摘要
目的：探讨蛇床子素（OST）对兔糖尿病足溃疡（DFU）的治疗作用，并探讨其通过干预AMP激活蛋白激酶（AMPK）/沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）通路的机制。方法：将72只新西兰兔采用随机数字表法以12只/组随机分为假手术组、DFU组、低剂量OST（L-OST）、高剂量OST（H-OST）组、二甲双胍组、H-OST+AMPK抑制剂Compound C（H-OST+Compound C）组。除假手术组外，其余各组均建立DFU模型。采用血糖仪检测空腹血糖（FBG）水平；采用图像分析软件计算创面愈合率；采用ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）水平；采用HE染色观察创面肉芽组织形态；采用免疫组化检测CD31蛋白表达；采用Western blot检测AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达。结果：DFU组的成纤维细胞和新生血管相对匮乏，炎性细胞浸润明显；与假手术组比较，DFU组FBG、TNF-α、IL-6、MDA水平升高，SOD、IGF-1、VEGF水平及CD31阳性表达率、p-AMPK/AMPK、SIRT1蛋白表达降低（P＜0.05）；与DFU组比较，L-OST组、H-OST组及二甲双胍组上述指标均有所改善；而H-OST+Compound C组与H-OST组结果相反。结论：OST对兔DFU具有治疗作用，其作用机制可能与激活AMPK/SIRT1通路有关。
关键词
Abstract
Objective To observe the therapeutic effect of osthole (OST) on diabetic foot ulcer (DFU) in rabbits and to explore its mechanism by intervening in the AMP-activated protein kinase (AMPK)/silent information regulator 1(SIRT1) pathway. Methods Seventy-two New Zealand rabbits were randomly divided into 6 groups (n=12 per group) using a random number table: sham operation group, DFU group, low dose OST(L-OST) group, high dose OST (H-OST) group, metformin group, and H-OST+AMPK inhibitor Compound C (H-OST+Compound C) group. Except for the sham operation group, DFU models were established in all other groups. Blood glucose meter was used to detect FBG. The software was used to analyze the wound healing rate. ELISA was used to detect the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF). HE staining was used to detect the wound granulation tissue morphology. Immunohistochemistry was used to detect the positive expression of CD31 protein. Moreover, Western blot was used to detect the expression of proteins related to the AMPK/SIRT1 pathway. Results In the DFU group, fibroblasts and neovascularization were relatively scarce, and inflammatory cell infiltration was significant. Compared with the sham operation group, the DFU group showed increased levels of FBG, TNF-α, IL-6, and MDA, as well as decreased levels of SOD, IGF-1, VEGF, positive expression rate of CD31, p-AMPK/AMPK, and SIRT1 (P<0.05). Compared with the DFU group, the L-OST, H-OST, and metformin groups exhibited improvements in the above indicators. In contrast, the H-OST+Compound C group showed opposite trends to those observed in the H-OST group. Conclusion OST exerts a significant therapeutic effect on DFU in rabbits, and its mechanism may involve the activation of the AMPK/SIRT1 pathway.
截止2019年，全球糖尿病（diabetes mellitus，DM）患病率为9.3%（约4.63亿）；预计2030年和2045年将分别升至10.2%和10.9%（分别约5.78亿和7亿）[1]。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是DM严重并发症，病变集中于足踝部以下，以局部感染、溃疡为主要表现，严重时可致足深部组织损伤[2]。约15%的DM患者会发生DFU，其中约84%最终需截肢[3]。DFU具有发作反复、创面难愈合的特点，探索有效的促愈合方法是临床亟待突破的难题[1]。西医治疗存在费用高、预后差、致残率高等问题[4]。中医药治疗DFU优势显著，活血化瘀是其核心治则。蛇床子素（osthole，OST）是中药蛇床子的主要活性成分，具有抗过敏、抗炎、保护骨关节等多重药理活性[5]，可调控Wnt/β-catenin信号通路加速骨质疏松性骨折愈合[6]，但其在DFU中的作用尚未明确。AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/沉默信息调节因子2相关酶1（silent information regulator 1，SIRT1）通路是参与炎症反应和能量代谢的关键通路，在DM的调控中具有重要意义[7]。激活AMPK/SIRT1通路可抑制DM心肌病小鼠心肌细胞凋亡及炎症反应[8]。但OST是否会通过调控AMPK/SIRT1通路影响DFU，目前少见文献报道。本研究旨在探究OST对兔DFU的影响，并验证其作用与AMPK/SIRT1通路的相关性。
1 材料与方法
1.1 实验动物
本研究经内蒙古包钢医院伦理委员会批准（批号：2025-MER-041）。5月龄的清洁级新西兰兔（2.0~3.0 kg）购自北京富龙腾飞实验动物研究院有限公司，许可证号：SCXK（京）2023-0009。
1.2 主要材料
OST（货号：YT63322；北京伊塔生物科技有限公司，质量分数≥98%）；二甲双胍（国药准字：H44024853，规格0.25 g/片；深圳中联制药有限公司）；Compound C（货号：171261-1MG；北京智杰方远科技有限公司）；肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、超氧化物歧化酶（SOD）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）ELISA检测试剂盒（货号分别为ZK-R6070、ZK-R6007、ZK-R6186、ZK-R6034、ZK-R5954，深圳子科生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）ELISA检测试剂盒（货号：ELR0355-96T；上海毕合生物化学技术有限公司）；p-AMPK、AMPK、SIRT1、GAPDH一抗和IgG二抗（货号分别为ab133448、ab131512、ab189494、ab22555、ab97080，英国Abcam公司）。
1.3 主要仪器设备
血糖仪（型号：GM500；北京怡成生物电子技术有限公司）；显微镜（型号：E200；上海尼康仪器有限公司）；凝胶成像系统（型号：Tanon 4600SF；上海天能科技有限公司）。
1.4 方法
1.4.1 DFU模型构建与分组处理
将72只新西兰兔用随机数字表法分为6组：假手术组、DFU组、低剂量OST（L-OST）组、高剂量OST（H-OST）组、二甲双胍组、H-OST+AMPK抑制剂Compound C（H-OST+Compound C）组，每组12只。药品配制：1）OST：采用二甲基亚砜溶解OST粉末，配制成母液（浓度为2 mg/mL），使用前以生理盐水稀释至所需浓度，确保终体系中二甲基亚砜浓度≤0.1%；2）Compound C：采用二甲基亚砜溶解Compound C粉末，配制成母液（浓度为0.5 mg/mL），临用前以生理盐水稀释至2 mg/kg所需浓度，二甲基亚砜终浓度≤0.1%。
除假手术组外，其余各组根据文献[9]采用埋植磁片循环压迫法诱导DFU兔模型：于兔单侧后足皮下埋圆形磁片后，行DM造模：适应性喂高脂高糖饲料1周后，按100 mg/kg耳缘静脉推注5%四氧嘧啶，3 d后空腹随机血糖连续3 d＞16.0 mmol/L或1次＞20.0 mmol/L为造模成功[10]，成功后早晚测空腹血糖（FBG），用甘舒霖N控制血糖＜8 mmol/L。再行DFU造模：磁片对应皮肤外置外源磁片，缺血2 h、复流30 min为1个循环，每天3个循环，连续5 d诱导溃疡。除假手术组进行上述操作但不植入圆形磁片，L-OST组、H-OST组腹腔分别注射4、8 mg/kg OST[11]；二甲双胍组灌胃40 mg/kg二甲双胍[12]；H-OST+Compound C组腹腔注射8 mg/kg OST和2 mg/kg Compound C[13]；假手术组、DFU组给予等量生理盐水（腹腔注射与灌胃），L-OST组、H-OST组灌胃等量生理盐水，二甲双胍组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续2周。
1.4.2 血糖仪检测FBG水平
在给药前后，分别采集兔耳缘静脉血1 mL，用血糖仪检测其FBG水平。
1.4.3 创面愈合率分析
对给药前后对兔足部伤口进行拍照，用Image J软件分析创面面积，计算创面愈合率。
1.4.4 ELISA检测TNF-α、IL-6、SOD、MDA、IGF-1、VEGF水平
上述操作结束后，麻醉兔，下腔静脉采血，离心弃沉淀，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、SOD、MDA、IGF-1、VEGF水平。
1.4.5 HE染色检测创面肉芽组织形态
采血后，取兔创面肉芽组织样本，分为两份，每份包含6只兔的肉芽组织样本，取其中一份的部分创面肉芽组织样本，4%多聚甲醛固定24 h，经梯度脱水、二甲苯透明和石蜡包埋，制备切片，经HE染色、透明及封片，在显微镜下观察创面肉芽组织样本形态。
1.4.6 免疫组化检测CD31蛋白阳性表达率
取另一份创面肉芽组织制备切片，切片经脱蜡、水化后，用柠檬酸钠进行抗原热修复，PBS冲洗，室温下用3% H2O2反应15 min，经15 min山羊血清封闭后，4℃下加鼠抗CD31过夜，接着进行二抗反应1 h，DAB显色，核用苏木精染，显微镜下观察并计算CD31阳性表达率。
1.4.7 Western blot检测AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达
取创面肉芽组织，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上充分匀浆。在4℃环境下，以12 000×g离心15 min后，收集上清，BCA法定量总蛋白，取30 μg样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，4℃下加一抗p-AMPK、AMPK、SIRT1、GAPDH过夜反应，洗涤，加二抗，室温反应1 h，ECL显影，使用Image J软件分析目的条带的灰度值。
1.5 统计学处理
用SPSS 25.0分析数据，数据以表示，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 OST对各组FBG水平的影响
给药前，DFU组、L-OST组、H-OST组、二甲双胍组、H-OST+Compound C组的FBG均高于假手术组（P＜0.05），DFU组、L-OST组、H-OST组、二甲双胍组、H-OST+Compound C组间FBG差异无统计学意义（P＞0.05）；给药后，DFU组FBG高于假手术组；L-OST组、H-OST组及二甲双胍组FBG均低于DFU组，H-OST组、二甲双胍组FBG均低于L-OST组，H-OST+Compound C组FBG高于H-OST组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
表1各组FBG水平及创面愈合率比较
注：a与假手术组相比，P＜0.05；b与DFU组相比，P＜0.05；c与L-OST组相比，P＜0.05；d与H-OST组相比，P＜0.05
2.2 OST对各组创面愈合率的影响
L-OST组、H-OST组及二甲双胍组的创面愈合率高于DFU组，H-OST组、二甲双胍组的创面愈合率高于L-OST组，H-OST+Compound C组的创面愈合率低于H-OST组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
2.3 OST对各组TNF-α、IL-6、SOD、MDA、IGF-1、VEGF水平的影响
与假手术组相比，DFU组TNF-α、IL-6、MDA显著升高，SOD、IGF-1、VEGF显著降低（P＜0.05）；与DFU组相比，L-OST组、H-OST组及二甲双胍组TNF-α、IL-6、MDA显著降低，SOD、IGF-1、VEGF显著升高（P＜0.05）；与H-OST组相比，H-OST+Compound C组TNF-α、IL-6、MDA显著升高，SOD、IGF-1、VEGF显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
表2各组TNF-α、IL-6、SOD、MDA、IGF-1、VEGF水平比较
注：a与假手术组相比，P＜0.05；b与DFU组相比，P＜0.05；c与L-OST组相比，P＜0.05；d与H-OST组相比，P＜0.05
2.4 OST对各组创面肉芽组织形态的影响
DFU组表现为成纤维细胞和新生血管相对较少，炎性细胞浸润明显；L-OST组、H-OST组及二甲双胍组创面肉芽组织形态较DFU组明显改善；而H-OST+Compound C组肉芽组织形态损伤较H-OST组加重，见图1。
图1各组创面肉芽组织形态（HE染色，×200）
2.5 OST对各组CD31阳性表达率的影响
DFU组CD31阳性表达率低于假手术组，L-OST组、H-OST组及二甲双胍组CD31阳性表达率高于DFU组，H-OST+Compound C组CD31阳性表达率低于H-OST组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2和表3。
图2各组CD31阳性表达（免疫组化，×200）
表3各组CD31阳性表达率比较
注：a与假手术组相比，P＜0.05；b与DFU组相比，P＜0.05；c与L-OST组相比，P＜0.05；d与H-OST组相比，P＜0.05
2.6 OST对各组AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达的影响
DFU组p-AMPK/AMPK、SIRT1低于假手术组，L-OST组、H-OST组、二甲双胍组p-AMPK/AMPK、SIRT高于DFU组，H-OST+Compound C组p-AMPK/AMPK、SIRT1低于H-OST组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3和表4。
图3Western blot检测图
表4各组AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达
注：a与假手术组相比，P＜0.05；b与DFU组相比，P＜0.05；c与L-OST组相比，P＜0.05；d与H-OST组相比，P＜0.05
3 讨论
对DM患者而言，DFU不仅是一种破坏性并发症，更是中晚期糖尿病患者发生感染和溃疡的主要原因[14]。溃疡愈合受多种因素影响，其中新生血管形成与炎症反应尤为关键[15]。临床上，部分DFU患者最终需接受截肢手术，严重损害患者的生活质量[16]。因此，探寻可用于治疗DFU的有效药物，对改善患者预后、提升生活质量至关重要。
作为中药蛇床子的核心活性成分，OST的生物学功能备受关注。Kordulewska等[17]发现OST在皮肤创面愈合中具有潜在促进作用，当成纤维细胞和人角质形成细胞受组胺刺激引发炎症时，OST可降低IL-1β、TNF-α水平，改善细胞屏障功能与迁移能力。高血糖环境会降低生长因子水平，升高促炎因子水平，抑制细胞增殖，共同延缓创面愈合[18]。机体代谢紊乱可诱发氧化应激，促进TNF-α、IL-6等促炎因子生成。TNF-α可调控多种生长因子的表达，抑制血管舒张，导致内皮功能紊乱；IL-6则扩大炎症反应，启动以TNF-α为主导的级联反应，趋化中性粒细胞与单核细胞向创面浸润，这些炎症细胞的消散速度缓慢，持续的炎症不仅加剧组织破坏，还延缓创面愈合[19]。氧化应激在DFU致病机制中占据关键地位，靶向抑制氧化应激可显著促进DFU愈合[20]。MDA是活性氧产生的一种活性醛衍生物；SOD则通过清除过量活性氧以保护细胞免受氧化损伤[21]。IGF-1是一种与胰岛素结构近似的多肽蛋白，可抑制糖原分解、增强葡萄糖摄取，发挥促生长、降血糖及调节代谢等作用[22]。VEGF通过特异性调控血管内皮细胞以促进创面愈合：与内皮细胞受体结合后可激活细胞，推动内皮细胞增殖、迁移及蛋白水解，促进新生血管形成；同时增强血管通透性，调节细胞外基质，利于肉芽及瘢痕组织形成[23]。CD31是血管内皮细胞表面的血小板内皮细胞黏附分子，其表达水平可反映血管生成状态[24]。本研究发现，DFU组存在成纤维细胞和新生血管相对匮乏的问题，炎性细胞浸润显著，FBG、TNF-α、IL-6、MD水平升高，SOD、IGF-1、VEGF、CD31阳性表达率降低，给予DFU兔不同剂量的OST干预，DFU兔病理状态得到改善，创面愈合率显著提高，溃疡损伤程度减轻。
AMPK是真核细胞中高度保守的AMP能量传感器，与SIRT1存在交互调控关系。Xue等[25]研究发现，罗汉果皂苷IIIE激活AMPK/SIRT1通路，缓解高糖诱导的足细胞氧化应激与炎症。另有研究指出，褪黑素激活AMPK/SIRT1/HIF-1α通路，可改善内皮细胞线粒体功能，并促进血管生成，有利于DM伤口愈合[26]。本研究中，DFU模型兔的p-AMPK/AMPK、SIRT1降低，OST处理后，上述指标升高，表明OST可激活AMPK/SIRT1通路。联合AMPK抑制剂Compound C处理后，OST的改善效应被显著逆转，具体表现为：创面肉芽组织损伤、FBG、TNF-α、IL-6、MDA水平升高，创面愈合率下降、SOD、IGF-1、VEGF、CD31阳性表达率以及p-AMPK/AMPK、SIRT1水平降低，提示OST可能通过激活AMPK/SIRT1通路，调控糖代谢、炎症反应、氧化应激以及组织修复相关分子表达，同时促进IGF-1介导的组织修复以及VEGF/CD31调控的新生血管生成，从而减轻创面肉芽组织损伤、提高创面愈合率，而Compound C可阻断该通路，证实AMPK/SIRT1通路是OST调控DFU病理进程的关键通路。
综上所述，OST对兔DFU的作用可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路实现。本研究为DFU治疗新药的寻找提供理论依据，但存在以下局限性：1）对肉芽组织形态的评估主要基于HE染色的定性观察，缺乏系统的半定量组织学评分；2）OST是否通过其他信号通路发挥作用尚需进一步研究。以上均为未来需要深入探讨的方向。