摘要
目的：探究甘草香豆素（GCM）通过NRF2/HO-1信号轴促进人乳腺癌（BC）细胞铁死亡的机制。方法：采用不同浓度（25、50、75 μmol/L）的GCM与BC细胞（MCF-7或MDA-MB-231）培养24 h，通过CCK-8法、集落形成实验评估GCM对BC细胞增殖的抑制作用，Transwell和划痕实验检测GCM对BC细胞侵袭、迁移的抑制作用，流式细胞术检测GCM对BC细胞凋亡的促进作用，采用试剂盒检测GCM对BC细胞铁死亡相关指标[（Fe2+、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）]的作用，Western blot检测铁死亡相关蛋白水平。结果：与对照组（DMSO）相比，实验组（25、50、75 μmol/L GCM）能显著降低BC细胞增殖，在25、50、75 μmol/L浓度下分别降至80%、73%、63%，并能显著抑制集落形成（均P<0.05）；同时，GCM也能显著抑制BC细胞的侵袭和迁移（均P<0.05）。GCM能显著促进BC细胞凋亡，且凋亡比例随GCM浓度增加而增加（均P<0.01）。随后，各种抑制剂和75 μmol/L GCM共同处理对BC细胞活力的影响最显著的是铁下垂抑制剂Ferrostatin-1（P<0.001）。GCM促进BC细胞中铁死亡相关指标及相关蛋白表达水平，Fe2+、MDA、ROS水平和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）蛋白水平升高，GSH水平和溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）蛋白水平降低（均P<0.05）；此外，GCM促进BC细胞中核因子-E2相关因子2（NRF2）和血红素加氧酶1（HO-1）表达水平（均P<0.05）。结论：GCM通过激活NRF2/HO-1信号轴促进人乳腺癌细胞铁死亡，从而抑制细胞活力、增殖及侵袭迁移。
Abstract
Objective To investigate how glycycoumarin (GCM) promotes ferroptosis in human breast cancer cells via the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2)/heme oxygenase-1 (HO-1) signaling pathway. Methods BC cell lines (MCF-7 and MDA-MB-231) were cultured with different concentrations (25, 50, 75 μmol/L) of GCM for 24 hours, and the inhibitory effect of GCM on the proliferation of BC cells was evaluated by CCK-8 method and colony formation assay. Transwell and wound healing assay were used to detect the inhibitory effect of GCM on invasion and migration of BC cells. Flow cytometry was used to detect the promoting effect of GCM on apoptosis of BC cells. ELISA was used to detect the effect of GCM on ferroptosis-related indexes of BC cells, and Western blot was used to detect the expression of ferroptosis-related proteins. Results Compared with the control group (DMSO), the experimental groups (25, 50, 75 μmol/L GCM) significantly reduced the proliferation of BC cells to 80%, 73%, and 63% at 25, 50, and 75 μmol/L, respectively, and significantly inhibited colony formation (all P<0.05). It also significantly inhibited the invasion and migration of BC cells (both P<0.05). GCM significantly promote the apoptosis of BC cells, and the apoptotic proportion increased with increasing GCM concentration (all P<0.01). After treatment with 75 μmol/L GCM, the most significant effect on the viability of BC cells was observed with Ferrostatin-1 (P<0.001). GCM promoted ferroptosis-related indices and related protein levels in BC cells, and increased Fe2+, malondialdehyde, reactive oxygen species levels and acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 protein levels, and decreased glutathione level, solute carrier family 7 member 11 and glutathione peroxidase 4 protein levels (all P< 0.05). In addition, GCM promoted the expression levels of NRF2 and HO-1 in BC cells (P <0.05). These results suggest that GCM promotes ferroptosis in BC cells by activating NRF2/HO-1 signaling axis. Conclusion GCM promotes ferroptosis of human breast cancer cells by activating NRF2/HO-1 signaling axis, thereby inhibiting cell viability, proliferation, invasion and migration.
Keywords
乳腺癌（breast cancer，BC）是女性恶性肿瘤中发病率最高的癌症类型[1]。它具有高度的异质性和动态的复杂性，给临床管理带来了很大的挑战[2]。因此，进一步阐明与BC进展相关的潜在分子机制具有重要意义。铁死亡是一种铁依赖性非凋亡型细胞死亡过程[3-4]，而靶向铁死亡被认为是一种新的抗癌策略[5-6]。核因子-E2相关因子2（NRF2）是抗氧化反应的主要转录调节因子，调控多种抗氧化蛋白的表达，从而通过降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平发挥其抗氧化作用[7]。NRF2在保护癌细胞免于铁死亡方面的作用已被证实[8]。研究显示甘草香豆素（glycycoumarin，GCM）具有多种生物学活性，包括抗肿瘤[9-11]。此外，药代动力学研究表明，GCM具有良好的口服生物利用度[12]。然而其在BC中的相关研究尚未见报道，需进一步研究来阐明GCM在BC中的潜在调控机制及其与铁死亡的相互作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
MCF-7细胞（CL-0149）和MDA-MB-231细胞（CL-0150）均购自武汉普诺赛生物科技有限公司，甘草香豆素（HY-N4113）、苄氧羰基-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（OMe）-氟甲基酮（Z-VAD-FMK）（HY-16658B）、特异性坏死病抑制剂（necrostatin-1，Nec-1）（HY-15760）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（HY-19312）、3-氨基-4-环己基氨基苯甲酸乙酯（ferrostatin-1，Fer-1）（HY-100579）均购自MedChemExpress，增强型细胞活力检测试剂盒（CCK-8）（E-CK-A362）、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（E-CK-A211）、亚铁比色测定试剂盒（E-BC-K881-M）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（E-BC-K028-M）、谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒（E-BC-K030-M）均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，人活性氧簇（ROS）测定试剂盒（CB10719-Hu）购自上海科艾博生物科技有限公司，山羊抗兔IgG H&L（ab6721，1⁚2000）、SLC7A11（ab307601，1⁚1000）、GPX4（ab125066，1⁚2000）、ACSL4（ab155282，1⁚5000）、NRF2（ab62352，1⁚2000）、HO-1（ab189491，1⁚2000）、GAPDH（ab181602，1⁚2000）均购自上海Abcam公司。流式细胞仪（德国Miltenyi生物技术有限公司）、ABI 7900HT快速实时PCR系统（美国AB公司）、Image J软件（美国国立卫生研究院）、TS100显微镜（日本尼康公司），FACSCalibur系统（美国BD Bioscience公司）。
1.2 细胞培养
将MCF-7和MDA-MB-231细胞分别在含有10%胎牛血清和1%抗生素（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）培养基中培养，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中。
1.3 细胞处理与分组
将MCF-7和MDA-MB-231细胞接种于6孔板中培养24~48 h后，当细胞融合率达到50%~60%时，随机分为4组：对照组（采用GCM溶剂DMSO处理）、25 μmol/L组（采用25 μmol/L GCM处理）、50 μmol/L组（采用50 μmol/L GCM处理）、75 μmol/L组（采用75 μmol/L GCM处理），均处理24 h。
此外，为验证GCM对BC细胞死亡的主要诱导方式，采用75 μmol/L GCM和多种细胞死亡抑制剂（60 μmol/L Z-VAD-FMK、40 μmol/L Nec-1、2 nmol/L 3-MA、2 μmol/L Fer-1）同时处理BC细胞24 h[13]。
1.4 CCK-8检测细胞活力
将4组处理后的细胞悬液接种于96孔板，密度为1×105个/孔。混合均匀后，每孔加入10 µL CCK-8溶液，于37℃含5% CO2培养箱中孵育3 h。培养48 h后，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
1.5 细胞克隆形成实验
将4组处理后的2×102个细胞接种于96孔板，培养14 d，期间3 d更换一次培养基，4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，洗涤后拍照观察克隆形成细胞数量并记录。
1.6 Transwell侵袭实验
小室底部铺上基质胶，置于37℃培养箱中，待完全凝固取出。取各组中的1×104个细胞接种到上室，并加入300 μL不含血清的培养基，下室加入600 μL 10%的FBS。置于37℃培养箱中孵育24 h，用甲醇固定细胞30 min，加入结晶紫溶液染色，显微镜下拍照并记录结果。
1.7 划痕实验
将4组处理后的细胞以2×104个/孔的密度接种于6孔板中，轻轻晃动培养板使细胞均匀分布；将6孔板放入37℃、5% CO2培养箱中培养24～48 h，直至细胞完全融合（汇合度≥95%）；过夜后，取出6孔板，用无菌PBS轻轻冲洗细胞表面2次，去除残留的培养基和脱落细胞；用200 μL无菌吸头在每孔细胞单层中央垂直划一条直线，确保划痕粗细均匀、贯穿整个孔底（同一批次实验使用同一吸头，减少划痕差异），用PBS洗去不贴壁细胞。分别于0 h和24 h在显微镜下拍照。
1.8 AV/PI双染检测细胞凋亡情况
将4组处理后的细胞以2.5×105个/孔的密度接种于6孔板中，用0.25%胰蛋白酶消化离心收集各组细胞，PBS洗涤3次，结合缓冲液重悬细胞。采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
1.9 Fe2+、MDA、GSH和ROS水平检测
采用试剂盒分别检测4组细胞中Fe2+、MDA、GSH和ROS水平。
1.10 RT-qPCR检测NRF2和HO-1 mRNA水平
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA，然后使用High Capacity cDNA反转录试剂盒转录成cDNA。然后，在7900HT快速实时荧光定量PCR系统上使用SYBR®Premix Ex Taq™ II进行qPCR。反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸34 s，共40个循环。实验重复3次，以GAPDH为内参。引物序列：GAPDH（F:AATGGGCAGCCGTTAGGAAA，R:GCGCCCAATACGACCAAATC）、NRF2（F:AGGTTGCCCACATTCCCAAA，R:AGTGACTGAAACGTAGCCGA）、HO-1（F:AGGGAATTCTCTTGGCTGGC，R:GCTGCCACATTAGGGTGTCT）。数据分析采用2−ΔΔCt法。
1.11 Western blot检测SLC7A11、GPX4、ACSL4、NRF2和HO-1蛋白水平
采用细胞裂解液提取细胞总蛋白，用蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白质含量，全程在冰上进行。取蛋白用10％SDS-PAGE进行上样，电泳，然后转移到PVDF膜上，在封闭液中封闭2 h。加入一抗SLC7A11、GPX4、ACSL4、NRF2和HO-1，4℃孵育过夜。洗涤后，与二抗山羊抗兔IgG在室温孵育2 h，以GAPDH作为内参。在避光条件下滴加化学发光试剂显影并进行拍照，通过Image J软件进行蛋白灰度值分析。
1.12 统计学处理
数据采用GraphPad Prism 9.5.0进行统计分析，计量数据经正态性检验均符合正态分布，以均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，进一步组间两两比较采用Tukey’s检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GCM呈剂量依赖性抑制BC细胞活力和增殖
CCK-8检测结果显示：与对照组的细胞活力[（100%±8.23%，100%±8.05%）]比较，GCM以浓度依赖性地降低了BC细胞的活力[25 μmol/L（80.78%±6.30%，72.78%±6.91%）、50 μmol/L（73.34%±6.10%，60.37%±6.07%）、75 μmol/L（63.32%±5.20%，55.80%±6.15%）]，差异有统计学意义（P<0.01，图1A）。细胞克隆形成实验结果显示：与对照组（110.56±9.50，103.56±9.75）细胞相比，GCM以浓度依赖性地降低了BC细胞增殖能力（25 μmol/L（84.96±7.50，76.90±8.71）、50 μmol/L（75.12±6.80，70.60±7.29）、75 μmol/L（62.31±6.10，58.40±6.17），差异有统计学意义（P<0.05，图1B、1C）。
2.2 GCM抑制BC细胞侵袭迁移
Transwell检测结果显示：与对照组（132.36±8.62，125.78±8.11）细胞相比，GCM以浓度依赖性地抑制了BC细胞的侵袭[25 μmol/L（96.28±6.61，91.27±6.13）、50 μmol/L（71.45±5.22，65.26±5.13）、75 μmol/L（50.13±4.35，47.09±4.87）]，差异有统计学意义（P<0.01，图2A、2B）。划痕实验检测结果显示：与对照组（100.87±9.89，103.25±8.72）细胞相比，GCM以浓度依赖性地抑制了BC细胞的迁移[25 μmol/L（80.81%±7.76%，78.23%±6.34%）、50 μmol/L（66.37%±5.25%，63.27%±5.39%）、75 μmol/L（50.88±4.16%，48.22±5.01%）]，差异有统计学意义（P<0.01，图3）。
2.3 GCM对BC细胞凋亡的影响
流式细胞术检测结果发现：与对照组（4.35±0.41，3.90±0.46）相比，GCM能促进BC细胞凋亡[25 μmol/L（7.25±0.71，8.39±0.38）、50 μmol/L（12.36±1.20，13.93±1.42）、75 μmol/L（16.39±1.65，17.35±1.81）]，差异有统计学意义（P<0.01，图4）。
2.4 GCM促进BC细胞铁死亡
GCM显著抑制BC细胞的活力（75 μmol/L（35.60±3.20，38.91±4.14）），且这种作用被2 μmol/L铁下垂抑制剂Fer-1（73.96±5.20，75.23±7.98）逆转，差异有统计学意义（P<0.05，图5）。
2.5 GCM对BC细胞Fe2+、MDA、ROS及GSH水平的影响
GCM升高了BC细胞中Fe2+、MDA和ROS水平，降低了细胞中GSH水平，差异有统计学意义（P<0.05，图6）。Western blot检测结果发现GCM升高了BC细胞中ACSL4水平，降低了细胞中SLC7A11和GPX4水平，差异有统计学意义（P<0.05，图7）。
图1GCM呈剂量依赖性地抑制BC细胞活力和增殖能力
图2各组MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的侵袭能力比较
图3各组MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的迁移能力比较
图4各组MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的凋亡水平比较
2.6 GCM通过介导NRF2/HO-1信号轴促进BC细胞铁死亡
qRT-PCR检测结果显示，GCM能呈剂量依赖性地升高BC细胞中NRF2和HO-1 mRNA水平，差异有统计学意义（P<0.01，图8A-B）。Western blot检测结果显示，GCM升高了BC细胞中NRF2和HO-1蛋白表达水平，差异有统计学意义（P<0.05，图8C-E）。
图5GCM促进BC细胞铁死亡
图6GCM对BC细胞Fe2+、MDA、ROS、GSH水平的影响
图7Western blot检测铁死亡相关蛋白SLC7A11、GPX4和ACSL4代表性免疫印记图及定量分析
图8各组NRF2和HO-1 mRNA水平及蛋白表达水平比较
3 讨论
天然植物提取物是抗肿瘤药物的重要来源，其化学结构和生物活性具有多样，而且与化学合成药物相比，其总体毒性和副作用较低[14]。本研究发现了一种天然化合物GCM在BC细胞中表现出抗肿瘤活性，其机制可能通过激活NRF2-HO-1信号通路诱导铁死亡。
铁过量通过Fenton反应生成ROS促进铁死亡，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）依赖性脂质过氧化和还原型谷胱甘肽（GSH）耗竭在铁死亡诱导中起关键作用[15]。本实验结果表明，在GCM处理的BC细胞中，ROS、MDA及不稳定亚铁离子水平升高，而GSH水平降低。同时，本研究还发现GCM处理的BC细胞，SLC7A11与GPX4表达降低，而ACSL4表达水平升高。结果证实GCM诱导的铁死亡有助于促进BC细胞死亡的能力。
HO-1是一种内质网锚定蛋白，可将血红素代谢成促氧化亚铁，HO-1高表达是铁死亡的重要正调控因子[16-17]。HO-1可加速HT-1080纤维肉瘤细胞中erastin诱导的铁死亡，也可介导BAY 11-7085诱导的乳腺癌细胞铁死亡[18-19]。醉茄素A也可通过诱导HO-1高表达来诱导神经母细胞瘤的铁死亡[20]。本研究表明GCM可诱导HO-1高表达，导致乳腺癌细胞铁积累和铁死亡。因此，GCM主要通过激活NRF2-HO-1通路促进乳腺癌细胞铁死亡的作用。
NRF2作为维持细胞内氧化还原稳态的重要调节因子，能够减少ROS引起的细胞损伤，维持细胞氧化还原稳态[21-24]。正常生理状态下，NRF2主要存在于细胞质中且维持低水平；当接受外界刺激时，可激活下游分子HO-1，发挥抗炎作用。研究表明NRF2活化可抑制ROS的产生[25-26]。近年研究表明，MAPK家族（ERK/JNK/p38）是NRF2的重要上游调控因子[27]。抑制ERK1/2激活显著减弱Nrf2表达和核转移，进而影响BC细胞的迁移和侵袭[28]。此外，激活PI3K/AKT信号通路或抑制MAPK可导致Nrf2表达升高，增强BC细胞的增殖和转移[29-30]。本研究结果显示：GCM通过激活NRF2-HO-1信号通路促进BC细胞铁死亡的作用。提示GCM在BC细胞中，可能通过激活ERK1/2、PI3K/Akt信号通路或抑制MAPK促进NRF2磷酸化，进而增强NRF2核转位及HO-1表达，最终促进BC细胞铁死亡。
综上所述，本研究表明铁死亡可能是GCM促进BC细胞死亡的主要机制，且GCM通过激活NRF2-HO-1通路来抑制ROS产生，从而促进铁死亡。本研究的主要局限在于：1）仅在细胞水平验证抗肿瘤机制，缺乏体内验证；2）未系统研究GCM与其他抗癌药物的协同作用，未涉及制剂改良研究，后续研究将聚焦体内验证、协同优化和制剂改良展开，为GCM的临床转化奠定坚实基础。 GCM可通过调控多通路相互作用网络，与化疗、靶向治疗和免疫药物在乳腺癌中形成“机制互补、效应放大”的协同作用。尽管GCM具有抗乳腺癌潜力，但作为天然活性成分，临床转化面临生物利用度低、潜在毒性风险和靶点特异性不足三大挑战，这些是天然产物抗肿瘤研究的共性挑战，可通过制剂优化（如纳米载体）、结构修饰和个体化给药策略等策略来解决。