摘要
目的：探讨补中益气汤调控肠道黏蛋白-胆汁酸-菌群代谢防治肠道炎癌转化的机制。方法：选取Wistar大鼠，构建结肠炎癌转化模型，进行动物实验和靶向代谢物检测。采用“solvent-shift”法和细胞共培养模型，设计过饱和稳定性和转运实验。采用PCR、ELISA和HPLC检测相关指标。结果：与正常组相比，模型组大鼠一般状态恶化，死亡率、成瘤率、炎性因子或黏蛋白表达显著升高，而补中益气汤组上述指标均显著改善（P<0.05）。模型组代谢轮廓紊乱，补中益气汤组可部分恢复。筛选出4个共有差异代谢物和5条代谢路径。关键代谢路径为胆汁酸生物合成和维生素K代谢。黏蛋白显著增加空腹状态模拟肠液中胆固醇和初级胆汁酸的激增后时间（Tss）及曲线下面积（AUC）（P<0.05），且黏液分泌细胞单层对其流出增量（FE）显著增强（P<0.05）。结论：在炎性肠病状态下，炎性因子诱导的黏蛋白2（MUC2）高表达促进胆固醇吸收并维持初级胆汁酸过饱和，进而提升其菌群代谢转化为次级胆汁酸水平，通过影响菌群功能及短链脂肪酸代谢促进炎癌转化。补中益气汤抑制肠道黏蛋白-胆汁酸-菌群代谢，防治肠道炎癌转化。
Abstract
Objective Investigate the mechanism of Buzhong Yiqi decoction in preventing intestinal inflammation-cancer transformation by regulating the gut mucin-bile acid-microbiota metabolism. Methods A colitis-associated cancer transformation model was established to conduct animal experiments and targeted metabolite analyses. The "solvent-shift" method and a co-culture cell model were utilized to design supersaturation stability and cellular transport assays. PCR, ELISA, and HPLC were applied to detect relevant biomarkers. Results Compared with the normal group, the model group showed deteriorated general status, with significantly increased mortality, tumor incidence, inflammatory factors, and mucin expression, whereas Buzhong Yiqi decoction administration significantly improved these indicators (P<0.05). The metabolic profile was disturbed in the model group and partially restored by Buzhong Yiqi decoction. Four intersection differential metabolites and five metabolic pathways were identified. Key pathways included bile acid biosynthesis and vitamin K metabolism. Mucin significantly increased the Tss or AUC of cholesterol and primary bile acids in FaSSIF (P<0.05), and the FE across mucus-secreting cell monolayers was significantly enhanced (P<0.05). Conclusion Under inflammatory bowel disease conditions, inflammatory factor-induced MUC2 overexpression promotes cholesterol absorption and maintains primary bile acid supersaturation, thereby elevating their microbial conversion to secondary bile acids. This process may promote inflammation-cancer transformation by affecting microbiota function andshort-chain fatty acid metabolism. Buzhong Yiqi decoction inhibits the intestinal mucin-bile acid-microbiota metabolism, preventing and treating intestinal inflammation-cancer transformation.
慢性炎症是肿瘤发生的重要驱动因素之一[1-2]。炎症性肠病患者的结直肠癌风险显著升高，其炎癌转化过程缓慢且可预见，是防治研究的热点与难点之一[3]。补中益气汤源自《脾胃论》，现代临床研究证实其对炎症性肠病及结肠癌具有疗效[4-6]。研究表明，胆汁酸-肠道菌群轴功能失调可诱发肠道炎癌转化[7-9]。本课题组前期研究显示，在胆石症模型中，小肠黏蛋白的高表达可通过炎性因子信号通路延长胆固醇的过饱和效应并促进胆固醇吸收[10]。但肠道炎癌转化机制是否经由肠道黏蛋白-胆汁酸-菌群代谢轴介导，以及补中益气汤对其的干预作用，尚不清楚。本研究旨在阐明补中益气汤通过调控肠道黏蛋白-胆汁酸-菌群代谢轴防治肠道炎癌转化的机制，揭示其新的作用途径，为临床防治提供新的靶点与科学依据。
1 资料与方法
1.1 补中益气汤提取物制备
按《中华人民共和国药典》标准，取黄芪15 g，炙甘草5 g，人参10 g，当归10 g，陈皮6 g，升麻3 g，柴胡3 g，白术10 g，水煎两次，合并滤液，浓缩至0.2 g生药/mL，得补中益气汤提取物。
1.2 动物分组及模型制作
研究方案经本院实验动物伦理委员会批准（编号：NKYY-DWLL-2023-180）。40只健康雄性Wistar大鼠（210~230 g），采用随机数字表法分为4组：正常组、模型组、柳氮磺吡啶组（阳性药）、补中益气汤组，每组10只。参考经典偶氮甲烷（azomethane，AOM）/葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）法建立炎症性肠病大鼠模型[11]：第1天单次腹腔注射AOM（12.5 mg/kg）启动。随后给予无菌水至第7天，接着给予DSS至第14天，再给予无菌水至第28天。随后给予DSS至第33天。最后，给予无菌水至第49天。正常组和模型组每日灌胃无菌水；柳氮磺吡啶组和补中益气汤组于造模后一周开始灌胃给药，每天1次，持续7周。观察并记录动物一般状态及死亡情况。若出现体重下降、脱毛、精神萎靡、血便，则可认为出现肠道炎症反应。
1.3 标本收集与处理
末次给药后，收集大鼠粪便，置于-80℃保存。禁食12 h，处死大鼠，取肠组织，观察标本形态。部分标本沿肠带纵行剖开，以预冷无菌生理盐水冲洗干净，观察肠道内壁情况。粪便样本加入内标经甲醇提取，于4℃以15 000 r/min离心10 min，上清液氮吹复溶后，用高效液相色谱（HPLC）分析。
1.4 HPLC分析
色谱条件：采用HPLC C18色谱柱（4 μm，4.6 mm×250 mm），柱温为37℃，流速为1 mL/min，流动相A为30 mmol/L（NH4）2HPO4水溶液，流动相B为乙腈溶液。梯度洗脱：0~10 min，10%~30%流动相B；10~25 min，30%~50%流动相B；25~35 min，50%~85%流动相B；35~45 min，85%~10%流动相B。进样量为10 µL。检测波长为0~15 min：210 nm；15~45 min：205 nm。
1.5 靶向代谢物检测
数据导入MetaboAnalyst 6.0平台（http://www.metaboanalyst.ca）进行多元统计分析。利用火山图分析初步预测上调和下调的差异代谢物。利用主成分分析（PCA）对数据进行初步的模式识别，考察各组数据的分离情况。利用正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）去除与实验观察无关的随机信息，以第一主成分变量重要性值（VIP）＞1和t检验P＜0.05为标准，筛选差异代谢物。通过MetaboAnalyst 6.0平台中Enrichment Analysis模块对鉴定出的差异代谢物进行代谢通路的构建及分析，确定潜在代谢通路。
1.6 PCR分析
取大鼠肠组织，用试剂盒提取RNA，cDNA转录试剂盒反转录RNA。通过实时定量PCR测定特定肠道黏蛋白的Ct值，分析相对基因表达（RGE）的变化。
1.7 ELISA法测定肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1、IL-6及黏蛋白2（MUC2）水平
用相应试剂盒，将组织匀浆，加到含多个预混微珠的平板中，加入抗体检测混合物，读取相关数值与分析。
1.8 溶解度测定
称取过量的胆固醇和初级胆汁酸，分别加入含和不含黏蛋白的空腹状态模拟肠液（fasted state simulated intestinal fluid，FaSSIF），于37℃ 100 r/min的恒温摇床中溶解至过饱和，离心，HPLC测定其溶解度。
1.9 过饱和稳定性实验
将含和不含黏蛋白的FaSSIF置于37℃ 100 r/min的恒温摇床中，逐渐加入胆固醇或初级胆汁酸甲醇储备液至过饱和（solvent-shift法）。于规定时间点取样，立即以14 000 r/min离心10 min。取上清液，加入等体积的甲醇，以终止随后的沉淀。HPLC检测其浓度，计算其过饱和比（SSR）、激增后时间（Tss）及曲线下面积（AUC）。
1.10 转运实验
将Caco-2细胞或Caco-2:HT29-MTX-E12细胞接种于Transwell膜上，培养21 d。顶侧加入含胆固醇或初级胆汁酸过饱和溶液的HBSS缓冲液（pH值6.5），底侧为HBSS缓冲液（pH值7.4），置于恒温摇床（37℃，50 r/min），于规定时间点底侧取样，并补充等体积的新鲜缓冲液。HPLC检测其浓度，计算流出增量（FE）。
1.11 统计学分析
统计学分析使用SPSS 19.0软件。计量资料以 表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例表示，多组比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四组大鼠成瘤情况比较
模型组精神萎靡，反应迟钝，有脱毛现象，体重下降，大便质稀，血便，比正常组大鼠状态恶化，而柳氮磺吡啶组和补中益气汤组大鼠状态有所改善。试验期间，模型组大鼠死亡3只，柳氮磺吡啶组和补中益气汤组各死亡1只。解剖后，肉眼观察各组大鼠肠道成瘤情况:模型组的成瘤率高于正常组，补中益气汤组低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）； 模型组与柳氮磺吡啶组差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1四组大鼠的成瘤情况比较
注：a与正常组比较，P＜0.05；b与模型组比较，P＜0.05
2.2 补中益气汤对粪便代谢产物的影响
采用PCA与OPLS-DA对四组样本的代谢数据进行分析。结果显示，正常组与模型组样本点聚集成群，明显分离；与模型组相比，补中益气汤组与柳氮磺吡啶组的样本点聚集成群，明显分离。正常组与模型组模型参数为：R2X=0.258，R2Y=0.814，Q2=0.701；模型组与柳氮磺吡啶组模型参数为：R2X=0.225，R2Y=0.797，Q2=0.692；模型组与补中益气汤组模型参数为：R2X=0.191，R2Y=0.806，Q2=0.633，见图1、2。
图1四组代谢物PCA得分图
图2四组代谢物OPLS-DA得分图
基于OPLS-DA模型（VIP＞1）和t检验（P<0.05）及火山图分析，本研究筛选了组间差异代谢物，结果显示：模型组与正常组比较，上调差异代谢物为脱氧胆酸、石胆酸，下调差异代谢物为丁酸、丙酸、乙酸；柳氮磺吡啶组与模型组比较，上调差异代谢物为丁酸、丙酸、乙酸，下调差异代谢物为脱氧胆酸、石胆酸；补中益气汤组与模型组比较，上调差异代谢物为丁酸、丙酸，下调差异代谢物为脱氧胆酸、石胆酸，见图3、4。
图3四组代谢物OPLS-DA VIP图
图4四组代谢物火山图
通过MetaboAnalyst平台对上述差异代谢物进行通路富集分析，发现其富集于5条代谢通路。选取P值最小和富集率最大的代谢路径作为关键代谢路径，即胆汁酸生物合成和维生素K代谢，见图5。
图5代谢通路图
2.3 黏蛋白对胆固醇和初级胆汁酸过饱和稳定性和渗透性的影响
胆固醇在含与不含黏蛋白的FaSSIF中溶解度依次为（3.12±0.10）µg/mL、（3.36±0.20）µg/mL，差异无统计学意义。初级胆汁酸在含与不含黏蛋白的FaSSIF中溶解度依次为（1.74±0.24）µg/mL，（1.92±0.23）µg/mL，差异无统计学意义，见图6。对于胆固醇和初级胆汁酸，含0.2%黏蛋白的FaSSIF组的Tss和AUC均高于FaSSIF组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
图6含与不含黏蛋白的FaSSIF溶液中胆固醇（A）和初级胆汁酸（B）的SSR比较（n=3）
表2含与不含黏蛋白的FaSSIF溶液中胆固醇和初级胆汁酸的Tss和AUC比较（n=3）
注：a与FaSSIF组比较，P＜0.05
与Caco-2细胞单层比较，在40、60、80、100、120、140、160、180 min Caco-2：HT29-MTX-E12细胞单层胆固醇和初级胆汁酸的FE均升高（P<0.05），见图7。黏液分泌共培养细胞单层对胆固醇和初级胆汁酸的渗透增强作用强于无黏液分泌细胞单层。
图7不同时间点不同细胞单层胆固醇（A）或初级胆汁酸（B）的FE比较
2.4 补中益气汤对黏蛋白表达的影响
模型组MUC2的RGE高于正常组，柳氮磺吡啶组和补中益气汤组MUC2的RGE均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），见图8。模型组MUC2高于正常组，柳氮磺吡啶组和补中益气汤组MUC2均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），见图9。
图8四组MUC2的RGE水平比较
图9四组MUC2的蛋白水平比较
2.5 四组大鼠小肠组织的TNF-α、IL-1、IL-6水平比较
模型组大鼠小肠组织的TNF-α、IL-1、IL-6水平高于正常组，柳氮磺吡啶组和补中益气汤组的TNF-α、IL-1、IL-6水平低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05），见图10。
图10各组大鼠小肠组织中炎性因子水平比较
3 讨论
慢性炎症的持续存在可导致微环境中积累大量炎性因子及活性介质，引起DNA损伤、基因组不稳定及修复功能异常，促进癌基因激活与抑癌基因失活，最终驱动细胞恶性转化与肿瘤发生[12]。补中益气汤调和阴阳，益气健脾，升阳举陷，是治疗脾虚湿困证的代表方剂，现代用于炎癌转化的防治。本研究提出假说：在肠道炎症微环境下，炎性因子诱导黏蛋白表达上调，促进胆固醇吸收并维持初级胆汁酸的过饱和状态，进而提高经肠道肠道菌群代谢生成次级胆汁酸的水平。次级胆汁酸（1）直接诱发炎癌转化；（2）影响菌群功能，改变代谢谱，诱发炎癌转化。补中益气汤通过调控肠道黏蛋白-胆汁酸-肠道菌群代谢防治肠道炎癌转化。”拟采用动物模型与细胞模型相结合的方法，采用靶向代谢物检测及分子生物学技术，在微环境层面加以验证。
3.1 模型验证与补中益气汤治疗效果分析
本研究结果表明炎癌转化模型建立成功。炎症性肠病导致成瘤率显著升高，补中益气汤则显著降低了成瘤率，且其疗效优于柳氮磺吡啶。PCA和OPLS-DA分析表明模型建立过程中代谢轮廓发生改变，该模型具有较好的预测能力，模型复制成功，而补中益气汤和柳氮磺吡啶对炎癌转化均具有良好的治疗作用。
3.2 肠道菌群-胆汁酸调控机制
本研究筛选出脱氧胆酸、石胆酸、丁酸、丙酸4个关键差异代谢物。结果显示，促炎促癌的次级胆汁酸（脱氧胆酸、石胆酸）在模型组中显著上升，而保护肠屏障的短链脂肪酸（丁酸、丙酸）则显著下降；补中益气汤与柳氮磺吡啶均能显著逆转此异常模式。次级胆汁酸可通过激活NF-κB通路诱导DNA损伤，抑制FXR信号加剧炎症及诱导菌群失调等多种途径促进癌症发生[13-15]。与之相反，丁酸和丙酸则可通过抑制NF-κB，增强紧密连接蛋白表达及调节Treg细胞分化等方式发挥抗炎保护屏障作用[16-18]。这种“促炎-抗炎”代谢产物的双向调控可能构成补中益气汤作用机制的核心。通路分析进一步锁定胆汁酸生物合成和维生素K代谢为关键通路。通路分析显示丙酸与维生素K代谢通路具有统计学关联。需要指出的是，从代谢产物的生化属性分析，丙酸本身属于典型短链脂肪酸，其经典代谢途径归属为丙酸代谢。因此，该结果提示可能存在于代谢网络层面的间接关联，而非丙酸直接参与维生素K的生物合成或循环过程。补中益气汤“补脾益气”的中医治法理论与本研究发现的代谢调控网络存在深刻关联。从能量代谢角度看，短链脂肪酸是结肠上皮细胞的主要能量来源，其水平恢复可能改善“脾气虚”相关的能量代谢障碍[19]。此外，脱氧胆酸、石胆酸的下调与“清热解毒”功效的现代诠释相符合，因其可直接减少促炎促癌代谢物积累[20]。补中益气汤通过多通路协同作用，实现“扶正祛邪”的功效分析。
3.3 黏蛋白-胆汁酸调控机制
本研究表明，黏蛋白未改变胆固醇和初级胆汁酸的溶解度，但显著延长胆固醇和初级胆汁酸的过饱和状态，增强其在肠上皮模型的渗透。其机制在于黏蛋白作为高分子聚合物，可通过静电或疏水相互作用抑制其结晶[21]，其糖链修饰可调节局部微环境稳定胆汁酸微胶粒[22]。在炎性肠病中，炎症因子诱导MUC2高表达，一方面通过上述物理化学机制促进胆固醇吸收，维持初级胆汁酸过饱和，为菌群生成大量次级胆汁酸提供充裕底物；另一方面，过度分泌的黏液反而加剧代谢失衡[23-24]。补中益气汤与柳氮磺吡啶均可通过抑制炎性因子，下调MUC2表达，从而从源头上抑制这一恶性循环。
综上所述，在炎性肠病状态下，炎性因子诱导的MUC2高表达促进胆固醇吸收并维持初级胆汁酸过饱和，进而提升其菌群代谢转化为次级胆汁酸水平，通过影响菌群功能及短链脂肪酸代谢促进炎癌转化。补中益气汤抑制肠道黏蛋白-胆汁酸-菌群代谢，防治肠道炎癌转化。