摘要
目的：利用非靶向代谢组学方法寻找脓毒症伴急性肺损伤（ALI）特异性代谢标志物和代谢通路，为临床诊断及诊疗提供新的依据。方法：选取2022年7月—2023年10月就诊于我院的脓毒症患者33例，分为脓毒症伴ALI组（22例）、脓毒症不伴ALI组（11例），同时选取15例健康成人作为对照组。采用超高效液相色谱质谱联用仪分别对三组受试者的尿液样本进行代谢组学检测，并对差异代谢物及代谢通路进行统计分析。结果：48例受试者共鉴定出代谢物456种，312种代谢物可区分脓毒症组和健康对照组，109种代谢物可区分脓毒症伴ALI组与不伴ALI组。与脓毒症不伴ALI组比，脓毒症伴ALI组浓度增加的代谢物主要涉及能量代谢、炎症与免疫激活、脂质代谢紊乱与细胞膜损伤、氧化应激与解毒反应、器官功能障碍与清除减少。浓度降低的代谢物主要涉及抗氧化防御系统、能量代谢与线粒体功能受、肝脏合成与解毒功能、保护性/信号性脂质介质消耗或合成减少和氨基酸代谢等。显著变化的代谢通路有22种，主要包括柠檬酸循环、β-丙氨酸代谢和苯丙氨酸代谢通路紊乱等。结论：用非靶向代谢组学方法在脓毒症伴ALI患者尿液中筛选出具有显著变化的代谢物，该组患者存在柠檬酸循环、β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸等代谢通路紊乱，这些有望成为脓毒症伴ALI诊断的特异性代谢标志物和代谢通路。
Abstract
Objective To identify specific metabolic markers and pathways for sepsis with acute lung injury (ALI) using untargeted metabolomics, providing new insights for clinical diagnosis and treatment. Methods A total of 33 sepsis patients admitted to our hospital from July 2022 to October 2023 were enrolled and divided into sepsis with ALI group (22 cases) and sepsis without ALI group (11 cases). Fifteen healthy adults were selected as the control group. Urine samples from all three groups were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography–mass spectrometry for metabolomic profiling, and differential metabolites and metabolic pathways were statistically analyzed. Results A total of 456 metabolites were identified in 48 participants. Among them, 312 metabolites could distinguish sepsis patients from healthy controls, and 109 metabolites could distinguish the sepsis with ALI group from the sepsis without ALI group. Compared with the sepsis without ALI group, the metabolites increased in the sepsis with ALI group were mainly involved in energy metabolism, inflammation and immune activation,lipid metabolism disorders and cell membrane damage, oxidative stress and detoxification responses, and organ dysfunction with reduced clearance. The metabolites decreased in the sepsis with ALI group were mainly associated with the antioxidant defense system, impaired energy metabolism and mitochondrial function, reduced hepatic synthesis and detoxification, consumption or reduced synthesis of protective/signaling lipid mediators, and amino acid metabolism. A total of 22 metabolic pathways were significantly altered, mainly including disturbances in the citrate cycle (TCA cycle), β-alanine metabolism, and phenylalanine metabolism. Conclusion Using untargeted metabolomics, we identified significantly altered metabolites in the urine of sepsis patients with ALI. These patients exhibited disturbances in metabolic pathways such as the citrate cycle, β-alanine metabolism, and phenylalanine metabolism. These metabolites and pathways may serve as specific diagnostic markers for sepsis with ALI.
脓毒症是感染引起的宿主反应失调进而导致危及生命的器官功能障碍[1]。脓毒症患者并发症多，最严重的并发症之一是急性肺损伤（acute lung injury，ALI），其发病机制复杂，病死率高，有研究统计，68.2%的脓毒症患者合并ALI，90 d病死率约为35.5%[2]。因此，寻找评估脓毒症ALI的新型生物标志物对疾病的早期识别、干预治疗及预后具有重要意义。代谢组学是通过采集血浆、粪便、组织、尿液等标本检测体内生理过程中小分子代谢物质的新型学科，可用于脓毒症的诊断和预后的研究，检测标本多为血清或组织，也有少数尿液代谢组学研究[3]。但采血会造成一定程度的损伤和机体应激反应，而尿液采集简单易行、无创且依从性高。本研究基于超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）探究脓毒症ALI的尿液代谢组学变化，旨在寻找新的代谢标志物及相关代谢通路，开拓脓毒症ALI无创筛查的新思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2022年7月—2023年10月就诊于我院的脓毒症患者33例，分为脓毒症伴ALI组（22例）、脓毒症不伴ALI组（11例），同时选取15例健康成人作为对照组。本研究经天津市南开医院伦理委员会批准（批号：NKYY_YXKT_IRB_2023_108_01）。
1.2 纳入与排除标准
1.2.1 纳入标准
脓毒症不伴ALI组：年龄>18岁、入住ICU并根据脓毒症诊断标准sepsis 3.0[1]被临床诊断为脓毒症的患者。脓毒症伴ALI组在满足上述标准的基础上还需满足如下诊断标准[4]，包括：1）有相应原发疾病或相关诱因及危险因素；2）有呼吸窘迫症状；3）氧合指数（PaO2/FiO2）≤300 mmHg；4）肺动脉嵌入压（PAWP）≤18 mmHg，或临床除外心源性因素；5）X线胸片显示双肺浸润。
1.2.2 排除标准
1）合并恶性肿瘤患者；2）免疫功能低下患者，或近2周内使用糖皮质激素或免疫抑制药等其他可能改变机体免疫功能药物者；3）既往有较严重的凝血功能障碍者；4）既往有较严重的脏器功能不全者；5）妊娠期或哺乳期妇女；6）原发疾病进一步进展者。
1.3 标本采集
采集受试者的尿液，标本以4000 r/min离心10 min后收集上清，放入-80℃的冰箱中保存备用。
1.4 仪器与试剂
超高效液相色谱/质谱联用仪、色谱纯乙腈及甲醇（美国赛默飞世尔科技公司）；冷冻离心机（德国艾本德股份有限公司）；乙酸铵（美国Sigma-Aldrich公司）；ddH2O2（北京屈臣氏公司）；甲酸（美国ACS恩科化学公司）。
1.5 代谢组学分析
吸取100 μL尿液样品，加入400 μL冰乙腈沉淀蛋白，离心10 min（离心半径10 cm，速度14000 r/min），离心后吸上清，吹氮气进行干燥，加入80%的甲醇100 μL进行复溶，待检，详细步骤参考王靖阳等[5]研究。
1.6 色谱条件选择
U3000超高效液相系统，2.1 mm×100 mm，1.8 μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（D）作为流动相，详细步骤参考王靖阳等[5]研究。
1.7 质谱条件选择
采用Thermo Fisher Q-Orbitrap MS（Q-Exative）系统，高能电喷雾离子源（HESI源）作为离子源，Fullms/dd-ms2模式扫描，正、负离子模式下同时进行采集，详细步骤参考王靖阳等[5]研究。
1.8 数据处理
采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。正态分布计量数据用 表示，多组比较采用F检验；非正态分布计量数据用M（P25，P75）表示，多组比较采用秩和检验；计数资料采用例（%）表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。基础分析包括数据的预处理，单变量统计分析包括T-test等；多元变量统计分析包括主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）等；差异化合物筛选和鉴定可选择数据分析；差异代谢物的层次聚类分析；差异代谢物的相关性分析。原始数据包含48例实验样本和12个质控（quality control，QC）样本，将这些原始数据导入Compound Discoverer软件分析，进行峰面积提取和化合物鉴定及随后相关分析。
2 结果
2.1 三组患者一般资料比较
三组患者的性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05）。脓毒症伴ALI组的PaO2/FiO2低于脓毒症不伴ALI组，脓毒症不伴ALI组和脓毒症伴ALI组的SOFA评分高于健康对照组，脓毒症伴ALI组的SOFA评分高于脓毒症不伴ALI组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1三组患者一般资料比较
注：a与健康对照组比较，P<0.05；b与脓毒症不伴ALI组比较，P<0.05
2.2 脓毒症伴ALI组与不伴ALI组患者的代谢组学分析
48 例受试者共鉴定出代谢物456种，312种代谢物可区分脓毒症组和健康对照组，109种代谢物可区分脓毒症伴ALI组与不伴ALI组。数据进行主成分分析，PCA得分散点图见图1。脓毒症组与健康对照组比，分离趋势明显，组内分布集中，表明脓毒症组与健康对照组有明显差异，但脓毒症伴ALI组与不伴ALI组无明显差异。随后进行OPLS-DA分析，脓毒症伴ALI组与不伴ALI组的OPLS-DA模型得分散点图及200次置换检验结果见图2，提示本次建立的OPLS-DA模型不存在过拟合现象，可以准确描述数据，同时研究发现脓毒症伴ALI组与不伴ALI组有进一步的分离。
图1PCA得分散点图
图2有监督的OPLS-DA分析结果置换验证图
2.3 脓毒症伴ALI组与不伴ALI组的差异代谢物分析
本研究使用阈值标准为T-test的P<0.05，同时两组化合物定量比取以2为底的对数（log2FC）绝对值大于2筛选差异代谢物，结果以火山图的形式进行可视化展示，见图3。两组相比，浓度增加的代谢产物主要有7-甲基黄嘌呤、肌苷、辅羧化酶、肾上腺素原、11-脱氢皮质酮、N-花生四烯酰多巴胺、溶血磷脂酰肌醇单甘露糖苷（16:0/0:0）、磷脂酸（17:1（9Z）/0:0）、磷酸甘油酸（15:1（9Z）/0:0）、9，10-二溴硬脂酸、硫烷基谷胱甘肽、N-乙酰-L-瓜氨酸等。浓度下降的主要代谢产物有N-（3-氯苯甲酰基）甘氨酸、C19鞘氨醇-1-磷酸、PG（18:0/0:0）、富马酸、肌肽、十七酰辅酶A、2-羟基苯丙氨酸、抗坏血酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸盐等。本研究还以log2FC的绝对值降序排序，取前40个化合物，对血清样本进行热图分析，显示了各组的生物标记物相对变化趋势，蓝色表示增加，红色表示减少，见图4。
2.4 脓毒症伴ALI组与不伴ALI组的通路富集分析
通过MetaboAnalyst网站进行通路富集分析，通过差异代谢物来筛选相关代谢通路。脓毒症伴ALI组与不伴ALI组相比，显著相关的22条代谢途径，主要包括柠檬酸循环、β-丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、硫代谢、苯丙氨酸代谢、烟酸盐和烟酰胺代谢、组氨酸代谢等，见图5。
图3差异代谢物筛选火山图
图4差异代谢物热图
图5脓毒症伴ALI组与不伴ALI组差异代谢物通路富集分析
3 讨论
尿液质谱代谢组学具备成为脓毒症ALI无创筛查工具的潜力。近年来，代谢组学技术已广泛应用于脓毒症ALI生物标志物的筛选与鉴定，并能够区分不同的疾病表型[6-7]。尿液样本因其采集简便、无创、患者依从性高等特点，在此类研究中具有独特优势。Wang等[8]的研究表明，通过分析脓毒症患者尿液中的一组代谢物（包括琥珀酸、酪氨酸和甘油磷脂），可有效预测28 d死亡率，提示尿液代谢谱是一种较传统临床指标更早、更敏感的预后评估工具。Liu等[9]系统总结了脓毒症中多种生物样本的代谢组学研究，指出氨基酸代谢、能量代谢等相关代谢物可作为诊断和预后的生物标志物。
本研究进一步发现，脓毒症伴ALI与不伴ALI患者之间的尿液代谢物存在显著差异。其中，与能量危机和嘌呤代谢紊乱相关的7-甲基黄嘌呤、肌苷及辅羧化酶浓度升高。Eltzschig等[10]指出，组织缺氧与能量耗竭导致ATP大量降解；肌苷作为ATP分解产物，其甲基化衍生物7-甲基黄嘌呤的积累直接反映了ATP加速消耗及缺血缺氧状态。Costa等[11]研究显示，辅羧化酶作为糖代谢关键辅酶，在脓毒症高代谢和糖酵解加速状态下需求增加，其浓度变化可能反映代偿性上调或消耗性改变。这三类代谢物的上升共同印证了脓毒症伴ALI患者存在显著的能量代谢障碍。
同时，参与炎症与免疫激活的代谢物——肾上腺素原、11-脱氢皮质酮和N-花生四烯酰多巴胺——在ALI组中浓度显著升高。Annane等[12]描述了脓毒症应激反应引起的内分泌变化；肾上腺素原作为肾上腺素前体，其升高反映了下丘脑-垂体-肾上腺轴与交感神经系统的强烈激活。Webster等[13]指出11-脱氢皮质酮水平升高标志着糖皮质激素轴激活，试图抑制过度炎症。Pérez-Ortiz等[14]研究表明，N-花生四烯酰多巴胺作为内源性脂质介质，可通过TRPV1和CB1受体参与炎症与血管张力调节。这些代谢物的变化可能共同推动细胞因子风暴及全身炎症反应，构成脓毒症ALI的重要病理机制。
此外，核心磷脂酸、溶血磷脂变体及9，10-二溴硬脂酸等脂质相关代谢物在ALI组中亦显著升高。研究[15-16]表明，脓毒症中磷脂酶激活导致细胞膜磷脂水解，生成溶血磷脂等产物；磷脂酸积累反映细胞膜损伤修复及炎症信号传递。Hawkins等[17]发现9，10-二溴硬脂酸是硬脂酸经次溴酸卤化后的产物，为氧化应激与卤化应激的直接证据。这些变化共同说明脓毒症ALI中存在显著的脂质代谢紊乱、氧化应激及细胞膜损伤。
在氧化应激与解毒反应方面，硫烷基谷胱甘肽和N-乙酰-L-瓜氨酸浓度增加。Forman等[18]指出，谷胱甘肽（GSH）在氧化应激下与毒性物质结合形成加合物，是机体积极解毒的标志，但也提示氧化应激程度严重。Pannu等[19]研究表明，脓毒症中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）被强烈诱导，产生大量NO，可能导致血管麻痹；N-乙酰瓜氨酸升高反映了NO通路的高度激活。这两种化合物的变化表明氧化应激在脓毒症ALI发病机制中起关键作用。
另一方面，脓毒症ALI组中多种保护性或结构性物质浓度降低，同样具有病理指示意义。抗坏血酸和肌肽水平下降，反映了抗氧化防御系统的耗竭[20-21]。十七酰辅酶A和富马酸浓度降低，提示线粒体功能障碍、脂肪酸氧化受阻及三羧酸循环中断，与Liu等[22]的研究一致。牛磺胆酸盐与脱氧胆酸水平下降，表明肝合成与解毒功能受损[23]。此外，具有屏障保护作用的信号脂质C19鞘氨醇-1-磷酸（S1P）及肺表面活性物质成分磷脂酰甘油浓度也显著降低，这与Ghidoni等[24]及Günther等[25]关于肺内皮屏障功能与肺泡稳定性的研究相符。
代谢通路分析进一步揭示了整体代谢网络的失调。本研究筛选出22条显著改变的代谢通路，包括：柠檬酸循环障碍导致的能量危机与琥珀酸积累[26]；β-丙氨酸代谢异常反映肌肽合成与消耗失衡；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成/代谢异常，指向肝功能障碍、儿茶酚胺合成增加及免疫调节失衡[27]；硫代谢（以谷胱甘肽为核心）的激活与耗竭，标志氧化应激程度[18]；NAD+严重耗竭加剧细胞能量衰竭与死亡[28]；以及组氨酸代谢参与炎症调节[29]。这些通路相互关联，共同构成一个从能量崩溃、氧化风暴到免疫失衡的病理网络，不仅为理解脓毒症ALI的机制提供了依据，也为针对性的治疗干预（如补充NAD+前体、抗氧化剂或调节色氨酸代谢）指明了方向。
综上，基于尿液的非靶向质谱代谢组学能够系统揭示脓毒症ALI特有的代谢紊乱图谱，这些代谢物与通路的改变深度参与了疾病的发生发展，且易于通过无创方式持续监测。因此，尿液质谱代谢组学展现出作为脓毒症ALI早期、无创筛查工具的突出潜力，有望为临床诊断、预后评估及治疗策略提供重要依据。