摘要
目的：探讨骨痂胶囊（GJ）促进股骨粗隆间骨折和股骨缺损愈合的作用机制。方法：骨髓间充质干细胞（BMSCs）实验分组为：对照组、分化诱导组、10 µg/mL GJ组、50 µg/mL GJ组、100 µg/mL GJ组。体外诱导BMSCs向成骨细胞方向分化，向血管内皮细胞方向分化。CCK-8法测定BMSCs的细胞增殖能力。Western blot法测定细胞内成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和Runt相关转录因子2（RUNX2）的表达水平；以及血管内皮细胞分化标志物血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-2（Ang-2）的表达水平。将18只小鼠随机均分入在体对照组、模型组及GJ治疗组，每组6只。模型组及GJ治疗组建立骨质疏松合并股骨缺损小鼠模型。Micro-CT法测定小鼠右股骨近端缺损处骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）。HE染色、组织病理学分析骨痂胶囊对股骨缺损愈合的促进功效。免疫组织化学染色法测定小鼠右股骨近端缺损处VEGF的表达情况。结果：与分化诱导组相比，100 µg/mL GJ处理后BMSCs增殖能力增强（P<0.05）；ALP、OCN、RUNX2、VEGF和Ang-2表达水平升高（P<0.05）。与10 µg/mL GJ组和50 µg/mL GJ组相比，100 µg/mL GJ处理后ALP、OCN、RUNX2、VEGF和Ang-2表达水平升高（P<0.05）。与在体对照组相比，模型组软骨内骨化程度降低，少见胶原蛋白沉积和成骨细胞、软骨细胞分化；模型组BMD值、BV/TV值和IHC-VEGF相对着色光密度值降低（P<0.05）。与模型组相比，GJ治疗组软骨内骨化程度升高，存在大量胶原蛋白沉积和成骨细胞、软骨细胞分化；GJ治疗组BMD值、BV/TV值和IHC-VEGF相对着色光密度值升高（P<0.05）。结论：骨痂胶囊通过上调VEGF在股骨缺损处的表达促进血管发生和成骨分化，增强骨愈合能力。
Abstract
Objective To investigate the mechanisms of Gujia capsules (GJ) in promoting intertrochanteric fractures and femoral defects healing. Methods Cells were divided into Control group, Vehicle group, 10 µg/mL GJ group, 50 µg/mL GJ group, 100 µg/mL GJ group. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were induced to differentiate into osteoblasts and vascular endothelial cells in vitro. The proliferation ability of BMSCs were determined by CCK-8 assay. The expression levels of osteoblasts differentiation markers ALP, OCN and RUNX2; and the vascular endothelial cell differentiation markers VEGF and Ang-2 were determined by Western blot. An OVX-induced osteoporosis and femoral defects mouse model was established. 18 mice were randomly divided into three groups: In vivo control group, Model group and GJ treatment group, 6 mice in each. Bone mineral density(BMD) and bone volume fraction (BV/TV) in the right proximal femoral defect were measured by Micro-CT. HE staining and histopathology were used to analyze the effects of GJ on the healing of femoral defects. The expression of VEGF in the right proximal femoral defects were determined by immunohistochemical staining. Results Compared with Induction group, BMSCs proliferation ability was enhanced after 100 µg/mL GJ treatment (P<0.05). The relative expression levels of ALP, OCN, RUNX2, VEGF and Ang-2 were increased (P<0.05) in 100 µg/mL GJ treatment group cells. Compared with 10 µg/mL GJ group and 50 µg/mL GJ group, the relative expression levels of ALP, OCN, RUNX2, VEGF and Ang-2 were increased (P<0.05) in 100 µg/mL GJ treatment group cells. Compared with In vivo control group, in Model group the degree of intrachondral ossification was lower, and collagen deposition and differentiation of osteoblasts and chondrocytes were rare. BMD values, BV/TV values and IHC-VEGF relative optical densities were decreased (P<0.05). Compared with Model group, in GJ treatment group, the degree of intrachondral ossification was higher, with a large amount of collagen deposition and differentiation of osteoblasts and chondrocytes. BMD values, BV/TV values and IHC-VEGF relative optical densities were increased (P<0.05). Conclusion GJ could promote angiogenesis, osteogenic differentiation and enhance bone healing ability by up-regulating VEGF expression in femoral defects.
股骨粗隆间骨折十分常见，发病率约为髋部骨折的50%，股骨粗隆间骨折的主要治疗方式为挽救性骨融合术和全髋关节置换术[1]。然而，全髋关节置换术失败的翻修手术十分具有挑战性，容易引起骨折延迟愈合、骨不愈合、骨不连[2]。骨折的修复机制为一系列由软骨细胞、破骨细胞及成骨细胞等介导的软骨内成骨和膜内成骨过程[3]。这一过程受多种生长因子的协同作用，刺激间充质干细胞增殖和新生血管生成[4]。
骨痂胶囊是我院自主研发的中成药方剂，以扶阳固本、调补肝肾、益气养血、荣养筋骨为治则，主要成分为骨碎补、续断、杜仲、淫羊藿、三七、当归、红花、熟地黄、白及和冰片。本研究拟通过体外诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向成骨细胞和血管内皮细胞方向分化，探讨骨痂胶囊的剂量-依赖性增效效应，并建立骨质疏松合并股骨缺损小鼠模型，探讨骨痂胶囊促进股骨缺损愈合的作用及机制。
1 材料与方法
1.1 材料
骨痂胶囊购自我院药剂科。BMSCs购自武汉普诺赛生命科技有限公司。18只5~6周龄雌性C57BL/6小鼠购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2020-030。StemPro骨生成分化试剂盒、血管新生入门试剂盒、兔抗小鼠碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、HRP-标记IgG二抗购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖/毒性检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司。mCT80型Micro-CT分析仪购自瑞士斯坎科医疗股份有限公司。Multiskan Sky型全波长酶标仪购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 骨痂胶囊制备方法
骨痂胶囊是我院自主研发的中成药方剂，根据我院制剂室实验条件，进行如下制备操作：骨碎补、续断、杜仲、三七、当归、白及的药材饮片打粉；九蒸九制熟地黄切碎成小颗粒；淫羊藿和红花剪碎。采用水煎煮工艺，加入8倍水量（料液比为1∶8），煎煮提取3次×2 h，滤过、合并提取液。提取液减压浓缩至清膏状。然后加入终浓度为50%的乙醇，搅拌均匀，4℃静置沉淀18 h，沉淀并过滤去除清膏状浓缩液中的粗多糖、淀粉及蛋白质杂质等。取上清液，水浴蒸干至恒重。采用减压干燥法（≤60℃）获得浸膏液干粉；按照制剂量加入冰片粉，获得骨痂药粉；药粉装入胶囊，获得骨痂胶囊。每批次浸膏液干粉进行高效液相色谱分析，以续断的主要活性成分之一——川续断皂苷VI的提出率（需≥2.20%）和浸膏得率（需≥35%）为综合指标，对药粉进行批检验的质量评价。
1.2.2 细胞培养
将BMSCs培养于补充有10%胎牛血清和10 U/mL青-链霉素的F-12/MEM完全培养液中，置于37℃恒温、湿润、通入5% CO2的细胞孵育箱中维持培养。
1.2.3 诱导BMSCs向成骨方向和血管内皮细胞方向分化
向BMSCs完全培养液中添加终浓度为1×的StemPro骨生成分化试剂，连续诱导培养1周，期间每2天换液1次。结束后获取细胞培养物，检测下游指标。更换BMSCs的培养液为血管新生入门试剂盒中的培养基，连续诱导BMSCs 72 h，期间每隔1天换液1次。结束后收获细胞培养物，检测下游指标。
1.2.4 细胞实验分组和处理方式
将BMSCs细胞分为5组：1）对照组，BMSCs不做任何处理，置于F-12/MEM完全培养液中维持培养；2）分化诱导组，按照诱导方法，BMSCs分别向成骨细胞或血管内皮细胞方向分化诱导，并添加与后续分组等体积（10 µL）的PBS；3）10 µg/mL GJ组，4）50 µg/mL GJ组，5）100 µg/mL GJ组，在BMSCs分别诱导分化的同时，加入终浓度分别为10 µg/mL、50 µg/mL、100 µg/mL（溶于10 µL PBS）的骨痂胶囊药粉溶液，连同诱导分化培养基同时处理BMSCs，实验指标均重复测定6次。
1.2.5 CCK-8法测定细胞增殖能力
连续培养BMSCs 48 h后，在Multiskan Sky型全波长酶标仪上使用CCK-8试剂盒根据说明书测定细胞在450 nm下的光密度（OD）值，以此作为细胞增殖能力的指标。
1.2.6 Western blot检测蛋白表达水平
向6孔板细胞培养物中加入1 mL添加有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液裂解细胞，提取的总蛋白质进行常规SDS-PAGE，采用半干电转印法转膜至PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉封闭膜，向膜上滴加一抗工作液，4℃共同孵育过夜；向膜上滴加二抗工作液，室温共同孵育1 h。使用ECL化学发光底物对膜上的目的条带进行显影。抗体工作液稀释度如下：兔抗小鼠ALP（1∶1500）、OCN（1∶1500）、RUNX2（1∶1500）、VEGF（1∶1500）、Ang-2（1∶1500）、GAPDH（1∶2000）、HRP-标记山羊抗兔IgG二抗（1∶5000）。
1.2.7 实验动物
18只5~6周龄雌性C57BL/6小鼠，体质量22~25 g，饲养于恒温（23~25℃）、恒湿（55%~70%）、12 h/12 h光照/黑暗循环的标准SPF级鼠房。小鼠饲喂标准啮齿类动物饲料，自由进食和饮水。所有动物实验均经我院伦理委员会批准（批号：2023-09-22）。
1.2.8 动物实验分组和处理方式
18只小鼠随机均分为3组，每组6只小鼠。1）在体对照组，不做双侧卵巢摘除（bilateral ovariectomy，OVX）处理，仅建立右股骨近端皮质孔缺损。2）模型组，建立骨质疏松合并股骨缺损小鼠模型：小鼠适应性饲养1周后，接受OVX手术。3个月后，OVX小鼠进行显微计算机断层扫描（Micro-computed tomography，Micro-CT），与在体对照组相比，模型组小鼠股骨近端皮质骨骨密度（bone mineral density，BMD）值下降≥20%被认为骨质疏松症造模成功。随后，模型组小鼠和在体对照组小鼠实施全身性麻醉，纵向暴露右股骨近端内侧干骺端。使用标准钻头创建一个直径3 mm，深度4 mm的单侧皮质孔缺损[5]。3）骨痂胶囊（GJ）治疗组，取6只骨质疏松合并股骨缺损模型小鼠，每日早上9:00通过管饲法给予骨痂胶囊（50 mg/kg体质量）治疗，连续治疗2周后，颈椎脱臼法处死小鼠，采集其右股骨进行后续指标测定。小鼠骨痂胶囊给药剂量为50 mg/kg体质量的计算方法为=人用药剂量（4 mg/kg体重）×人体体表面积换算系数（37）÷小鼠体表面积换算系数（3）。
1.2.9 Micro-CT
取小鼠右股骨近端，进行Micro-CT分析，确认骨质疏松症模型造模成功，以及后续股骨缺损愈合情况。选择股骨小梁区域的第一个感兴趣区域（ROI）（长1500 mm，近端骨骺板下约300 mm），通过计算机分析程序重建，测定其BMD和骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）。
1.2.10 苏木精-伊红（HE）染色
使用EDTA脱钙液，4℃下对小鼠造模股骨进行连续脱钙处理2周。然后制备石蜡组织切片（厚度5 µm）。使用HE染色液套装对石蜡组织切片进行HE染色和组织病理学分析。
1.2.11 免疫组织化学（IHC）染色
小鼠股骨石蜡组织切片，使用免疫组织化学染色试剂进行IHC染色。抗体稀释度：抗小鼠VEGF单抗（1∶500）；HRP-标记山羊抗兔IgG二抗（1∶2000）。随机选择6个非重叠视野采集图像，采用Image J v1.47分析每各视野的IHC-VEGF着色光密度值并取其平均值。按照如下公式：其他分组小鼠股骨石蜡组织切片的IHC-VEGF相对着色光密度值=该分组各小鼠股骨石蜡组织切片的IHC-VEGF着色光密度值÷在体对照组小鼠股骨石蜡组织切片的IHC-VEGF着色光密度均值，进行归一化处理。
1.3 统计学处理
计量数据以均值±标准差表示。采用GraphPad Prism v8软件对数据进行统计学分析和处理。多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用Tukey’s检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 骨痂胶囊促进BMSCs增殖能力
CCK-8测定BMSCs增殖能力结果显示，100 µg/mL GJ组BMSCs增殖能力强于对照组和分化诱导组，差异有统计学意义（P<0.05）。其余各分组BMSCs增殖能力差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1各组BMSCs增殖能力比较
注：a与对照组相比，P<0.05；b与分化诱导组相比，P<0.05
2.2 骨痂胶囊促进BMSCs向成骨细胞方向分化并上调表达相关分化标志物
Western blot法检测BMSCs表达成骨细胞分化相关标志物结果所示，与对照组相比，分化诱导组、10 µg/mL GJ组、50 µg/mL GJ组和100 µg/mL GJ组ALP、OCN和RUNX2表达水平均升高（P<0.05）。与分化诱导组相比，10 µg/mL GJ组、50 µg/mL GJ组和100 µg/mL GJ组ALP、OCN和RUNX2表达水平均升高（P<0.05）。与10 µg/mL GJ组相比，50 µg/mL GJ组和100 µg/mL GJ组ALP、OCN和RUNX2表达水平均升高（P<0.05）。与50 µg/mL GJ组相比，100 µg/mL GJ组ALP、OCN和RUNX2表达水平均升高（P<0.05），见图1和表2。
图1Western blot法检测BMSCs表达成骨细胞分化相关标志物结果图
表2各组BMSCs表达成骨细胞分化相关标志物水平比较
注：a与对照组相比，P<0.05；b与分化诱导组相比，P<0.05；c与10 µg/mL GJ组相比，P<0.05；d与50 µg/mL GJ组相比，P<0.05
2.3 骨痂胶囊促进BMSCs向血管内皮细胞方向分化并上调表达相关分化标志物
Western blot法检测BMSCs表达血管内皮细胞分化相关标志物结果显示，与对照组相比，分化诱导组、10 µg/mL GJ组、50 µg/mL GJ组和100 µg/mL GJ组VEGF和Ang-2表达水平升高（P<0.05）。与分化诱导组相比，10 µg/mL GJ组、50 µg/mL GJ组和100 µg/mL GJ组VEGF和Ang-2表达水平升高（P<0.05）。与10 µg/mL GJ组相比，50 µg/mL GJ组和100 µg/mL GJ组VEGF和Ang-2表达水平升高（P<0.05）。与50 µg/mL GJ组相比，100 µg/mL GJ组VEGF和Ang-2表达水平升高（P<0.05），如图2和表3。
图2Western blot法检测BMSCs表达血管内皮细胞分化相关标志物结果图
表3各组BMSCs表达血管内皮细胞分化相关标志物水平比较
注：a与对照组相比，P<0.05；b与分化诱导组相比，P<0.05；c与10 µg/mL GJ组相比，P<0.05；d与50 µg/mL GJ组相比，P<0.05
2.4 骨痂胶囊增加小鼠股骨缺损处骨量
与在体对照组相比，模型组软骨内骨化程度降低，少见胶原蛋白沉积和成骨细胞、软骨细胞分化；与模型组相比，GJ治疗组软骨内骨化程度升高，存在大量胶原蛋白沉积和成骨细胞、软骨细胞分化，见图3。与在体对照组相比，模型组BMD和BV/TV降低，GJ治疗组BMD和BV/TV升高（P<0.05）。与模型组相比，GJ治疗组BMD和BV/TV升高（P<0.05），见表4。
图3Micro-CT和HE染色（×200）检测小鼠股骨缺损愈合情况结果图
表4各组小鼠股骨缺损愈合情况比较
注：a与在体对照组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05
2.5 骨痂胶囊增加小鼠股骨缺损处骨膜内血管发生
与在体对照组相比，模型组和GJ治疗组IHC-VEGF相对着色光密度值降低；与模型组相比，GJ治疗组IHC-VEGF相对着色光密度值升高（P<0.05），见图4和表5。
图4检测小鼠股骨缺损处VEGF表达情况结果图（免疫组织化学染色，×200）
表5免疫组织化学染色检测小鼠股骨缺损处VEGF表达情况结果统计表
注：a与在体对照组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05
3 讨论
骨痂胶囊主要成分为骨碎补、续断、杜仲、淫羊藿、三七、当归、红花、熟地黄、白及和冰片。骨碎补的主要有效成分为总黄酮类和二氢黄酮类柚皮苷，具有促进牵张成骨的新骨发生和骨愈合的作用[6]。骨碎补可通过调节Wnt/β-catenin、MAPK、OPG/RANKL/RANK、Notch、BMP-Smads、PI3K/Akt等信号通路，抗骨质疏松症和修复骨缺损等[7]。续断主要活性成分包括龙胆碱、β-谷甾醇和林生续断苷Ⅲ-qt等成分[8]。续断具有上调大鼠胫骨骨折处Hedgehog信号通路活性、增加BMD、增加新生血管数量的功效[9]。杜仲的有效成分主要为环烯醚萜类（杜仲苷）、木脂素类（松脂醇二葡萄糖苷）、黄酮类（槲皮素、紫云英苷等）、苯丙素类（绿原酸）、杜仲多糖等[10]。复方杜仲汤可通过调节Keap1-Nrf2/ARE信号通路，提高终板软骨细胞活性，降低细胞内氧化应激和炎症因子水平，抑制终板软骨退变[11]。淫羊藿归肝、肾经，具有补肾阳、壮筋骨、祛风湿的功效。“淫羊藿-当归”药对中治疗骨质疏松症的主要有效化合物包括槲皮素、山奈酚、淫羊藿素、淫羊藿苷等[12]。“淫羊藿-杜仲”药对能够大大增加去势雌鼠骨质疏松症模型的骨密度和骨合成代谢[13]。三七主要有效成分包括三七总皂苷、三七皂苷等，能够通过TGF-β/BMP、Wnt/β-Catenin、MAPK以及RANKL/RANK/OPG信号通路促进股骨头坏死部位骨合成代谢和新血管发生[14]。“三七-淫羊藿”药对治疗股骨头坏死，能够调控骨免疫-炎症反应、改善股骨头血运，促进气滞血瘀型早期股骨头缺血性坏死患者的康复[15，16]。自古，当归被医家称为补血圣药，具有补血、活血、治筋伤、痹症的功效。当归、骨碎补、续断联合用药可通过抑制PI3K/AKT信号通路、促进血运治疗激素性股骨头坏死[17]。红花具有增强血运、改善骨免疫功能、抗炎和止痛等功效[18-19]。研究表明，藏红花素可通过调节Hippo-YAP信号通路抑制膝骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡[20]。熟地黄具有促进骨合成、抑制软骨细胞凋亡、止痛及抗炎的功效[21，22]。熟地黄多糖可上调lncRNA MEG3抑制碘乙酸钠致骨关节炎软骨细胞损伤[23]。总之，骨痂胶囊用于辅助治疗股骨粗隆间骨折和骨缺损，其配伍严谨，有效成分综合起效，理论上具有补肾、益气、活血、温阳、祛湿及止痛的功效。
ALP阳性表达是成骨细胞分化的标志之一[24]。BMSCs向成骨分化后，OCN和RUNX2表达增强[25]。RUNX2和VEGF表达上调可促进BMSCs的成骨分化和增强成骨-血管生成耦联[26]。过表达VEGF的外泌体治疗股骨头坏死大鼠模型，可促进股骨头血管发生、改善血供，延缓股骨头坏死的进展[27]。骨折后愈合能力强的患者，外周血清中Ang-2水平明显高于骨不愈合的患者[28]。本研究结果显示，骨痂胶囊在体外可增强BMSCs表达ALP、OCN和RUNX2，促进其向成骨细胞方向分化；增强BMSCs表达VEGF和Ang-2，促进其向血管内皮细胞方向分化。与骨质疏松联合股骨缺损模型组小鼠相比，骨痂胶囊治疗能增强股骨BMD和BV/TV，增强股骨缺损处VEGF的表达。