摘要
目的：基于超声剪切波弹性成像技术探讨加味茵陈蒿汤（MYCHD）改善大鼠胆汁淤积性肝纤维化的作用机制。方法：选用24只7~8周龄SPF级雄性SD大鼠，按随机数字表法均分为4组：假手术组、模型组、低剂量MYCHD组（MYCHD-L组）、高剂量MYCHD组（MYCHD-H组）。采用胆总管结扎制备大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型，假手术组大鼠仅暴露胆总管后关腹。自造模后7 d起，MYCHD低、高剂量组分别以7.74 g/kg、15.48 g/kg剂量MYCHD灌胃，每天1次，连续7 d。假手术组和模型组以同样方式给予饮用水。行超声剪切波弹性成像测定肝硬度值（LSM）后处死大鼠，采用苏木精-伊红（HE）和天狼星红染色法观察肝组织病理学变化，检测血清碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）、III型前胶原（PC-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）水平，分析LSM与大鼠肝组织纤维化评分及血清各项指标之间的相关性。结果：与假手术组比较，模型组大鼠LSM、肝组织病理学评分及天狼星红染色阳性比例增加，血清ALP、GGT、HA、LN、PC-Ⅲ和Col-Ⅳ水平升高（P<0.05）。与模型组比较，MYCHD-L和MYCHD-H组大鼠LSM、肝组织病理学评分及天狼星红染色阳性面积减少，血清ALP、GGT、HA、LN、PC-Ⅲ和Col-Ⅳ水平降低（P<0.05）；与MYCHD-L组比较，MYCHD-H组大鼠各指标均有改善，差异有统计学意义（P<0.05）。LSM与ALP、GGT、肝组织病理学评分、天狼星红染色阳性面积、血清HA和Col-Ⅳ水平呈强正相关（r分别为0.802、0.765、0.77、0.83、0.751和0.771，P<0.01），与LN和PC-Ⅲ呈中等正相关（r分别为0.485和0.60，P分别为0.01和0.02）。结论：MYCHD能减轻胆总管结扎诱导的大鼠胆汁淤积性纤维化，改善肝功能。无创的超声剪切波弹性成像技术测定肝硬度值可用于对肝纤维化程度的评估和药物疗效监测。
Abstract
Objective To evaluate the value of ultrasound shear wave elastography (SWE) in dynamically monitoring the improvement of biliary liver fibrosis stiffness by modified Yinchenhao decoction (MYCHD). Methods Twenty-four 7–8-week-old male Sprague-Dawley (SD) rats under specific pathogen-free (SPF) conditions were selected to establish a bile duct ligation (BDL)-induced biliary liver fibrosis model. Rats were randomly divided into four groups: sham operation group (Sham group), model group (BDL group), model + low-dose MYCHD group (MYCHD-L group), and model + high-dose MYCHD group (MYCHD-H group). The Sham group underwent laparotomy with bile duct exposure but no ligation, followed by abdominal closure. The other groups underwent common bile duct ligation using 4–0 surgical suture. Seven days post-modeling, the MYCHD-L and MYCHD-H groups received MYCHD (7.74 g/kg and 15.48 g/kg, respectively) via gavage once daily for 7 days. The Sham and BDL groups received an equivalent volume of pure water. After gavage, liver stiffness measurements (LSM) were obtained using SWE. All rats were euthanized post-ultrasound. Liver histopathological changes were observed using Hematoxylin and Eosin (HE) and Sirius red staining. Serum liver function markers—alkaline phosphatase (ALP) and gamma-glutamyl transferase (GGT)—were analyzed using an automated biochemical analyzer. Serum levels of liver fibrosis markers—hyaluronic acid (HA), laminin (LN), type III procollagen (PC-Ⅲ), and type IV collagen (Col-Ⅳ)—were detected via ELISA. Correlations between LSM and serum markers (ALP, GGT) and liver fibrosis markers were analyzed. Results Compared to the Sham group, rats in the Model group (BDL) exhibited significantly increased hepatocyte injury, inflammatory cell infiltration, and collagen deposition area in liver tissue (P<0.05), alongside significantly elevated serum levels of ALP, GGT, HA, LN, PC-Ⅲ, and Col-Ⅳ (P<0.05). Furthermore, liver stiffness values (LSM) measured by SWE were significantly higher in the Model group (P<0.05). Compared to the BDL group, rats in both MYCHD dose groups showed significantly reduced hepatocyte injury, inflammatory cell infiltration, and collagen deposition area (P<0.05), as well as significantly decreased serum levels of ALP, GGT, HA, LN, PC-Ⅲ, and Col-Ⅳ (P<0.05). SWE measurements also revealed significantly lower LSM values in the MYCHD groups (P<0.05). Further analysis revealed that LSM exhibited a strong positive correlation with ALP, GGT, liver histopathological scores, Sirius Red staining-positive area, and serum levels of HA and Col-Ⅳ (r=0.802,0.765,0.77, 0.83, 0.751, 0.771, respectively; all P< 0.01), and a moderate positive correlation with LN and PC-Ⅲ (r= 0.485,0.60, P =0.01,0.02, respectively). Conclusion MYCHD significantly improves BDL-induced liver fibrosis. LSM is valuable for assessing the anti-fibrotic efficacy and therapeutic outcomes of MYCHD. This study provides new evidence and a visualized evaluation method for traditional Chinese medicine in anti-liver fibrosis treatment.
胆汁淤积性肝纤维化是多种肝胆疾病进展过程中的共同病理特征，特征为肝内胆管受损、胆汁淤积及细胞外基质过度沉积，最终可发展为肝硬化和肝功能衰竭[1]。由于确切发病机制尚不清楚，目前抗肝纤维化的临床治疗主要为解除胆道梗阻、减轻炎症、增强免疫功能等，仍没有抗肝纤维化的西药上市[2-4]。茵陈蒿汤出自《伤寒论》，由茵陈蒿、栀子、大黄三味药组成，是治疗肝胆疾病的经典方剂。加味茵陈蒿汤（modified Yinchenhao decoction，MYCHD）在此基础上加用丹参、白头翁、败酱草、炙甘草，具有清热祛湿、护肝利胆之功效，已被证实对非酒精性肝炎及胆汁淤积性肝病具有潜在治疗作用[5-6]。
肝穿刺活检是诊断肝纤维化的金标准，但存在创伤性、取样误差及无法动态监测等局限性。超声剪切波弹性成像技术通过测定声辐射力引起的剪切波传播速度实现成像，获得肝脏组织影像数据，并通过测量肝脏组织弹性模量定量评估肝硬度值（LSM）间接反映纤维化程度[7]。超声剪切波弹性成像是一种无创、实时、可重复的检测技术，已在越来越多的医疗机构用于慢性肝病进展的辅助诊断中，但目前关于LSM与肝组织纤维化相关性的研究较少。本研究通过结扎胆总管诱导大鼠肝纤维化模型，应用剪切波弹性成像技术测定LSM，结合肝组织病理学及血清学指标，研究MYCHD对胆汁淤积性肝纤维化的治疗作用，并分析LSM与肝组织病理学损伤及血清学指标的相关性，为MYCHD治疗胆汁淤积性肝纤维化及LSM用于监测肝纤维化进展的临床应用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 实验药物
MYCHD组成：茵陈10 g，丹参30 g，白头翁15 g，败酱草15 g，大黄10 g，甘草6 g共6味中药，所有中药均购自四川新绿色药业科技发展有限公司。药物批号分别为：茵陈（21090355）、丹参（21090351）、白头翁（2106094）、败酱草（2108100）、大黄（21090378）、甘草（21100285）。
1.2 实验动物
24 只SPF级雄性SD大鼠，7~8周龄，体质量（150±10）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。常规饲养于动物实验中心，自由进食饮水，适应性饲养1周后开始实验。本研究经天津市南开医院动物伦理委员会批准（NKYY-DWLL-2023-177），并严格遵循动物实验3R原则。
1.3 主要试剂及仪器
苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（G1120）和天狼星红染色试剂盒（G1472）购自北京索莱宝科技有限公司；检测血清碱性磷酸酶（A059-2-2）、γ-谷氨酰转移酶水（GGT）（C017-2-1）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；肝纤维化四项指标透明质酸（HA）（ml003310）、层粘连蛋白（LN）（ml102831）、Ⅲ型前胶原（PC-Ⅲ）（ml028349）、Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）（ml058918）酶联免疫吸附测定（ELISA）法试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。配备剪切波弹性成像模式的超声诊断仪由飞利浦（中国）投资有限公司生产。
1.4 造模、分组及给药
将24只SD大鼠按随机数字表法随机分为4组：假手术组、模型组、MYCHD低剂量（MYCHD-L）组、MYCHD高剂量（MYCHD-H）组，每组6只。根据公式大鼠剂量=人剂量/70 kg×6.3（大鼠转换因子）计算出人鼠等效剂量为7.74 g/kg。参考文献[8]，采用胆总管结扎制备大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型，大鼠吸入性异氟烷麻醉，备皮消毒后，固定于动物台上，开腹，使用钝头镊轻轻游离胆管下黏膜，在近肝门处用4-0缝线穿过胆总管并结扎。假手术组仅开腹不接扎。自造模后7 d起，MYCHD-L组及MYCHD-H组大鼠分别以7.74 g/kg、15.48 g/kg剂量MYCHD灌胃，每天1次，连续7 d。假手术组和模型组以同样方式给予饮用水。
1.5 LSM测定
各组大鼠于造模后2周，腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，取仰卧位固定于平板后备皮消毒，于剑突下右侧肋间隙进行肝脏右叶检测：采用飞利浦型超声诊断仪，配备剪切波弹性成像模式，探头频率18-4 MHz。在肝包膜下1~2 cm处划定感兴趣区域（1 cm²），每个检测点重复测量6次，取平均值记录为LSM，用于评估各组大鼠肝纤维化程度。
1.6 标本采集
超声检查结束后取腹主动脉血5 mL，室温静止40 min后，2000 ×g离心10 min后，收集血清备用。取肝脏测湿重，计算肝脏系数，即肝脏质量与体质量之比。取肝左叶，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，一部分置−80℃冰箱备用。
1.7 HE染色
取经固定脱水后的大鼠肝脏组织，经石蜡包埋后切片，厚5 μm。切片放于二甲苯（Ⅰ、Ⅱ）中浸泡脱蜡各10 min，分别放入100%、90%、80%、70%酒精中各5 min，然后用自来水冲洗3遍，每遍5 min，进行HE染色，光镜下观察大鼠肝组织病理学损伤情况，由两名研究人员参考标准进行分级评分[8]。
1.8 天狼星红染色检测胶原沉积情况
石蜡包埋的肝组织经5 μm连续切片后脱蜡至水，苦味酸-天狼星红液浸染1 h，自来水冲洗，核复染、封片。显微镜下观察并使用Leica LAS Image Analysis图像分析软件计算天狼星红染色区域（即胶原沉积区域）的面积占总组织面积的百分比。
1.9 血清肝功能和肝纤维化四项指标检测
取血清平衡至室温，严格按照试剂盒说明书检测肝功能指标ALP、GGT及肝纤维化四项指标HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ的含量。应用酶标仪测定各指标的光密度（OD）值，并按标准曲线计算各项指标在血清中的含量。
1.10 统计学方法
采用SPSS 27.0进行统计学分析。计量资料以均值±标准差（）表示。组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验。采用Spearman相关性分析LSM与ALP、GGT、肝组织病理损伤评分、纤维化程度及血清肝纤维化四项指标的相关性，相关性强度划分如下：几乎无、弱、中等、强、高度强相关的系数绝对值（r）分别为0.00~0.10、0.10~0.39、0.40~0.69、0.70~0.89、0.90~1.00[9]，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MYCHD对肝脏系数和肝功能的影响
模型组大鼠肝脏系数较假手术组显著增加（P<0.05）；与模型组比较，MYCHD治疗组大鼠肝脏系数显著下降，且高剂量低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组血清ALP和GGT均较假手术组显著升高（P<0.05）；与模型组比较，MYCHD治疗组大鼠血清ALP和GGT均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1各组大鼠肝脏系数、肝功能指标及肝组织病理损伤评分比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05; c与MYCHD-L组比较，P<0.05
2.2 MYCHD对肝大体解剖和组织病理学损伤的影响
模型组大鼠肝脏颜色呈暗黄色，质地粗糙，表面可见明显的颗粒状改变。MYCHD-L组和MYCHD-H组大鼠肝脏颜色明显红润，质地较为光滑、颗粒感较弱（图1）。HE染色结果显示：假手术组大鼠肝组织肝小叶结构完整；模型组肝小叶结构紊乱，汇管区可见明显胆管扩张和纤维组织增生，并相互连接形成纤维网超出汇管区范围，侵入肝实质；与模型组比较，MYCHD-L组和MYCHD-H组大鼠肝脏组织汇管区病变较模型组减少（图2）。与假手术组比较，模型组肝组织病理评分显著升高（P<0.05）；与模型组比较，MYCHD治疗组大鼠肝组织病理评分显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
图1各组大鼠肝脏大体观察
图2各组大鼠肝组织病理学损伤（HE染色，×100）
2.3 MYCHD对肝纤维化的影响
胶原纤维经天狼星红染色后在显微镜下呈现红色。模型组汇管区可见大量增生的胶原纤维，连接成网并侵入肝实质；MYCHD-L组和MYCHD-H组肝脏胶原纤维沉积显著减少，见图3。与模型组比较，MYCHD治疗组天狼星红染色阳性比例显著下降；且MYCHD-H组低于MYCHD-L组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
图3各组大鼠肝脏组织天狼星红染色结果（×200）
表2各组大鼠肝组织纤维化情况比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05; c与MYCHD-L组比较，P<0.05
2.4 MYCHD对大鼠血清肝纤维化四项指标的影响
模型组大鼠血清肝纤维化四项指标HA、LN、PC-Ⅲ和Col-Ⅳ水平均较假手术组升高（P<0.05）；与模型组组比较，MYCHD治疗组血清HA、LN、PC-Ⅲ和Col-Ⅳ水平均降低，且MYCHD-H组低于MYCHD-L组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。
表3各组大鼠血清肝纤维化指标HA、LN、PC-Ⅲ和Col-Ⅳ水平比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05; c与MYCHD-L组比较，P<0.05
2.5 MYCHD对LSM的影响
模型组大鼠LSM较假手术组增加（P<0.05）；与模型组比较，MYCHD治疗组大鼠LSM值下降，且MYCHD-H组低于MYCHD-L组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.6 LSM与肝组织病理损伤、纤维化及血清肝纤维化四项之间的相关性分析
LSM与ALP、GGT、肝脏组织病理损伤评分、天狼星红染色阳性比例、血清HA和Col-Ⅳ含量呈强正相关（r分别为0.802、0.765、0.77、0.83、0.751和0.771，P<0.01），与血清LN和PC-Ⅲ含量呈中等正相关（r分别为0.485和0.60，P分别为0.01和0.02），见图4。
图4LSM与ALP、GGT、肝病理损伤评分、天狼星红染色阳性比例、肝纤维化四项的相关性分析
3 讨论
胆汁淤积性肝纤维化是由胆汁排泄障碍导致肝内胆汁潴留，进而导致肝细胞慢性损伤、肝星状细胞活化及细胞外基质过度沉积的复杂病理过程。胆总管结扎是制备胆汁淤积性肝纤维化的常用经典动物模型，自1984年报道后一直沿用至今[8]。建模成功10 d后，大鼠肝脏重量增加，镜下观察可见汇管区纤维组织增生、相互交织形成纤维网，可延伸至汇管区范围，侵入肝实质，伴随有血清ALP和GGT水平升高[8，10-11]。与已有研究结果一致，本研究在大鼠胆总管结扎后14 d也观察到上述变化。
茵陈蒿汤是《伤寒论》中治疗湿热黄疸的经典方剂，方中茵陈蒿是君药，能清热利湿退黄；栀子为臣药，清三焦湿热，利尿通淋，助茵陈增强退黄效果；大黄为佐药，泻热通便，使湿热从大便排出，兼有活血化瘀，与茵陈蒿、栀子配合使用，可以促进湿热瘀滞的排出[12]。茵陈蒿汤在临床能够明显降低梗阻性黄疸肝胆湿热证术后的炎症因子水平，提高免疫功能及T淋巴细胞亚群水平[13-14]；在常规西医治疗基础上应用茵陈蒿汤合大柴胡汤加减治疗老年急性梗阻性化脓性胆管炎疗效显著，能有效降低患者天门冬氨酸氨基转移酶、血清总胆红素等相关指标水平，改善患者预后[15]；还有实验研究表明，茵陈蒿汤具有调节内质网应激减少阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡、改善肝功能的作用[16]。以上研究主要侧重于梗阻性黄疸所导致的急性肝损伤，本文侧重于研究梗阻性黄疸所导致的慢性肝损伤，所用方剂MYCHD在茵陈蒿汤的基础上加入丹参、白头翁、败酱草、炙甘草，增强活血凉血，清热除湿解毒之功效，观察MYCHD对梗阻性黄疸造成的肝纤维化的疗效。结果发现，MYCHD能降低肝脏系数和血清ALP、GGT水平，减轻肝组织病理损伤，减少血清肝纤维化指标HA、LN、PC-Ⅲ及Col-Ⅳ含量，证实MYCHD对胆汁淤积性肝纤维化具有治疗作用。
肝脏活检被认为是肝纤维化诊断和分期的“金标准”，但有创性，患者接受度较低，因此临床应用受到诸多限制，而多模态超声技术尤其是剪切波弹性成像技术可无创评估和连续监测肝脏纤维化[7，17]。本研究结果显示模型组大鼠的LSM较假手术组显著升高，而经MYCHD治疗后大鼠LSM降低。此外，本研究将LSM与肝脏组织病理损伤、纤维化指标及血清肝纤维化四项指标进行相关性分析，结果发现LSM与ALP和GGT、肝脏组织病理损伤评分、天狼星红染色阳性比例、血清HA及Col-Ⅳ含量呈显著正相关，说明通过超声剪切波弹性成像测得的LSM可反映肝纤维化程度。
综上所述，MYCHD能改善大鼠胆总管结扎诱导的肝纤维化，超声剪切波弹性成像技术作为一种无创检查方法，可用于肝纤维化的动态检测和药物疗效评价。本研究为MYCHD抗肝纤维化及超声剪切波弹性成像技术用于监测肝纤维化进展提供理论支持和依据。但本研究为动物实验，干预时间短且未深入探讨分子机制，结果尚需临床研究中验证；MYCHD的最佳剂量及长期疗效尚需进一步探索。