摘要
目的：探讨宣白承气汤干预缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）炎症相关途径减轻大鼠肺缺血再灌注损伤的机制初探。方法：选取40只健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、肺缺血再灌注损伤组（LIRI组）、宣肺组及宣白承气汤组，每组10只。通过测定肺组织湿干重比（W/D）评估其水肿程度；利用肺标本HE染色进行病理学观察，并行损伤程度评分；同时，利用蛋白质印迹（Western blot）法测肺组织HIF-1α蛋白表达及酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）含量。结果：与假手术组比较，LIRI组、宣肺组及宣白承气汤组的W/D比值均有升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而与LIRI组比较，宣肺组及宣白承气汤组在上述指标上的表现均有所下降，其中宣白承气汤组的数据表现更低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；HE染色镜下观察，LIRI组、宣肺组及宣白承气汤组肺组织均出现不同程度损伤，而与LIRI组比较，宣肺组及宣白承气汤组肺损伤评分有所降低，且宣白承气汤组肺损伤改善情况更为显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）；LIRI组、宣肺组及宣白承气汤组的HIF-1α、TNF-α及IL-1β的含量均有升高，宣肺组及宣白承气汤组在上述指标上的含量均有所下降，且宣白承气汤组的指标降低更为著，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：宣白承气汤可能通过调节HIF-1α的蛋白表达，抑制炎性因子水平，从而缓解大鼠肺缺血再灌注造成的损伤。
Abstract
Objective To investigate the effects of Xuanbai Chengqi decoction on lung ischemia-reperfusion injury in rats and analyze the mechanism of HIF-1α and inflammatory pathway in this process. Methods Forty healthy male SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham), lung ischemia-reperfusion injury group (LIRI), Xuanfei group, and Xuanbai Chengqi decoction group. The degree of edema was assessed by measuring the wet-to-dry weight ratio (W/D) of lung tissue; pathological observations were conducted using HE staining of lung specimens, and the degree of injury was scored; meanwhile, protein expression of HIF-1α in lung tissue was measured by Western blot, and the levels of serum TNF-α and IL-1β were detected by ELISA. Results Compared to the Sham group, the W/D ratio increased in the LIRI group, Xuanfei group, and Xuanbai Chengqi decoction group. However, compared to the LIRI group, the Xuanfei group and Xuanbai Chengqi decoction group showed decreased performance in the above indicators, with the Xuanbai Chengqi decoction group exhibiting lower data, and the differences were statistically significant (P<0.05). Under HE staining microscopy, varying degrees of damage were observed in the lung tissues of the LIRI group, Xuanfei group, and Xuanbai Chengqi decoction group. Compared to the LIRI group, the lung injury scores in the Xuanfei group and Xuanbai Chengqi decoction group decreased, with the Xuanbai Chengqi decoction group showing more significant improvement in lung injury, and the differences were statistically significant (P<0.05). The levels of HIF-1α, TNF-α, and IL-1β increased in the LIRI group, Xuanfei group, and Xuanbai Chengqi decoction group. However, compared to the LIRI group, the levels in the Xuanfei group and Xuanbai Chengqi decoction group decreased, with the Xuanbai Chengqi decoction group showing more significant reductions, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion Xuanbai Chengqi decoction may alleviate lung ischemia-reperfusion injury in rats by regulating the protein expression of HIF-1α and inhibiting inflammatory factor levels.
肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）是指肺组织在经历一段时间的血流中断（缺血）后，血流恢复（再灌注）过程中发生的组织损伤。常见于心肺复苏、创伤、肺动脉栓塞、心肺大手术、体外循环或继发于其他脏器的损伤，主要表现为肺水肿和急性呼吸窘迫综合征，可导致呼吸衰竭、多器官功能障碍甚至死亡，病死率极高[1]。因此如何有效地减轻肺缺血再灌注损伤的措施是当前研究的前沿热点。
缺氧和炎症反应在LIRI过程中起到重要作用，缺氧诱导因子-1α（hypoxia induce factor-1α，HIF-1α）是一种随细胞内氧浓度变化而调节基因表达的快速转录因子，可通过多种途径参与LIRI的发生发展，在LIRI过程中，氧化应激会促进HIF-1α的过度激活，其可与Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）等信号通路协同上调炎症因子水平，而促炎因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等更能进一步激活HIF-1α的转录活性，最终形成正反馈循环，放大炎症反应，从而引起肺组织损伤[2]。
宣白承气汤源自吴鞠通的《温病条辨》，是体现“肺与大肠相表里”理论的经典方，方中生石膏清泄肺热，苦杏仁宣肺止咳，瓜蒌皮润肺化痰，大黄荡涤肠胃，该方既可宣通肺气，又可承顺腑气，在治疗痰热壅肺型肺部急症中广泛应用。本课题组前期研究发现，宣白承气汤可有效减轻LIRI大鼠肺水肿程度及肺损伤指数，起到一定的肺保护作用[3]，但其具体作用机制尚未明确。本研究通过建立大鼠LIRI模型，探讨宣白承气汤对HIF-1α及相关炎症因子水平的影响，以期深入了解宣白承气汤治疗LIRI的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
40 只SPF级6～8周龄健康雄性SD大鼠购自北京唯尚立德生物科技有限公司，体质量280 g～320 g，动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0010。遵循国家《实验动物管理条例》进行管理与使用。采用随机数字表法将大鼠分成4组：假手术组、肺缺血再灌注损伤（LIRI）组、宣肺组及宣白承气汤组，每组10只。本研究经天津中医药大学第二附属医院伦理委员会批准（审批号：2021-020-01）。
1.1.2 主要药品、试剂及仪器
宣肺组为：生石膏15 g，苦杏仁6 g，瓜蒌皮4.5 g；宣白承气汤组为：生石膏15 g，苦杏仁6 g，瓜蒌皮4.5 g，大黄9 g[中药饮片均购自津药达仁堂（天津）中药饮片有限公司，由天津中医药大学附属第二医院提供]。TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒及HIF-1α一抗（英国Abcam公司）。V-1000小动物呼吸机（上海玉研科学仪器有限公司），Fresco17型低温冷冻离心机（美国热电ThermoFisher公司）；垂直蛋白电泳仪（美国伯乐Bio-Rad公司）。
1.2 方法
1.2.1 模型制备与各组处理方法
制备大鼠LIRI模型：将2%戊巴比妥钠溶液经腹腔注射麻醉大鼠，经气管插管，接动物呼吸机，大鼠左侧第5肋间进胸，暴露左肺门，在肺充气状态下用无损伤动脉钳夹闭左侧肺门，阻断60 min后松开动脉夹，再灌注2 h。假手术组为开胸后仅游离左肺门，不予夹闭左肺门的缺血再灌注处理，机械通气3 h。宣肺组及宣白承气汤组实验动物单位体质量生药量依据人单位体质量生药量换算求得，即等效剂量折合成生药量为4.25、5.75 g/kg[4]，将上述药材浸泡30 min，武火煮沸后文火煎煮2次，每次30 min，合并滤液，置于旋转蒸发仪中浓缩至含生药量为1 g/mL，4℃保存备用。宣肺组及宣白承气汤组于缺血再灌注动物模型建立前灌胃药液3 d，2次/d，假手术组和模型组分别灌胃等体积的生理盐水。手术结束后处死大鼠，收集标本。
1.2.2 肺组织湿干重比（W/D）
切取约1/3的左肺上叶组织，用滤纸吸去表面水分，称量这部分肺组织的重量，标记为湿重（W），然后将此肺组织置于70℃的干燥箱中72 h，干燥后重新称重，标记为干重（D），计算二者比值（W/D）。
1.2.3 肺组织病理学观察
取大鼠左上肺组织，以10%中性福尔马林液固定，常规石蜡包埋，切片后苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察组织的病理学改变。肺损伤程度评分标准[5]：镜下观察肺泡充血或出血、间质水肿、中性粒细胞浸润、肺泡壁增厚/透明膜形成共4项指标。无损伤为0分，病变范围≤25％为1分，26％~50％为2分，51％~75％为3分，>75％为4分，以上各项分数之和为肺损伤总评分。
1.2.4 Western blot法检测肺组织HIF-1α蛋白表达水平
取部分左上肺组织，裂解后离心取匀浆上清液，使用BCA试剂盒检测蛋白质浓度。通过SDS-PAGE凝胶电泳依据分子量分离蛋白质，湿转法转膜，5%脱脂乳室温封闭1 h。稀释后的HIF-1α一抗（1∶1000）、GAPDH一抗（1∶5000）4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后酶标记的二抗（1∶5000）室温孵育1 h，再次清洗，ECL化学发光底物反应后显色。使用Image J软件进行灰度分析。
1.2.5 ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β含量
大鼠腹主动脉采血，离心后取血清样本，实验步骤按试剂盒的要求进行，在酶标仪上测定TNF-α、IL-1β的吸光度值。
1.3 统计学分析
实验结果数据采用SPSS 25.0软件进行统计学处理，计量资料均以表示，多组间比较选择单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠肺组织湿干重比
与假手术组比较，LIRI组、宣肺组及宣白承气汤组大鼠肺组织的W/D均升高，差异有统计学意义（P<0.05），宣肺组及宣白承气汤组的W/D较LIRI组均降低，且宣白承气汤组低于宣肺组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1各组大鼠肺组织W/D及肺损伤评分比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与LIRI组比较，P<0.05；c与宣肺组比较，P<0.05
2.2 大鼠肺组织病理学变化及损伤评分
光镜下观察HE染色切片，可见假手术组肺组织整体结构基本正常，肺泡结构清晰，组织内未见明显的炎症细胞浸润；LIRI组肺组织整体结构异常，肺泡壁增厚，间质水肿，肺泡腔内可见红细胞渗出伴炎细胞浸润；宣肺组和宣白承气汤组肺损伤程度较LIRI组改善，且宣白承气汤组肺组织的损伤情况减轻更明显，见图1。与假手术组相比，LIRI组、宣肺组及宣白承气汤组肺损伤评分均升高，差异均有统计学意义（P<0.05），与LIRI组比较，宣肺组及宣白承气汤组肺损伤评分均降低，且宣白承气汤组降低更明显，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
图1各组大鼠肺组织病理染色结果（HE染色，×200）
2.3 大鼠肺组织HIF-1α蛋白表达水平
与假手术组比较，LIRI组、宣肺组及宣白承气汤组大鼠肺组织中HIF-1α蛋白表达水平均上升，差异均有统计学意义（P<0.05）；与LIRI组比较，宣肺组及宣白承气汤组大鼠肺组织中HIF-1α蛋白表达水平均降低，且宣白承气汤组降低更明显，差异均有统计学意义（P<0.05），见图2、3。
图2各组大鼠肺组织HIF-1α蛋白的表达
图3各组大鼠肺组织HIF-1α蛋白表达水平比较
2.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比较
与假手术组比较，LIRI组、宣肺组及宣白承气汤组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均上升，差异均有统计学意义（P<0.05）；与LIRI组比较，宣肺组及宣白承气汤组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均降低，且宣白承气汤组降低更明显，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与LIRI组比较，P<0.05；c与宣肺组比较，P<0.05
3 讨论
LIRI的病理机制复杂，这一过程不仅包括缺血本身导致的细胞代谢障碍，还包括再灌注时氧自由基的产生、炎症反应的激活及细胞死亡等多重机制[6]。目前在治疗LIRI方面，肺保护性通气、液体疗法和神经肌肉阻滞剂等措施在临床治疗中取得了一定疗效，但病死率仍较高，其难点在于其对肺的损伤较重，且发展至多器官功能障碍的速度较快，目前尚缺少有效的治疗标准和措施。
HIF-1α在LIRI中是关键的“决策分子”，其作用具有双重性[7]，在缺血再灌注早期，HIF-1α的适度激活是机体重要的内源性保护机制，HIF-1α可通过增加红细胞及血管生成、促进能量代谢适应、抗氧化应激等缓解组织缺血缺氧损伤。然而随着HIF-1α的进一步激活，其可与多种炎症信号通路共同作用从而引起肺组织损伤，包括HIF-1α的积累通过TLR4信号通路介导，导致促炎因子（如TNF-α、IL-1β）释放，形成正反馈环路，进一步放大炎症反应[2]；缺血再灌注后HIF-1α的泛素化修饰水平降低，抑制了HIF-1α的降解，进而促进NLRP3炎症小体依赖的焦亡途径，导致IL-6和IL-1β等炎症因子释放，进而加重肺损伤[8]。因而，阻断HIF-1α介导的炎症相关途径，成为减轻LIRI的可能方法。
宣白承气汤方剂用药精炼，仅由生石膏、苦杏仁、瓜蒌皮和大黄这四味药组成，生石膏成分中含有大量的钙和多种微量元素，可清泄肺热；苦杏仁主要的药理成分为苦杏仁苷，可调节巨噬细胞的活性，降低中性粒细胞浸润，具有重要的免疫调节作用，可宣肺止咳；瓜蒌皮含有木犀草素、α-菠菜甾醇及多种氨基酸成分，具有重要的抗炎、抗氧化作用，可润肺化痰；大黄主要成分为大黄素，可降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18水平，起到抗炎作用，可荡涤肠胃、清热泻火[9]。该方在治疗重症肺炎、脓毒症性肺损伤以及机械通气性肺损伤等肺部急重症方面应用广泛。有研究表明宣白承气汤可通过抑制mTOR蛋白磷酸化来增强细胞自噬，从而抑制HIF-1α表达，降低TNF-α及IL-6水平，最终达到减轻脂多糖诱导的肺微血管内皮细胞炎症损伤的目的[10]。
本研究通过建立大鼠LIRI模型，发现与假手术比较，LIRI组W/D及肺损伤评分明显升高，表明肺缺血再灌注后大鼠肺水肿及组织损伤明显，而宣肺组及宣白承气汤组可降低W/D及肺损伤评分，缓解肺损伤；进一步研究发现，与假手术比较，LIRI组肺组织HIF-1α蛋白表达及炎症因子TNF-α、IL-1β水平均明显升高，宣肺组及宣白承气汤组以上指标均有所降低，且宣白承气汤组降低更为明显，原因可能是宣白承气汤在宣肺的同时，其中药物大黄可承顺腑气，通利大肠，达到“肺肠同治”。有研究表明，大黄的有效成分如大黄素及大黄酚，可通过抑制mTOR/HIF-1α/VEGF通路相关的炎症反应来减轻肺损伤[11-12]。
综上所述，宣白承气汤可能通过调节HIF-1α的蛋白表达来抑制炎性因子水平，从而缓解大鼠肺缺血再灌注造成的损伤。但本研究在样本量、分组、实验手段的全面性等方面仍存在一定局限性，后续将进一步完善实验，继续从肺与大肠相表里的中医核心理论出发，研究LIRI对肠道的影响及宣白承气汤在其中的作用。
