摘要
目的：探讨右美托咪定是否通过调节肠道菌群/氧化三甲胺（TMAO）信号改善脓毒症相关性脑病（SAE）症状。方法：54只成年雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、SAE组、右美托咪定干预（SD）组。SAE组和SD组采用盲肠结扎穿孔（CLP）法建立脓毒症模型，假手术组仅行开腹手术，SD组于CLP术前1 h经尾静脉注射右美托咪定5 μg/kg。CLP术后24 h，采用新物体识别实验（认知指数）和旷场实验（中央区活动路程及时间）评估认知功能，伊文思蓝（EB）外渗法检测血脑屏障损伤程度，苏木素-伊红（HE）染色法检测海马区病理学损伤程度，Western blot法检测海马区神经损伤诱导蛋白1（NINJ1）的表达水平，通过16S rRNA基因测序检测肠道菌群Chao1指数和Shannon指数并进行主成分分析（PCA）和主坐标分析（PCoA），采用ELISA法检测粪便、血清及海马组织中的TMAO水平。结果：与假手术组比较，SAE组小鼠中央区活动路程和活动时间显著减少、认知指数显著降低，海马区病理学损伤明显加重，血管外EB渗出量和NINJ1蛋白表达水平显著升高，肠道菌群Chao1指数和Shannon指数显著降低，PCA与PCoA分析显示样本间距离较远，粪便、血清及海马组织中TMAO水平显著升高。与SAE组比较，SD组小鼠的中央区活动路程和活动时间增加、认知指数升高，海马区病理学损伤程度减轻，血管外EB渗出量和NINJ1蛋白表达水平降低，肠道菌群Chao1指数和Shannon指数升高，PCA与PCoA分析显示样本间距离集中，粪便、血清及海马组织中TMAO水平降低。结论：右美托咪定可显著改善SAE，其机制可能与上调肠道菌群的α与β多样性以及下调TMAO有关。
Abstract
Objective To investigate whether dexmedetomidine ameliorates sepsis-associated encephalopathy (SAE) by interfering with gut microbiota/trimethylamine N-oxide (TMAO) signaling. Methods Fifty-four adult male C57BL/6J mice were randomly divided into three groups: sham, SAE and dexmedetomidine intervention (SD). SAE and SD groups underwent cecal ligation and puncture (CLP) to establish sepsis model, while sham group received laparotomy only. SD group received an intravenous injection of dexmedetomidine (5 μg/kg) via tail vein 1 h before CLP. At 24 h post-CLP, cognitive function was assessed using the novel object recognition test (cognitive index) and the open field test (distance and time spent in the center). The extent of blood-brain barrier damage was evaluated using Evans blue (EB) extravasation. Hippocampal pathological injury was examined by hematoxylin-eosin (HE) staining. Western blot was used to measure protein expression of Ninjurin-1 (NINJ1) in hippocampus. 16S rRNA sequencing was performed to determine Chao1 index, Shannon index, and to conduct Principal Component Analysis (PCA) and Principal Coordinates Analysis (PCoA) of gut microbiota. TMAO levels in feces, serum, and hippocampal tissue were detected by ELISA. Results Compared with sham group, SAE group showed a significant decrease in the distance moved and time spent in the center, a significantly lower cognitive index, evident hippocampal pathological injury, increased EB extravasation and NINJ1 expression, reduced gut microbiota Chao1 and Shannon indices, distinct clustering in PCA and PCoA, and elevated TMAO levels in feces, serum, and hippocampal tissue. Compared with S group, SD group exhibited increased distance and time in the center, an elevated cognitive index, alleviated hippocampal pathological injury, reduced EB extravasation and NINJ1 expression, increased Chao1 and Shannon indices, more concentrated clustering in PCA and PCoA, and decreased TMAO levels in feces, serum, and hippocampal tissue. Conclusion Dexmedetomidine significantly improves SAE whose mechanism may be associated with the upregulation of gut microbiota α and β diversity and the downregulation of TMAO expression.
Keywords
脓毒症相关性脑病（sepsis associated encephalopathy，SAE）是脓毒症患者的严重并发症之一，表现为记忆与语言能力缺陷甚至昏迷，严重威胁患者生命[1]，目前，SAE的病理生理机制尚未完全阐明，缺乏有效的治疗手段。“肠-脑轴”是肠道与大脑之间复杂的双向通信系统，而肠道菌群及其代谢产物是这一信号轴的核心环节[2]。有研究证实脓毒症状态下肠道菌群严重失调，肠屏障功能受损，导致大量菌群代谢产物进入循环系统，其中氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）是一种致病性肠菌代谢产物[3]，其水平升高与脓毒症患者的严重程度及不良预后密切相关[4]，并在神经认知障碍相关疾病中发挥重要作用[5]。研究均表明右美托咪定可有效提高脓毒症动物的生存率并减轻多器官损伤[6]。然而，右美托咪定对SAE保护作用的具体分子机制以及肠道菌群/TMAO是否在其中扮演关键角色仍不清楚。本研究通过建立SAE小鼠模型，探讨肠道菌群及TMAO在右美托咪定改善SAE中的作用，以期为临床SAE的防治提供新的理论依据和潜在靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
选取健康、成年、雄性、SPF级C57BL/6J小鼠54只，体质量20~25 g（北京维通利华实验动物技术有限公司）。本研究经南开大学动物伦理委员会审批（审批号：2021-SYDWLL-000190），所有实验操作均严格遵守动物实验伦理规范。
1.1.2 主要药物与试剂
右美托咪定（江苏扬子江药业集团有限公司），肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β的ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；TMAO的ELISA试剂盒购自上海通蔚实业有限公司，兔抗神经损伤诱导蛋白1（nerve injury-induced protein 1，NINJ1）一抗购自武汉缔码生物科技有限公司。
1.1.3 主要仪器设备
正置光学显微镜（德国Leica公司）；高速低温离心机（日本Kubota公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；SDS-PAGE凝胶电泳系统及全自动凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组与给药
将54只小鼠按照随机数字表法分为三组：假手术组、SAE组、右美托咪定干预（SD）组，每组18只。SD组于造模前1 h经尾静脉注射右美托咪定5 μg/kg；假手术组和SAE组注射等量生理盐水。
1.2.2 模型制备
利用盲肠结扎穿孔（cecum ligation and puncture，CLP）法制备脓毒症模型[7]：小鼠于术前12 h禁食，自由饮水；腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，仰卧位固定，备皮并消毒，腹中线开腹，探查盲肠，于远段1/3处结扎，20 G针头贯通穿孔1次，挤出少量肠内容物，将盲肠及内容物还纳，缝合腹壁切口。假手术组除不进行CLP外，其余操作同上。SD组于CLP术前1 h经尾静脉注射右美托咪定5 μg/kg，给药后监测心率（HR）、平均动脉压（MAP）30 min，确认MAP降幅＜20%、HR降幅＜30%，血流动力学稳定。三组术后均皮下注射36℃生理盐水1 mL进行复苏，待自然苏醒后回笼饲养。
1.2.3 新物体识别实验
实验开始前2 d为适应期，每天将小鼠放入新物体识别装置中自由活动10 min。适应期结束后进行训练：在箱内对称放置两个相同物体，将小鼠从中间位置放入，自由探索10 min；探索时间指鼻部距物体≤1 cm时朝向或触碰物体的累计时长。训练结束3 h后，将其中一物体换为形状、颜色不同但体积相近的新物体，位置不变，小鼠再次探索10 min，全程摄像记录。计算认知指数=T1/（T1+T2）×100%，其中T1为新物体探索时间；T2为旧物体探索时间。
1.2.4 旷场实验
CLP术后第3天，小鼠度过急性期，状态趋于稳定，进行旷场实验以评估焦虑样行为与自主活动。将小鼠放入不透明旷场箱（100 cm×100 cm×100 cm），自由探索10 min。箱底均分为16格，中央4格为中心区，其余为外周区。红外摄像系统全程记录运动轨迹，分析其在中央区的运动路程与停留时间。
1.2.5 海马区病理学特征测定
术后24 h，各组随机选取3只小鼠，行为学实验后，取脑组织置于4%多聚甲醛中固定48 h，随后进行梯度脱水、透明、浸蜡、包埋并切片，行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，于正置光学显微镜下观察脑组织海马区的病理学形态变化。
1.2.6 伊文思蓝（evans blue，EB）外渗法检测血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性
术后24 h，各组随机选取3只小鼠，经尾静脉注射2%浓度的EB溶液3 mL/kg。扩散2 h后取大脑皮质，称重后匀浆，用分光光度计检测上清液在625 nm处的光密度（optical density，OD）值。根据线性标准曲线，计算各样本的EB含量。
1.2.7 Western blot法检测NINJ1蛋白表达
术后24 h，各组随机取3只小鼠海马组织，加RIPA裂解液研磨，4℃以12 000 r/min离心20 min，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度。样品经10% SDS-PAGE电泳分离后，湿转至PVDF膜；室温封闭2 h，加入一抗（NINJ1 1∶500，β-actin 1∶2000）4℃孵育过夜，加入二抗（1∶2000）室温孵育2 h；洗涤后加入ECL发光液，使用凝胶成像系统采集信号，使用Image J分析灰度值。以NINJ1蛋白/β-actin灰度比值表示相对表达量。
1.2.8 16S rRNA扩增子测序分析
术后24 h，各组随机取3只小鼠新鲜粪便，提取DNA，扩增16S rRNA V3-V4区；对产物进行纯化，构建测序文库，质检合格后进行Illumina测序。优质序列聚类为（operational taxonomic units，OTUs），经Greengenes数据库比对注释，进行α多样性与β多样性分析。通过16S rRNA基因测序检测肠道菌群Chao1指数和Shannon指数并进行主成分分析（PCA）和主坐标分析（PCoA）。
1.2.9 ELISA法检测TMAO含量
术后24 h，各组随机取3只小鼠，分别采集适量新鲜粪便、外周血血清和海马组织，冰上匀浆，4℃静置30 min后离心10 min（4000 r/min，离心半径10 cm），收集上清。参照试剂盒说明书，使用酶标仪检测上清中TMAO水平。
1.3 统计学分析与处理
实验数据以均数±标准差（）表示，并使用GraphPad Prism 10软件进行统计学分析。对于符合正态分布的计量资料，组间比较使用单因素方差分析，设定P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 右美托咪定对小鼠认知功能的影响
与假手术组比较，SAE组小鼠的中央区运动路程和中央区活动时间缩短，认知指数降低至小于50%，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAE组比较，SD组小鼠的中央区运动路程和中央区活动时间延长，认知指数升高至接近50%，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1三组小鼠的中央区活动路程、中央区活动时间和认知指数比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与SAE组比较，P<0.05
2.2 右美托咪定对海马区病理学损伤的影响
光镜下，假手术组小鼠的海马CA1区锥体细胞形态规则，排列整齐，核仁清晰，细胞质丰富；与假手术组比较，SAE组小鼠的海马CA1区的锥体细胞皱缩变性，细胞间距增大，染色加深，嗜碱性增强，胞质与胞核分界不清，部分细胞变化明显；与SAE组比较，SD组小鼠的海马CA1区的病理学异常形态有所改善，见图1。
图1三组小鼠海马区病理学损伤情况（HE染色，×400）
2.3 右美托咪定对BBB的影响
与假手术组比较，SAE组小鼠的EB外渗量显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAE组比较，SD组小鼠的EB外渗量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2三组小鼠的EB外渗量和NINJ1蛋白表达水平的比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与SAE组比较，P<0.05
2.4 右美托咪定对NINJ1蛋白表达的影响
与假手术组比较，SAE组小鼠海马组织中的NINJ1蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAE组比较，SD组小鼠的NINJ1蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表2，图2。
图2Western blot法测定小鼠海马组织中NINJ1的蛋白表达情况
2.5 右美托咪定对肠道菌群α多样性和β多样性的影响
与假手术组比较，SAE组小鼠肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAE组比较，SD组小鼠肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。PCA分析和PCoA分析显示假手术组与SAE组的肠道菌群分布明显分离、距离较远，而SD组和假手术组的肠道菌群分布距离明显接近，见图3
表3三组小鼠肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数的比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与SAE组比较，P<0.05
图3三组小鼠肠道菌群的PCA分析和PCoA分析反映肠菌β多样性水平变化
2.6 右美托咪定对TMAO水平的影响
与假手术组比较，SAE组小鼠新鲜粪便、血清和海马组织中的TMAO表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与SAE组比较，SD组小鼠新鲜粪便、血清和海马组织中的TMAO表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。
表4三组小鼠的新鲜粪便、血清和海马组织中TMAO表达水平比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与SAE组比较，P<0.05
3 讨论
SAE作为脓毒症常见的中枢神经系统并发症，其发病机制复杂，涉及全身炎症反应、氧化应激、BBB破坏及神经元损伤等多个环节[8]，目前尚无特效防治策略。本研究通过CLP成功模拟了SAE的病理过程，并从“肠-脑轴”视角探讨了右美托咪定的神经保护效应及其潜在机制。结果显示，SAE小鼠表现出明显认知功能障碍、BBB完整性受损、海马组织病理学损伤及NINJ1蛋白表达上调，并伴有肠道菌群失调和TMAO水平升高[9]。而右美托咪定可有效逆转上述异常，其保护效应可能与重塑肠菌结构、增强菌群多样性，进而抑制TMAO信号通路有关[10]。
首先，本研究的行为学和病理学结果证实右美托咪定对SAE的改善作用。旷场实验中，SAE组小鼠中央区活动路程与时间显著减少，反映了其焦虑样行为和精神状态的改变，这与脓毒症导致的快感缺乏和探索欲望下降相符。新物体识别实验中，认知指数的降低则直接证明了CLP术后24 h已出现明显的认知与记忆损伤[11]。经右美托咪定干预后，上述指标均得到显著改善，这与右美托咪定已知的镇静与抗焦虑特性及其在危重症患者中改善谵妄的临床观察相一致[12]。组织学上，HE染色显示右美托咪定减轻了海马区的病理损伤，EB外渗实验证实其保护了BBB的完整性。重要的是，本研究发现右美托咪定显著抑制了海马区NINJ1的表达。NINJ1是一种介导细胞膜破裂和炎症性细胞死亡的关键蛋白，其上调与多种神经退行性疾病及脑损伤密切相关[13]。这表明，NINJ1可能参与SAE的神经元损伤过程，而右美托咪定通过抑制NINJ1的表达，可能阻断由此引发的神经炎症放大效应，这为理解右美托咪定的神经保护机制提供了新的分子视角。
本研究的核心在于将右美托咪定的保护作用与“肠-脑轴”紧密联系起来。肠道菌群作为“肠-脑轴”通信的核心枢纽[14]，对维持或改变脑生理功能至关重要。16S rRNA测序结果显示，SAE小鼠肠道菌群的α多样性（如Chao1指数和Shannon指数）显著降低，表明菌群物种丰富度和均匀度下降；β多样性分析（如PCA和PCoA）则显示菌群整体结构发生了显著偏移，表明脓毒症导致了肠道微生态的严重失调[15]。右美托咪定干预后，肠道菌群的α多样性和β多样性均显著恢复，表明其可显著改善肠道微生态紊乱。右美托咪定已被证实具备确实的抗炎与交感神经抑制作用[16]，可有效改善脓毒症导致的肠缺血、炎症及蠕动异常，为有益菌群生长创造了更有利的微环境，这些效应可能是右美托咪定能够重塑肠道菌群平衡的潜在机制。
基于肠道菌群的变化，本研究进一步追踪了其下游关键代谢产物TMAO的水平。TMAO是肠道菌群的有害代谢产物，已被证实能够促进多种认知功能障碍疾病的发生与进展[17]。本研究发现，在SAE模型中，TMAO的水平不仅在粪便和血清中升高，甚至在海马组织中也显著积聚，提示肠道源性的TMAO可能突破了受损的BBB，直接进入中枢神经系统发挥作用[18]；而脓毒症引起的TMAO高表达能够被右美托咪定显著抑制，提示右美托咪定对肠道菌群代谢产物具有确切的调节作用，其机制可能是通过减少产TMAO病原菌的数量或比例，从而从源头上减少TMAO的生成，这体现在粪便、血清和海马组织TMAO水平的同步下降[19]。下调的TMAO信号可能减轻了对BBB和神经元的攻击，从而构成了右美托咪定发挥脑保护作用的一条关键通路。然而，TMAO具体通过何种分子机制作用于海马神经元和BBB，仍需在细胞层面进行更深入的探索。上述结果表明，右美托咪定在改善SAE过程中，伴随有肠道菌群多样性恢复与TMAO水平下降，提示其保护作用可能与调节肠‑脑轴有关，但仍需进一步开展实验验证其因果联系。
综上所述，本研究初步揭示了右美托咪定干预后SAE小鼠在行为学、病理学、菌群与代谢产物层面的整体改善趋势，为“肠‑脑轴”参与SAE的发病与干预提供了表型证据。然而，本研究仍存在一定局限性。首先，尽管观察到右美托咪定干预后肠道菌群多样性得以改善与TMAO水平下降，且与神经行为学改善同步发生，但这些发现仅为相关性结果，尚不能直接证明肠道菌群及其代谢产物TMAO为右美托咪定发挥脑保护作用的必要介质。其次，本研究未对肠道菌群的具体组成变化进行深入分析，未能明确哪些菌属的变化与TMAO生成及神经炎症密切相关。后续研究可通过粪菌移植实验、抗生素预处理清除肠道菌群，或外源性补充TMAO等方式，进一步验证肠道菌群/TMAO轴在右美托咪定改善SAE中的因果作用。