摘要
目的：探讨铜离子电化学疗法（ECTCI）在中医枯痔钉理论基础上对混合痔患者痔区血管结构及细胞凋亡通路的影响，揭示其治疗机制。方法：选取2022年7月—2023年2月中国中医科学院西苑医院肛肠科收治的混合痔患者40例，采用随机数字表法分为对照组、观察1组、观察2组、观察3组，每组各10例。观察1组治疗280 s，观察2组治疗560 s，观察3组治疗840 s。对照组不予ECTCI治疗。采用HE染色观察血管形态变化，免疫组化检测血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1），即CD31及血管内皮生长因子（VEGF）表达，采用逆转录PCR（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）法检测凋亡相关蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）的mRNA和蛋白表达水平。结果：ECTCI治疗组呈现剂量依赖性的血管结构破坏，表现为微血管密度降低、血管壁断裂及纤维素样坏死。各组间VEGF表达无显著差异。凋亡蛋白检测结果显示，Caspase-3表达随治疗剂量增加而上调，而Bcl-2表达随治疗剂量增加而下调，提示线粒体凋亡通路被激活。结论：ECTCI治疗混合痔的机制是其通过直接破坏痔区血管内皮结构并激活Caspase-3介导的细胞凋亡通路，促进病理血管萎缩与闭塞。
关键词
Abstract
Objective To investigate the effects of electro-chemical therapy by cupric ion (ECTCI), based on the theory of necrotizing hemorrhoid ligation in Traditional Chinese Medicine, on the vascular structure and apoptotic pathways in the hemorrhoidal tissues of patients with mixed hemorrhoids, and to elucidate its therapeutic mechanism. Methods Forty patients with mixed hemorrhoids were selected and randomly assigned to a control group and three ECTCI treatment groups with different treatment durations (280 s, 560 s, 840 s). Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe morphological changes in blood vessels. Immunohistochemistry was performed to detect the expression of CD31 and VEGF. RT-PCR and Western blot were employed to analyze the mRNA and protein expression levels of the apoptosis-related proteins Caspase-3 and Bcl-2. Results The ECTCI treatment groups exhibited dose-dependent destruction of vascular structures, manifested as reduced microvessel density, ruptured vessel walls, and fibrinoid necrosis. No significant difference in VEGF expression was observed among the groups. Apoptosis-related analyses revealed that Caspase-3 expression was up-regulated with increasing treatment dose, while Bcl-2 expression was down-regulated, suggesting activation of the mitochondrial apoptotic pathway. Conclusion ECTCI promotes the atrophy and occlusion of pathological vessels by directly damaging the vascular endothelial structure in hemorrhoidal tissues and activating the Caspase-3-mediated apoptotic pathway, which represents a key mechanism in its treatment of mixed hemorrhoids.
Keywords
痔是临床最常见的肛肠疾病，我国流行病学调查显示，痔占所有肛肠疾病的98.09%[1]。现代研究认为痔的核心病理改变是肛垫内血管丛的病理扩张与微血管异常增生[2-3]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等促血管生成因子在痔组织中表达升高，进一步证实了血管生成在痔发病中的关键作用[4-5]。铜离子电化学疗法（electro-chemical therapy by cupric ion，ECTCI）是基于中医枯痔钉原理发展而来的微创治疗技术，临床研究显示其对痔出血和脱出具有显著疗效[6]，且大样本研究证实了其安全性和有效性[7]。然而，ECTCI对痔区血管的具体作用机制尚不清楚。因此，本研究从组织形态和分子水平探讨ECTCI对痔区血管结构及细胞凋亡通路的影响，旨在阐明其治疗机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2022年7月—2023年2月中国中医科学院西苑医院肛肠科收治的混合痔患者40例。采用随机数字表法分为对照组、观察1组、观察2组、观察3组，每组各10例。本研究方案通过本院伦理委员会批准（审批号：2022XLA067-2）。所有患者均签署知情同意书。
1.2 诊断标准
参考《痔中西医结合诊疗指南（2025版）》[8]诊断，通过超声等手段判定Ⅲ、Ⅳ度内痔的血管形态学特征[9]。内痔：1）主要表现为无痛性间歇性便血，可伴随肛门异物感或痔脱出；ⅠⅠ度：便血，无痔脱出；Ⅱ度：便血，便时痔脱出，便后自行还纳；Ⅲ度：偶有便血，便时或久站、负重时痔脱出，需手还纳；Ⅳ度：偶有便血，痔持续脱出或还纳后易脱出。2）直肠指检及肛门镜检查可见齿状线上方的静脉丛扩张或痔核；3）排除其他肛门直肠疾病。外痔：1）肛缘肿物、疼痛或瘙痒；2）肛门视诊可见皮下隆起；3）排除肛周脓肿、肛乳头瘤等。混合痔：1）兼具内痔和外痔的临床表现；2）肛门镜检查可见齿状线上下均有痔核；3）排除直肠脱垂、肛周肿物等。
1.3 纳入标准
1）年龄18～75岁；2）符合混合痔的诊断标准，且内痔属Ⅲ、Ⅳ度脱出；3）自然状态下有部分内痔组织脱出肛门外；4）意识清楚，能配合治疗；5）合并的全身性疾病处于平稳期；6）无严重传染性疾病；7）停止参加其他痔相关的临床试验1个月以上者。
1.4 排除标准
1）痔嵌顿或混合痔嵌顿；2）单纯内痔患者；3）合并严重血液系统疾病、严重脏器功能不全或严重糖尿病的患者；4）妊娠及哺乳期妇女；5）有肠道器质性梗阻病变；6）资料不全影响结果或安全性判断，或已接受其他有关治疗可能影响本研究的效应指标观测。
1.5 研究方法
1.5.1 ECTCI治疗
使用铜离子电化学治疗仪（北京跃达康科技有限公司，型号：CHAT-5302/MP），电极采用纯铜制成，直径0.7 mm，电极间距10 mm。治疗时电极针刺入内痔区黏膜下，观察1组治疗280 s，观察2组治疗560 s，观察3组治疗840 s。对照组不予ECTCI治疗。治疗参数由仪器自动控制，具体操作参照文献[6]的方法。
1.5.2 样品采集及保存
所有患者均在治疗后即刻于治疗区域切取痔组织，取材方法：在自然状态下脱出肛门外的内痔肿大隆起区进行ECTCI治疗，于治疗区域中心切取标本（图1）。对照组不治疗，于相同部位切取相应组织。标本大小约0.5 cm×0.5 cm，分为两部分：一半用10%福尔马林固定，用于HE染色和免疫组化；另一半液氮速冻后于-80℃保存，用于RT-PCR和免疫印迹（Western blot）检测。
图1ECTCI治疗区域中心取材方法
1.5.3 仪器和试剂
NanoDrop2000微量分光光度计和实时荧光定量PCR仪（美国赛默飞公司）；垂直电泳系统及半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）；化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）。RNA提取试剂TRIzol（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒（日本Takara公司）；BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；血小板内皮细胞黏附分子-1（platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）抗体，即CD31抗体、VEGF抗体（上海艾博抗有限公司）；半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗体（美国CST公司）。
1.5.4 RT-PCR和Western blot检测痔组织Capase-3和Bcl-2的mRNA和蛋白表达
提取痔组织样本总RNA后进行质量检测，采用紫外分光光度法测定RNA浓度与纯度，合格的RNA通过变性琼脂糖凝胶电泳验证完整性。使用反转录试剂盒进行cDNA反转录。RT-PCR反应体系：2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，补水至18 μL，加cDNA模板2 μL，引物序列见表1。每个样本设3个复孔，采用2-ΔΔCt法分析。Western blot按常规方法操作。
表1各引物名称、序列及产物大小
1.6 统计学分析
采用SPSS 26.0软件分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病理形态学观察
对照组黏膜下血管结构紊乱，可见大量管径不一的扩张血管，管壁厚薄不均，弹力纤维层模糊或消失。观察1组的组织间质内可见局灶性红细胞外溢，血管壁整体连续性尚存。观察2组、观察3组的血管密度降低，镜下可见多处血管壁断裂、结构崩解，伴弥漫性红细胞外溢，部分残留血管壁出现黏液样变性及水肿，严重区域可见纤维素样坏死伴急性炎细胞浸润（图2）。
图2各组血管的病理组织形态（HE染色）
2.2 免疫组织化学检测
2.2.1 CD31和VEGF表达
CD31特异性表达于血管内皮细胞膜。免疫组化染色显示，CD31定位于内皮细胞膜/胞浆，阳性信号呈棕黄色。与对照组相比，铜离子治疗组微血管密度显著降低，阳性信号的内皮连续性中断（图3）。VEGF蛋白主要表达于血管内皮细胞质。尽管CD31标记的血管密度随ECTCI治疗而降低，但留存血管内皮细胞中VEGF的表达强度在各组间未见明显差异（图4）。
图3各组CD31的表达（免疫组化染色，×200）
图4各组VEGF表达（免疫组化染色，×200）
2.2.2 Bcl-2和Caspase-3的表达
Bcl-2为抗凋亡蛋白。免疫组化染色显示，各实验组血管内皮细胞核中均未检测到Bcl-2的明确阳性表达（图5）。活化的Caspase-3阳性信号主要定位于细胞核。对照组与小剂量治疗组（观察1组）中Caspase-3仅微弱表达，中、大剂量治疗组（观察2组、观察3组）中其核阳性表达显著增强（图6）。
图5各组Bcl-2表达（免疫组化染色，×200）
图6各组Caspase-3表达（免疫组化染色，×200）
2.3 RT-PCR和Western blot检测结果
电泳结果显示，各样本28S和18S核糖体RNA条带清晰完整，28S条带亮度约为18S的2倍，未见明显DNA污染及RNA降解（图7）。
图7电泳结果图
2.4 各组Capase-3和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平比较
与对照组相比，各观察组Caspase-3与Bcl-2在mRNA及蛋白表达水平上均呈显著变化。Caspase-3 mRNA及蛋白表达随治疗时间延长呈阶梯式升高，Bcl-2表达随治疗时间延长呈阶梯式下降，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2各组Capase-3和Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平比较
注：a与对照组比较，P <0.05；b与观察1组比较，P<0.05；c与观察2组比较，P<0.05; 因RNA质量不合格，观察 2组剔除2例，观察3组剔除 1例
3 讨论
近年来，痔的血管靶向治疗策略不断丰富，除传统手术外，直肠动脉栓塞[10-11]、中医硬化注射[12-13]等技术也逐渐应用于临床，基因组学研究亦为痔的血管源性病因提供了新证据[14]。ECTCI作为中医外治法的创新发展，在保留肛垫功能的同时精准作用于病理血管，具有独特优势。研究表明，ECTCI治疗混合痔疗效确切，术后恢复良好[15-16]。本研究通过组织病理学、免疫组化等方法，系统观察了不同时长ECTCI治疗对混合痔患者痔区血管的影响。结果显示，ECTCI通过直接破坏血管结构并激活线粒体凋亡通路，促使血管萎缩与闭塞，为该疗法的临床推广提供了机制支撑。尽管研究限定于痔区病理血管，但其揭示的“铜离子电化学诱导血管内皮凋亡”机制，为其他领域的血管靶向治疗提供了新思路。如在体表血管瘤、动静脉畸形，以及部分肿瘤（低位直肠癌、前列腺癌、肝癌等）的血管栓塞治疗中，ECTCI或可作为微创替代或辅助方案。其优势在于利用电化学定位释放活性离子，实现对富血管区域的靶向干预，同时最大程度保留周围正常组织功能。这预示着ECTCI从一个治疗痔病的中医特色技术，随着研究的深入可能会发展成一种普适性的血管介入技术。
传统中医理论将枯痔钉的疗效归因于“异物刺激、炎性坏死、引流收敛”[17-18]。本研究从细胞程序性死亡的角度，揭示了ECTCI的作用机制，即铜离子在电化学场作用下诱导血管内皮细胞发生精准、可控的凋亡，是痔核萎缩的核心机制之一。研究结果显示，随着ECTCI治疗时间延长，痔区血管数量减少，血管壁结构破坏加重，CD31表达降低，提示ECTCI可有效破坏痔区血管内皮结构。同时，VEGF表达在各组间无显著差异，表明其作用机制不同于某些通过调节VEGF促进血管修复的中医外治法[18-20]，而是直接作用于已形成的病理性血管，诱导其退化。本研究结果表明，ECTCI可剂量依赖性地上调促凋亡蛋白Caspase-3的表达，下调Bcl-2的表达，提示其通过激活线粒体凋亡途径诱导血管内皮细胞程序性死亡。Lei等[21]在肿瘤研究中报道，金属离子可通过诱导线粒体途径凋亡参与血管退化，本研究结果与之吻合，为ECTCI促进痔血管萎缩提供了分子依据。
本研究也存在一定局限性，样本量相对有限且为单中心研究。本研究确认了凋亡通路的下游执行者，但对于上游信号转导途径，如活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆发、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK）或磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路尚未阐明。研究为静态的“终点”观察，缺乏对治疗过程中血管变化与凋亡发生进行实时、动态监测。未来研究可结合更完善的围手术期管理评估体系[22]，并关注ECTCI是否可能引发如尿潴留等常见术后并发症[23]，以全面评估其安全性。此外，对于治疗后组织的长期修复与重塑情况，以及是否可能发生血管再通，目前数据尚不能回答。未来可通过建立混合痔患者的组织标本库与临床数据库，开展多中心合作，扩大验证队列并启动人脐静脉内皮细胞等体外模型，精准研究铜离子导入后的早期信号事件。可将其与内镜下套扎、吻合器手术等主流微创技术进行对比，并基于盆底整体理论和更精细的评估分类法筛选最佳适应人群。