摘要
目的：探讨术野喷涂载有甲氨蝶呤的肿瘤细胞来源的囊泡（MTX-TMPs）在消化系统恶性肿瘤根治术中的安全性，探索其对术区局部残留病灶的清除作用及降低局部复发风险的潜在价值。方法：回顾性研究我院2022年4月—2023年3月术野喷涂MTX-TMPs的28例患者（载药囊泡组）与2021年4月—2022年3月未喷涂MTX-TMPs的46例患者（对照组）的临床资料。比较两组患者的一般情况、肝肾功能、术后并发症及生存时间等指标。结果：载药囊泡组术前、术后直接胆红素、谷丙转氨酶水平均低于对照组，术后血红蛋白水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。两组肾功能比较差异无统计学意义（P>0.05）。两组术中出血量、手术时间、术后并发症发生率及术后住院时间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。生存分析显示，载药囊泡组中位总生存时间及无复发生存时间均显著高于对照组（P<0.05）。进一步采用多因素Cox比例风险回归模型校正TNM分期后，组别对总生存时间（HR=0.383，95%CI 0.127~1.159，P=0.09）及无复发生存时间（HR=0.445，95%CI 0.153~1.297，P=0.138）均无独立预后影响，提示两组生存差异可能受基线特征不均衡影响。结论：载药囊泡在术区局部应用表现出良好的安全性，未对患者肝肾功能产生不良影响，亦未增加术中出血量、手术时间及术后并发症发生率。该治疗显示出一定的潜在疗效，对降低术区局部复发风险具有潜在价值。
Abstract
Objective To investigate the safety of intraoperative topical spraying of methotrexate-loaded tumor cell-derived microparticles (MTX-TMPs) in radical surgery for digestive system malignancies and to explore their potential value in clearing residual local lesions and reducing the risk of local recurrence. Methods A retrospective study was conducted using clinical and follow-up data from patients who received intraoperative topical spraying of MTX-TMPs between April 2022 and March 2023（MTX-TMPs group, n=28）, and those who did not receive MTX-TMPs between April 2021 and March 2022（control group, n=46）. General conditions, liver and kidney function, postoperative complications, and survival outcomes were compared between the two groups. Results Preoperative and postoperative levels of direct bilirubin and alanine aminotransferase were significantly lower in the MTX-TMPs group than in the control group (P<0.05), while postoperative hemoglobin level was higher in the MTX-TMPs group (P<0.05). No statistically significant differences were observed in renal function between the two groups (P>0.05). Intraoperative blood loss, operative time, postoperative complication rate, and postoperative hospital stay were comparable between the two groups (P>0.05). Survival analysis showed that the median overall survival and recurrence-free survival were significantly longer in the MTX-TMPs group than in the control group (P<0.05). However, after adjusting for TNM stage using multivariate Cox proportional hazards regression model, the group variable was not an independent prognostic factor for overall survival (HR=0.383, 95%CI 0.127–1.159, P=0.09) or recurrence-free survival (HR=0.445, 95%CI 0.153–1.297, P=0.138), suggesting that the survival differences might be influenced by baseline imbalances. Conclusion Topical application of MTX-TMPs in the surgical field demonstrates favorable safety, with no adverse effects on liver or kidney function, and no increase in intraoperative blood loss, operative time, or postoperative complications. The treatment also shows potential efficacy in reducing the risk of local recurrence.
目前，我国恶性肿瘤的发病率及死亡人数持续上升，肿瘤仍是我国的重大公共卫生问题。依据2022年中国恶性肿瘤流行统计结果，消化系统恶性肿瘤的发病率和死亡率位居前列[1]。文献报道，手术可能会促进残留肿瘤细胞生长，这些细胞最终会发展成复发肿瘤[2-3]。此外，手术还会加速局部和远端肿瘤的生长及转移。这归因于手术所致术后肿瘤微环境的显著扰动，其逐渐转化为有利于肿瘤复发的生态位[3]。因此，改变手术后局部肿瘤的微环境，及时清除术区残留的肿瘤细胞或微小病灶，是降低消化系统恶性肿瘤局部复发风险的主要研究方向。
肿瘤细胞来源的囊泡作为一种高效的药物靶向递送系统，可将包裹的化疗药物精准递送到肿瘤细胞核内，逆转肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞的耐药性，强效杀伤肿瘤[4]。同时载药囊泡依靠囊泡表面携带的生物信息物质激活抗肿瘤免疫反应，调控肿瘤免疫微环境，实现肿瘤杀伤、免疫激活的双重抗肿瘤效应[5]。基于载药囊泡的高效低毒及双重抗肿瘤优势，结合术中喷涂的即时性及精准性优势，本课题组提出载药囊泡术野局部喷涂治疗可有效清除从原发病灶脱落的术区肿瘤细胞或不可检测出的微小病灶，改变术后的局部肿瘤微环境。本研究从临床层面探讨其在消化系统恶性肿瘤根治术中局部应用的安全性及降低术区局部复发风险的价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性选取2022年4月—2023年3月在我院应用载药囊泡术中喷涂治疗消化系统恶性肿瘤的患者为载药囊泡组，选取2021年4月—2022年3月在我院仅行根治性手术治疗的恶性肿瘤患者为对照组。纳入标准：1）病理学检查证实为消化系统恶性肿瘤，癌种涵盖肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺癌、壶腹癌及十二指肠乳头癌；2）均行根治性切除手术；3）临床资料、随访资料保存完整。排除合并其他系统恶性肿瘤者。载药囊泡组28例患者中男性17例，女性11例；平均年龄（63.1±1.6）岁，TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期15例，Ⅲ期4例，Ⅳ期1例；对照组46例患者中男性27例，女性19例；平均年龄（64.4±1.4）岁，TNM分期Ⅰ期10例，Ⅱ期24例，Ⅲ期10例，Ⅳ期2例。本研究经我院医学伦理委员会批准（批号：NKYY_YXKT_IRB_2025_021_01），并按照赫尔辛基宣言进行。
1.2 载药囊泡的来源及制备方法
取2.5×108个肺癌细胞，接种于含20 mL培养基的培养体系中，经中波紫外线（辐照剂量300 J/m²）照射1 h。随后向培养基中加入2 mg/mL甲氨蝶呤。培养16 h后，收集细胞培养上清液，先以300×g离心10 min，再以14 000×g离心2 min，以去除细胞碎片。将所得上清液以14 000×g离心60 min，收集沉淀物即载药肿瘤细胞膜泡。将沉淀物洗涤后，重悬于生理盐水中。最后将重悬液置于4℃环境下孵育15 min，随后以800×g离心10 min，弃去沉淀物。整个制备流程严格遵循药品生产质量管理规范（GMP）标准。载药囊泡购自湖北盛齐安生物科技股份有限公司。
1.3 术中喷涂方式
1）按照既定术式进行标准手术操作切除肿瘤病变。2）吻合并重建离断的血管、腔道。3）载药囊泡液在使用前常温放置30 min恢复至室温，使用50 mL注射器抽取25/50 mL载药囊泡液[含载药囊泡2.5/5单位，1个单位为2×108个囊泡，甲氨蝶呤含量为（150±50）μg，囊泡平均粒径范围为150~300 nm]，均匀喷涂于手术区域，静置20~30 min。
1.4 观察指标
收集两组患者的术前指标，如性别、年龄、血常规指标[白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）]、肝功能指标[白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、谷丙转氨酶（ALT）]及肾功能指标血肌酐（Cr），术中指标（术中出血量、手术时间）和术后指标（血常规、肝肾功能、并发症、术后住院时间）。观察两组患者的并发症（胰瘘、胆瘘、出血、感染、胃排空延迟），并发症诊断标准依据《胰腺术后外科常见并发症防治指南（2022）》[6]。
1.5 随访
通过门诊或电话进行随访，局部复发的诊断以影像学检查结果为主，同时参考肿瘤标志物和临床表现。载药囊泡组随访截止时间为2024年10月31日或患者死亡日期，对照组随访截止时间为2023年10月31日或患者死亡日期。总生存时间（overal survival，OS）定义为确诊疾病至随访截止日期或死亡日期。无复发生存时间（recurrence free survival，RFS）定义为根治性手术至肿瘤复发、患者死亡或随访截止日期，以先发生者为准。
1.6 统计学处理
使用SPSS 26.0软件处理数据。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验。非正态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。为校正潜在的混杂因素（如TNM分期）对生存结局的影响，采用多因素Cox比例风险回归模型进行分析，计算风险比（HR）及其95%置信区间。Kaplan-Meier法绘制生存曲线和无复发生存曲线，采用Log-rankχ2检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组实验室结果比较
载药囊泡组术前和术后DBIL及ALT水平均较对照组低，术后Hb水平较对照组高，差异有统计学意义（P<0.05）。两组肾功能比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1两组实验室结果比较
注：a与对照组比较，P<0.05
2.2 两组围手术期情况比较
两组在手术时间、术中出血量、术后并发症及术后住院时间方面比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。
表2两组围手术期情况比较
2.3 随访及预后情况比较
对照组中位随访时间为19.2个月，中位OS和RFS分别为19.2个月及12.7个月；载药囊泡组中位随访时间为23个月，中位OS和RFS分别为23个月及20.2个月。对照组随访期间死亡29例（63.0%），死亡原因均为肿瘤复发转移；载药囊泡组随访期间死亡10例（35.7%），其中有1例死于脑干梗死，9例死于肿瘤复发转移，见表3，在控制TNM分期后，组别对OS（HR=0.383，95%CI 0.127~1.159，P=0.09）及RFS（HR=0.445，95%CI 0.153~1.297，P=0.138）均无独立影响。值得注意的是，多因素校正后两组生存差异消失（图1），提示单因素分析中观察到的OS和RFS差异，可能主要受两组基线特征不均衡影响，而非治疗措施的独立效应。
表3多因素Cox比例风险回归分析结果
图1两组患者的Kaplan-Meier生存曲线
3 讨论
消化系统恶性肿瘤早期常无症状，大多数在晚期才被诊断，可手术切除的患者比例不高，即使手术后仍然面临较高的复发率，患者预后较差。我国肝癌患者术后3年、5年总体生存率分别为28.8%和19.6%[7]，术后5年复发率却超过70%[8]。50%的胆道恶性肿瘤患者在确诊时已为进展期，生存期＜1年。仅有10%左右的患者就诊时具有手术机会，术后1年内的转移复发率高达67%，5年生存率为5%~15%[9]。胰腺癌根治性切除术后接近80%的患者会出现复发，且大多数患者在术后2年内出现复发[10]。临床中针对肿瘤术后残留病灶的干预策略多样，但均存在一定局限性：术后静脉给药为全身化疗模式，化疗药物全身分布导致肿瘤局部药物浓度低，杀伤残留病灶效果有限，且易引发骨髓抑制、胃肠道反应等全身毒副作用；传统局部灌注多为术后置管实施，药物易随引流液流失，对术野即刻残留的肿瘤细胞干预存在时间滞后性，无法实现术后即时清除；腹腔热灌注化疗（hyperthermic intraperitoneal chemotherapy，HIPEC）虽适用于腹腔广泛种植转移的患者，但其操作复杂、对设备和术者要求高，且温热化疗对腹腔正常组织黏膜存在一定损伤风险[11]，不适用于常规根治术的术区局部精准辅助治疗。而术中术野喷涂给药可在肿瘤根治性切除、血管及腔道重建完成的第一时间将药物直接、均匀覆盖于术野所有潜在残留区域，实现药物局部精准高浓度递送。
载药囊泡能够抑制肿瘤干细胞多药耐药蛋白（p-glycoprotein，P-gp），减少肿瘤干细胞对化疗药物的外排，提高肿瘤细胞内的药物浓度，从而强化对肿瘤细胞的杀伤效果[4]。载药囊泡还能够调节多种免疫细胞，重塑免疫微环境，从而增强抗肿瘤活性，进一步清除肿瘤细胞，有效预防肿瘤复发。研究发现载药囊泡可以高效地动员内源性中性粒细胞，并引起内在的抗肿瘤活性。被吸引的中性粒细胞通过在TME中释放活性氧（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）来发挥肿瘤细胞的杀伤作用[12]。载药囊泡还可通过激活巨噬细胞的抗肿瘤活性而作为一种新的免疫治疗方法[13]。在实体瘤模型（B16黑色素瘤）中，实验证明了M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）通过MTX-TMPs治疗转化为M1型以及MTX-TMPs和PD-1联合应用对B16黑色素瘤的功效[14]。这一机制为术野喷涂MTX-TMPs重塑术区免疫微环境、清除局部残留病灶提供了实验依据。
载药囊泡的有效性和安全性已在临床得到多方面证实。在一项临床研究中，3例患有恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）的终末期肺癌患者接受胸腔注射载有顺铂的囊泡，另外3例患者接受顺铂治疗。经过7 d的载药囊泡治疗后，恶性液体中95%以上的肿瘤细胞消失，胸膜腔内的液体迅速减少[4]。最近的一项随机、双盲、安慰剂对照研究结果表明胸腔内灌注MTX-TMPs联合培美曲塞-顺铂化疗对晚期非小细胞肺癌 （ non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的MPE安全有效[15]。在恶性梗阻性黄疸的临床试验中，通过经皮经肝胆管穿刺引流（percutaneous transhepatic biliary drainage，PTBD）向胆管腔内注射MTX-TMPs，对胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）患者进行7 d治疗，观察到粪便颜色变黄[16]，证实了载药囊泡在局部管腔应用的安全性和有效性。
本研究结果显示，两组患者在性别、年龄等基线特征方面无统计学差异，组间具有可比性。安全性评估发现，载药囊泡组术前、术后直接胆红素、谷丙转氨酶水平均显著低于对照组，术后血红蛋白水平显著高于对照组，提示载药囊泡不仅未加重肝功能损伤，反而呈现一定的肝脏保护作用，这可能与局部给药避免化疗药物经肝脏代谢、减轻全身肝肾毒性负荷密切相关；两组肾功能指标无明显差异，进一步证实该治疗对肾功能无不良影响。术中及术后指标对比显示，两组手术时间、术中出血量、术后住院时间及总体并发症发生率均无统计学差异，仅载药囊泡组胰瘘发生率略高，考虑与术式差异有关，且多属于生化漏，未引发严重临床后果。上述结果充分表明，MTX TMPs术中应用安全性良好。生存分析显示，载药囊泡组中位总生存时间和无复发生存时间均优于对照组。经多因素Cox回归校正TNM分期后，差异虽未达统计学意义，但仍呈现明确的生存获益趋势，可能原因包括：1）术中局部高浓度甲氨蝶呤精准清除术区残留肿瘤细胞，从源头减少局部复发；2）载药囊泡重塑术区免疫微环境、激活抗肿瘤免疫，抑制肿瘤进展；3）其低毒性保护患者肝肾功能和营养状态，提升后续辅助治疗耐受性，延长患者生存期。
本研究在消化系统肿瘤领域探索术中喷涂MTX-TMPs评估其临床价值，初步证实其安全性良好且可能降低术后局部复发风险。但本研究仍存在局限性：1）为单中心回顾性历史对照设计，难以完全消除选择偏倚；2）样本量有限且纳入多种消化系统肿瘤，未进行癌种亚组分析；3）随访时间较短，长期疗效不明确；4）缺乏术区组织及免疫微环境相关机制验证。未来需开展针对单一癌种的大样本、多中心的前瞻性随机对照研究，并结合基础研究深入阐明其作用机制，为临床推广提供高级别证据。