（D-gal）致生殖衰老大鼠睾丸功能的保护作用及机制。方法：将50只SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组及三仙开心散低、中、高剂量组，每组10只。除对照组外，其余各组腹腔注射D-gal（300 mg/kg）构建衰老模型。造模第5周起，三仙开心散低、中、高剂量组分别灌胃0.8、1.6、3.2 g/kg三仙开心散，持续4周。8周后，检测各组大鼠睾丸及附睾脏器系数、精子数量与活力；HE染色观察睾丸病理；ELISA法检测睾丸氧化应激指标[超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px），过氧化氢酶（CAT），丙二醛（MDA）]及血清激素与炎症因子（睾酮（T），卵泡刺激素（FSH），一氧化氮（NO），一氧化氮合酶（NOS）；Western blot检测睾丸活化型半胱天冬酶3（Cleaved Caspase-3）蛋白表达。结果：与模型组相比，三仙开心散低、中、高剂量组大鼠睾丸和附睾系数、精子数量与活力显著升高，睾丸病理损伤改善；SOD、GSH-Px、CAT活性及血清T水平显著上调，MDA、NO、NOS及FSH水平降低；Cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。中、高剂量组在改善精子活力、GSH-Px、MDA、FSH、NO及Cleaved Caspase-3等方面效果更显著（P<0.05）。结论：三仙开心散对D-gal诱导的生殖衰老大鼠睾丸功能具有保护作用，中、高剂量疗效更显著，其机制可能与减轻氧化应激、调节激素水平、抑制细胞凋亡有关。
Abstract
Objective To investigate the protective effects and mechanisms of Sanxian Kexin Powder on testicular function in rats with reproductive senescence induced by D-galactose (D-gal). Methods Fifty SD male rats were randomly divided into a control group, a model group, and low-, medium-, and high-dose Sanxian Kexin powder groups (10 rats per group). Except for the control group, D-gal (300 mg/kg) was administered via intraperitoneal injection to establish a senescence model. Starting from the fifth week of modeling, the low-, medium-, and high-dose Sanxian Kexin powder groups were orally administered 0.8, 1.6, and 3.2 g/kg of the powder, respectively, for 4 weeks. After 8 weeks, the organ coefficients of the testis and epididymis, sperm count, and motility were measured in each group. Histopathological examination of the testis was performed via HE staining. ELISA was used to detect oxidative stress indicators [superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT), malondialdehyde (MDA)) and serum hormones and inflammatory factors (testosterone (T), follicle-stimulating hormone (FSH), nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS)]. Western blot was employed to measure the protein expression of cleaved caspase-3 (Cleaved Caspase-3) in the testis. Results Compared with the model group, the low-, medium-, and high-dose Sanxian Kexin powder groups showed significant increases in testis and epididymis coefficients, sperm count, and motility, along with improved testicular pathological damage. SOD, GSH-Px, and CAT activities and serum T levels were significantly upregulated, while MDA, NO, NOS, and FSH levels decreased. Cleaved Caspase-3 protein expression was reduced, with statistically significant differences (P<0.05). The medium- and high-dose groups exhibited more pronounced effects in improving sperm motility, GSH-Px, MDA, FSH, NO, and Cleaved Caspase-3 (P<0.05). Conclusion Sanxian Kexin powder has protective effects on testicular function in rats with reproductive senescence induced by D-gal, with more significant efficacy at medium and high doses. The mechanisms may involve alleviating oxidative stress, regulating hormone levels, and inhibiting apoptosis.
Keywords
男性生殖衰老表现为生殖系统结构和功能的渐进性衰退，可因氧化应激、线粒体功能障碍等因素加速[1]。中医药在延缓生殖衰老方面积累了丰富的理论和实践经验，肾中精气的盛衰与男性生殖功能密切相关，延缓生殖衰老应从补益肾精肾气以实天癸入手，同时兼顾五脏六腑之精的培育[2]。三仙开心散为经典方剂的创新合方，由人参、仙灵脾、茯苓、远志、石菖蒲、仙茅、仙鹤草七味药组成，药简效宏，共奏补脾益肾，交通心肾之功。本研究采用D-半乳糖（D-gal）诱导的亚急性衰老大鼠模型，D-gal可诱导代谢紊乱和衰老表现，其建立的亚急性衰老模型具有成本低、操作简便、结果稳定等优点，被广泛应用于衰老相关研究[3]。对于中药复方干预男性生殖衰老的研究，尤其是其相关分子生物学机制，仍存在一定空白。对此，本研究在探究改善精子质量及睾丸功能的同时，更着力于探讨其可能的分子生物学机制，为中药复方治疗男性生殖衰老提供更充足的证据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
SPF级SD健康雄性大鼠50只，体质量300~350 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SYXK（津）2019-0002。饲养于SPF级环境中，本研究通过中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会审批（批号：IRM-DWLL-2023288）。
1.1.2 药物及主要试剂
三仙开心散颗粒剂（生药组成：仙茅10 g，仙灵脾10 g，仙鹤草10 g，人参10 g，茯苓20 g，石菖蒲10 g，远志10 g；等效颗粒剂依据药物浓缩比换算为：仙茅2 g，仙灵脾1.54 g，仙鹤草1.67 g，人参4 g，茯苓1.6 g，石菖蒲2.1 g，远志4.3 g）购自天津市南开区三潭医院；D-gal（纯度＞99%）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；大鼠一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、睾酮（testosterone，T）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）的ELISA试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司；活化型半胱天冬酶3（Cleaved Caspase-3）抗体、α微管蛋白（α-Tubulin）单克隆抗体购自美国CST公司。
1.1.3 主要仪器
ML-608JZ Ⅲ精子分析仪（南宁松景天伦生物科技有限公司），FC5515R小型台式高速冷冻离心机（美国OHAUS公司），聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳系统（美国Bio-rad公司），Tanon 5200化学发光成像系统（上海天能生命科学有限公司），Nikon Eclipse E100正置荧光显微镜（日本Nikon尼康株式会社），Spark多功能微孔板检测仪（瑞士Tecan公司），TEC5组织包埋机（日本樱花检验仪器株式会社），RM2235组织切片机（德国Leica公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型制备与分组给药
50 只大鼠适应性饲养3 d后，随机分为对照组、模型组及低、中、高剂量组，每组10只。模型组及低、中、高剂量组连续腹腔注射300 mg/kg D-gal，每天1次，连续8周，对照组注射等量生理盐水[4]。自造模第5周起，低、中、高剂量组分别灌胃三仙开心散药液0.8、1.6、3.2 g/kg，每天1次，持续4周，对照组与模型组给予等量生理盐水灌胃。
1.2.2 睾丸、附睾脏器系数
实验结束后称各组大鼠体质量，处死大鼠后取双侧睾丸和附睾称重，计算脏器系数=脏器质量/体质量×100%。
1.2.3 HE染色
大鼠睾丸组织经固定、包埋、切片（5 μm）后行HE染色，镜下观察病理学变化。
1.2.4 精子数量和活力分析
取大鼠附睾尾置于37℃生理盐水中剪开，挤出精液，置于37℃培养箱中孵育10 min后，使用精子分析仪检测精子数量与活力。
1.2.5 氧化应激及血清指标检测
制备10%睾丸匀浆，离心取上清，按试剂盒说明检测SOD、GSH-Px、CAT、MDA水平。腹主动脉采血，离心后取血清，ELISA法检测NO、NOS、T、FSH水平。
1.2.6 Western blot法检测睾丸Cleaved Caspase-3表达水平
提取睾丸组织总蛋白，BCA法定量。蛋白经SDS-PAGE分离、转膜、封闭后，加入Cleaved Caspase-3（1∶1000）及α-Tubulin（1∶5000）一抗，4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜后加入二抗，室温孵育1 h，化学发光成像。
1.3 统计学分析
数据以均数±标准差表示，使用GraphPad Prism 8软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey's检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三仙开心散对大鼠睾丸及附睾的影响
与对照组相比，模型组睾丸和附睾系数降低（P＜0.001）。与模型组相比，三仙开心散低、中、高剂量组睾丸及附睾系数均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），低、中、高剂量组间睾丸及附睾系数差异无统计学意义（P>0.05），见图1。
图1各组睾丸系数与附睾系数比较
2.2 三仙开心散对大鼠精子数量和活力的影响
与对照组相比，模型组大鼠精子数量和活力均降低（P＜0.001）。与模型组相比，三仙开心散低、中、高剂量组精子数量和精子活力均升高，且高剂量组精子活力较低剂量组升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。
图2各组精子数量与精子活力比较
2.3 三仙开心散对大鼠睾丸组织病理学的影响
HE染色显示，对照组大鼠睾丸组织形态正常，生精小管结构规整，各层生精细胞排列有序，管腔内可见成熟精子。模型组大鼠睾丸组织生精小管萎缩、生精细胞排列紊乱与脱落，管腔内精子严重减少。经三仙开心散干预后，各剂量组大鼠睾丸组织的病理损伤均得到缓解，生精小管结构和生精细胞层次均有明显恢复，见图3。
图3各组大鼠睾丸组织病理学检测结果
2.4 三仙开心散对大鼠氧化应激指标的影响
与对照组相比，模型组SOD、CAT、GSH-Px浓度下降，MDA浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组相比，高剂量组SOD浓度升高；中、高剂量组CAT、GSH-Px浓度均升高，MDA浓度降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。高剂量组GSH-Px活性高于低、中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。
图4各组SOD、CAT、GSH-Px、MDA浓度比较
2.5 三仙开心散对大鼠血清指标的影响
与对照组相比，模型组大鼠血清T浓度下降，FSH、NO、NOS浓度上升，差异有统计学意义（P＜0.001）。与模型组相比，中、高剂量组T浓度升高，FSH、NO浓度下降，剂量组NOS浓度下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。高剂量组FSH、NO水平低于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。
图5各组T浓度、FSH浓度、NO浓度、NOS浓度
2.6 三仙开心散对大鼠睾丸组织Cleaved Caspase-3表达的影响
与对照组相比，模型组睾丸组织中Cleaved Caspase-3蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.001）；与模型组相比，三仙开心散低、中、高剂量组表达降低，并呈现剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.001），见图6。
图6各组Cleaved Caspase-3蛋白水平比较
3 讨论
中医学认为，生殖衰老与心、脾、肾功能失调密切相关，核心病机为脾肾两虚、心肾不交。三仙开心散由人参、仙灵脾、茯苓、远志、石菖蒲、仙茅、仙鹤草七味药组成，其中远志、人参、茯苓、石菖蒲源于开心散，具益智安神之功，再取仙鹤草补虚强壮之力、仙灵脾补肾润燥之功，仙茅大补命门三焦之火，诸药合用，共奏补脾益肾，交通心肾之功，延缓生殖衰老。现代研究表明，开心散具有抗氧化、抗衰老等作用[5-6]；仙灵脾可保护睾丸生殖细胞[7-8]；仙茅能抗氧化、抗炎并调节性激素[9-11]；仙鹤草具有抗氧化、抗炎的作用[12-14]。三仙开心散可通过调控AGE-RAGE信号通路，以及糖尿病相关互补因子和PI3K/Akt信号通路，达到干预氧化应激和炎症反应的作用，从而预防和治疗生殖衰老[15]。
氧化应激是影响男性生殖功能的重要因素，可由生理（如年龄、体质量等）、病理（如代谢综合征、感染等）[16]、心理（如焦虑、压力等）、生活方式（如吸烟、饮酒、滥用药物等）及环境（如毒素、重金属、辐射等）等多种因素诱导[17-19]。过量的活性氧（ROS）可损伤细胞成分，当睾丸内源性抗氧化防御不足时，超生理浓度的ROS将影响精子活力、获能、顶体反应和卵母细胞穿透[20]。睾丸支持细胞中的抗氧化酶对减轻生殖细胞氧化损伤至关重要[21-22]。SOD、CAT、GSH-Px是关键的抗氧化酶，其活性可反映组织抗氧化能力，对正常精子发生与功能至关重要[23-25]。MDA作为脂质过氧化终产物，是评估氧化损伤与衰老的重要指标之一，自然衰老大鼠睾丸组织中抗氧化因子活力显著下降，MDA水平显著增加[26]。本研究表明，三仙开心散能显著提升睾丸组织中SOD、CAT、GSH-Px活性，并降低MDA水平，提示其可通过增强抗氧化防御系统减轻睾丸氧化损伤。
NO参与类固醇生成、精子功能及血睾屏障调节。病理状态下，NOS活性过度增强，导致NO过度合成，进而作为促炎介质加剧氧化应激并诱导生殖细胞凋亡，损害男性生殖功能[27]，本研究显示三仙开心散能下调NO与NOS水平，提示其可能通过抑制炎症反应途径发挥睾丸保护作用。
T和FSH对维持正常精子发生至关重要。T是促进精子发生与维持男性特征的关键雄激素[28]，并通过信号传导维持睾丸支持细胞与精子细胞的粘附，防止精子细胞从上皮细胞脱落[29-30]。FSH通过作用于睾丸支持细胞，与T协同调控生殖细胞的发育与成熟。二者失衡将导致生育力下降。本研究发现三仙开心散能显著提升血清T水平，降低FSH水平，改善激素内环境，促进生精功能。
细胞凋亡是维持正常生精功能的重要过程，但过度凋亡会导致生精障碍[31-32]，不育男性睾丸中细胞凋亡增加[33]。Caspase家族，尤其是其终末执行者Cleaved Caspase-3，在介导生精细胞凋亡级联反应及血睾屏障完整性中起核心作用[34-36]。本研究显示，三仙开心散可抑制Cleaved Caspase-3蛋白的表达，说明其可通过抑制过度细胞凋亡来保护睾丸结构与功能的完整性。本研究设置低、中、高三个剂量组，结果提示三仙开心散的保护作用呈现出剂量依赖性，但不同指标的量效关系模式存在差异，在未来的临床应用中，应考虑采用中等及以上剂量，以确保其对氧化应激与激素水平的调控作用得到充分发挥。
综上所述，本研究证实三仙开心散能改善D-gal诱导的生殖衰老大鼠的生精功能，具体表现为提高睾丸和附睾系数、增加精子数量与活力、改善睾丸组织病理损伤。其作用机制可能与减轻氧化应激、调控激素水平及抑制细胞凋亡有关。