摘要
目的：研究舒筋定痛胶囊治疗快速老化P6品系（SAMP6）小鼠骨质疏松的疗效及其机制。方法：16只SAMP6小鼠随机分为空白对照组（SAMP空白组）和舒筋定痛治疗组（SJDT治疗组），每组8只，8只抗快速老化小鼠（SAMR1）为SAMR对照组。SJDT治疗组每日灌胃舒筋定痛胶囊混悬液，SAMP空白组和SAMR对照组灌胃等量的生理盐水，8周后，采取双能X线吸收法（DXA）检测骨密度，微米X-射线显微镜（Micro-CT）检测骨微观结构；采用ELISA法检测血清中骨钙素（OCN）、I型胶原蛋白N端前肽（PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP-5b）、I型胶原蛋白C端肽（CTX-Ⅰ）水平；采用Western blot和RT-PCR检测骨组织中NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、Gasdermin D蛋白（GSDMD）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）蛋白和mRNA表达水平；采用免疫组化检测NLRP3表达。结果：与SAMP空白组和SAMR对照组相比，SJDT治疗组的骨矿物质密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁的厚度（Tb.Th）和骨小梁的数量（Tb.N）升高，骨小梁分离度（Tb.Sp）降低，差异有统计学意义（P<0.05）；SJDT治疗组OCN、PINP表达水平升高，而TRAP-5b、CTX-Ⅰ表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）；SJDT治疗组中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：舒筋定痛胶囊能够通过抑制NLRP3炎性小体表达水平，减轻炎症反应，抑制破骨细胞活性，促进成骨细胞形成，提示NLRP3可能是治疗骨质疏松的潜在靶点。
关键词
Abstract
Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of Shujindingtong capsules on osteoporosis in SAMP6 mice. Methods Sixteen SAMP6 mice were randomly divided into a blank control group (SAMP blank group) and a Shujindingtong capsules treatment group (SJDT treatment group), and eight SAMR1 mice were used as the control group (SAMR control group). The SJDT treatment group was administered Shujin Dingtong capsules suspension by gavage daily, while the SAMP and SAMR groups were given the same volume of normal saline. After 8 weeks, bone mineral density (BMD) was measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA), and bone microstructure was examined by micro-computed tomography (Micro-CT). The expression levels of OCN, PINP, TRAP-5b, and CTX-I in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expression levels of NLRP3, Caspase-1, GSDMD, IL-1β, and IL-18 proteins and mRNAs in bone tissue were detected by Western blot and RT-PCR. The expression of NLRP3 was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the SAMP blank group and the SAMR control group, the SJDT treatment group showed significant increases in bone tissue BMD, BV/TV, Tb.Th, Tb.N, and a significant decrease inTb.Sp (P<0.05). The expression levels of OCN and PINP in the SJDT treatment group were increased, while the expression levels of TRAP-5b and CTX-I were decreased (P<0.05). The expression levels of NLRP3, Caspase-1, GSDMD, IL-1β, and IL-18 proteins and mRNAs in the SJDT treatment group were significantly decreased (P<0.05). Conclusion Shujin Dingtong capsules can inhibit the expression level of NLRP3 inflammasome, reduce inflammatory response, suppress osteoclast activity, and promote osteoblast formation, suggesting that NLRP3 may be a potential target for osteoporosis therapy.
Keywords
老年性骨质疏松症（senile osteoporosis，SOP）以骨量减少[1-2]、易骨折为特征[3-4]。SOP的发病过程与骨代谢失衡[5]及骨免疫炎症有关[6-7]。NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（nod-like receptor pyrin domain containing3，NLRP3）炎性小体[8]是近年来研究最为广泛的一种细胞内蛋白复合物，可引发炎症反应，影响骨修复和重塑[9-10]。研究发现，衰老或雌激素缺乏可上调NLRP3表达，加速破骨细胞分化；敲除NLRP3后，骨量升高[11-12]。因此，靶向抑制NLRP3表达成为治疗SOP的关键。中医理论中，SOP的临床表征与“骨枯”“骨痿”记载相符[13]。SOP的核心治疗当以滋补肝肾，佐以活血化瘀。舒筋定痛胶囊含多种活性成分（如乳香、土鳖虫等），具有抑制炎症、调节免疫及促进骨形成的作用，主要用于治疗各种慢性炎症相关疼痛病症，如风湿痹疼、骨关节炎等[14]。然而，目前关于舒筋定痛胶囊治疗SOP的研究尚显匮乏。本研究采用快速老化P6品系（senescence accelerated mouse prone6，SAMP6）小鼠作为实验动物，该模型为自发性快速老化骨质疏松模型，可自然模拟SOP病理进程并自发激活NLRP3炎性小体。通过检测骨代谢相关指标、分析骨微结构参数以及检测NLRP3炎症因子表达，探讨舒筋定痛胶囊是否通过抑制NLRP3改善骨代谢和微结构。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
舒筋定痛胶囊（天津市天津医院院内制剂，成分为当归、乳香、土鳖虫、骨碎补、自然铜、硼砂、红花、没药、大黄，为植物药浸膏与原生药粉末，规格0.4 g/粒，每克相当于1.32 g生药）；骨钙素（osteocalcin，OCN）、I型胶原蛋白N端前肽（procollagen in-terminal propeptide，PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（anti-tartrate acid phosphatase5b，TRAP-5b）、I型胶原蛋白C端肽（c-terminal telopeptide of type I collagen，CTX-Ⅰ）的酶联免疫法（ELISA）检测试剂盒及ECL超敏发光试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；多聚甲醛缓冲液（上海陶术生物科技股份有限公司）；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、离心机及RIPA裂解缓冲液（美国赛默飞世尔科技公司）；抗体（美国CST公司）；BCA蛋白定量试剂盒（美国BOSTER公司）；包埋机（上海科汇生物技术有限公司）；微米X-射线显微镜（Micro-CT）购自德国布鲁克公司。
1.2 实验动物及分组
16只12周龄的SAMP6雄性小鼠，8只同源的SAMR1雄性小鼠，均购自华阜康动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2024-0003]，适应性饲养5 d，湿度控制在50%~60%，每天光照12 h，自由饮水摄食。本研究经中研（天津）生物伦理委员会批准（编号：ZXHK-DWLL-2025-0159）。
适应性饲养5 d后，SAMP6小鼠随机分为2组，SAMP6空白对照组（SAMP空白组，n=8），舒筋定痛胶囊治疗组（SJDT治疗组，n=8）；SAMR1小鼠为对照组（SAMR对照组，n=8）。SJDT治疗组小鼠每日给予舒筋定痛胶囊混悬液灌胃（0.3 g/kg，2次/d），参照文献[14]中的方法换算临床等效剂量。SAMR对照组与SAMP空白组小鼠给予等体积生理盐水灌胃，连续给药8周。
1.3 标本采集
将小鼠麻醉后，经眼眶采血，在4℃下，用离心机以3000 r/min离心15 min，收集上清备用。同时采用显微解剖技术，在无菌条件下摘取骨组织，采用组织匀浆器制备10%（w/v）组织匀浆，用于基因和蛋白表达检测；其余部分股骨样本经4%多聚甲醛固定2 d，进行Micro-CT骨微观结构检测。
1.4 ELISA法检测血清OCN、PINP、TRAP-5b、CTX-Ⅰ水平
参照ELISA试剂盒说明书，检测血清OCN、PINP、TRAP-5b、CTX-Ⅰ水平。
1.5 RT-qPCR检测NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、Gasdermin D蛋白（GSDMD）、白细胞介素（IL）-1β及IL-18的mRNA表达水平
三组小鼠骨组织采用匀浆器制备10%（w/v）组织匀浆，使用Trizol法在冰上提取总RNA。选取合格的RNA按试剂盒说明进行逆转录，以mRNA为模板，采用随机引物，在逆转录酶作用下反转录合成cDNA，于-20℃保存。对所有cDNA进行qPCR检测，内参选用GAPDH。采用GeNorm软件分析内参基因的稳定性，用于校正目标基因的表达量。依据qPCR试剂盒上面的说明书流程完成PCR的扩增。质控确保目标基因扩增效能为90%~110%、R²≥0.99。本实验采用3次独立生物学重复（从每组8只小鼠中，分别选取3个独立的小鼠组织样本分别完成实验），生物学重复变异系数≤15%，如果出现异常，则需要重测。用2−ΔΔCt方法计算相对表达量，详细引物序列见表1。
表1PCR引物序列
1.6 Western Blot检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表达
将三组小鼠骨组织采用匀浆器制备10%（w/v）组织匀浆，加入RIPA裂解缓冲液，在冰上裂解30 min，期间每10 min振荡1次确保裂解完全。使用BCA试剂盒进行相关浓度的测定，统一调整裂解缓冲液浓度为2 μg/μL。蛋白质经过10%SDS-PAGE分离，通过湿转法再转到PVDF膜上，室温下，用5%脱脂奶粉封闭1 h。然后分别加入NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、GAPDH一抗（按试剂盒说明书比例稀释），在4℃下孵育，次日用TBST洗涤3次，再加入相应种属的荧光二抗（按说明书比例稀释），室温孵育30 min，孵育结束后用TBST洗涤3次，每次5 min，随后ECL显色，采集图像，用Image J软件进行灰度值分析。实验进行3次独立生物学重复。
1.7 骨组织Micro-CT测量
采用Micro-CT扫描股骨组织后，分析骨小梁参数，包括骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁的厚度（Tb.Th）、分离度（Tb.Sp）、数量（Tb.N）。
1.8 免疫组化染色
将股骨组织石蜡切片浸入3%双氧水（ H2O2 ）中10 min，在10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液中进行抗原修复。经BSA封闭后，切片在稀释好的NLRP3一抗溶液中孵育过夜，用1×PBS洗涤切片，然后加入相应的二抗孵育30 min，DAB显色后，显微镜下采集图像，并通过Image J软件进行定量分析。
1.9 统计学分析
使用SPSS 25.0处理所有数据，测量数据以均值±标准差显示，多组比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三组骨密度和微观检测结果比较
与SAMR对照组比较，SAMP空白组小鼠骨组织中BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，而Tb.Sp升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。与SAMP空白组比较，SJDT治疗组小鼠骨组织中BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，而Tb.Sp降低，差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2三组骨密度和微观检测结果比较
注：a与SAMR对照组比较，P<0.05；b与SAMP空白组比较，P<0.05
2.2 三组骨代谢指标结果比较
与SAMP空白组比较，SJDT治疗组小鼠血清OCN、PINP表达水平升高；TRAP-5b、CTX-Ⅰ表达水平降低，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图1。
2.3 三组炎症因子的蛋白和mRNA表达水平比较
SAMP空白组的NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达水平较SAMR对照组升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。SJDT治疗组的NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达水平低于与SAMP空白组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表3，图2。
图1三组骨代谢指标表达结果
表3三组炎症因子蛋白表达水平比较
注：a与SAMR对照组比较，P<0.05；b与SAMP空白组比较，P<0.05
图2三组炎症因子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 mRNA表达水平比较
2.4 三组NLRP3免疫组化结果比较
与SAMP空白组比较，SJDT治疗组的NLRP3染色较浅，阳性面积降低，见图3。定量分析结果显示，SJDT治疗组NLRP3阳性面积率和积分光密度值比SAMP空白组降低，差异具有统计学意义（P<0.05），见表4。
图3三组NLRP3免疫组化图像
表4三组NLRP3免疫组化结果比较
注：a与SAMR对照组比较，P<0.05；b与SAMP空白组比较，P<0.05
3 讨论
SOP已成为老年人群不可忽视的高发性骨骼疾病，随着年龄增加，免疫系统功能减弱，逐渐导致炎症环境的累积，抑制骨形成[15-16]。近年来，NLRP3在由慢性炎症驱动的代谢类疾病中受到关注，其异常激活与关节炎、骨质疏松、痛风等疾病密切相关[17]。NLRP3炎性小体通过先天免疫和炎症反应，介导对外部刺激和病理条件的炎症级联反应，引发各种骨相关细胞类型的焦亡，破坏骨修复过程和重塑。舒筋定痛胶囊作为中药复方制剂，其在治疗慢性腰腿痛及风湿痹痛等病症中具有显著的抗炎作用。本研究结果发现舒筋定痛胶囊可以降低NLRP3炎症因子的表达并维持骨代谢稳态平衡。
SOP发病主要因为骨代谢稳态的失衡[18-19]。SOP患者因衰老造成骨形成过程受损，导致骨组织减少。同时，体内的骨骼被分解吸收的过程加快，导致骨骼形成的速度低于骨骼吸收的速度，造成骨量流失。本研究中，SJDT治疗组BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th较其他两组显著提高。说明舒筋定痛胶囊治疗后，SAMP6小鼠的骨微结构得到显著改善，并有新骨组织形成。我们对骨代谢指标检测，发现SJDT治疗组中成骨标志物OCN和PINP表达升高，破骨标志物TRAP-5b和CTX-Ⅰ表达降低，提示舒筋定痛胶囊不仅能促进骨基质形成及矿化，还能有效抑制骨吸收，维持骨代谢稳态，发挥骨保护作用。
骨免疫学的兴起使更多研究者发现免疫和炎症因子在骨重塑中的作用[20]。本研究结果显示SAMP空白组的NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β及IL-18蛋白和mRNA表达水平较其他两组升高，说明SAMP6小鼠体内NLRP3及GSDMD表达升高导致细胞焦亡水平升高。SOP的发病进程可能与NLRP3调控骨代谢及激活的细胞焦亡通路有关。Chen等[21]研究发现，NLRP3对骨稳态的破坏主要体现为调控成骨及破骨分化。NLRP3促进炎症发生，抑制骨形态发生蛋白Smad信号转导，降低成骨细胞的增殖分化能力，减少OCN、PINP等成骨标志物的分泌。IL-1β和IL-18可结合破骨前体细胞上的RANK，增加RANKL的释放，促进破骨细胞的分化，并上调破骨标志物的表达。这与本研究结果一致。NLRP3不仅通过Caspase-1/IL-1b/IL-18激活途径加重细胞炎症反应，还能激活NF-κB/NLRP3/GSDMD细胞焦亡信号通路[22]。本研究中NLRP3的上调提示上游NF-κB通路可能处于活化状态。研究表明NF-κB通路特异性诱导NLRP3与IL-1β等促炎因子前体转录与表达，随后细胞内K⁺外流、ROS生成激活Caspase-1，既介导炎症反应，又特异性剪切GSDMD蛋白，从而激活NF-κB/NLRP3/GSDMD通路形成正反馈的调节[23]。本研究中SJDT降低NLRP3、Caspase-1及GSDMD的蛋白与mRNA表达，同时下调IL-1β、IL-18蛋白水平，表明SJDT可从转录及翻译水平抑制NF-κB/NLRP3/GSDMD细胞焦亡信号通路的激活，降低细胞焦亡水平。NLRP3免疫组化发现SJDT治疗组NLRP3阳性面积降低，这一结果有力地支持了上述推测，说明SJDT维持骨代谢平衡的作用机制可能与调控NF-κB/NLRP3/GSDMD通路的异常激活有关。
本研究的局限性如下：1）本研究使用的动物模型未考虑物种差异；2）因实验条件限制，未进行NLRP3基因敲除或过表达小鼠实验。目前结论尚属初步探索，NLRP3炎症小体在其中的确切作用与机制仍需进一步验证；3）舒筋定痛胶囊治疗SOP的信号通路机制，特别是其下游分子机制，有待进一步研究。
综上所述，舒筋定痛胶囊对NLRP3炎症小体的激活具有明显的抑制作用，并以此介导其抗炎活性。同时，可减少骨吸收及炎症浸润，促进成骨细胞分化，发挥多靶点骨保护作用。这为SOP的治疗提供了理论依据。