摘要
目的：探讨改良生肌玉红膏通过AGEs/RAGE/PI3K/AKT通路调控巨噬细胞极化，促进糖尿病足溃疡（DFU）愈合的机制。方法：将40只SD雄性大鼠随机分为空白组（n=8）和糖尿病大鼠（n=32），糖尿病大鼠采用链脲佐菌素（STZ）诱导制备糖尿病模型并致创形成DFU模型，成模后随机分为模型组、西药组（含银藻酸盐敷料组）、原方生肌玉红膏组、改良生肌玉红膏组，每组8只。采用HE染色观察大鼠创面组织形态，CD86、CD206免疫组化检测创面M1/M2巨噬细胞变化情况；ELISA法检测创面组织中白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-4、IL-10，精氨酸酶-1（Arg-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）浓度，Western blot检测大鼠溃疡创面组织晚期糖基化终末产物（AGEs）、晚期糖基化终末产物受体（RAGE）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）蛋白表达水平。结果：改良生肌玉红膏组巨噬细胞由M1向M2极化较模型组更明显（P<0.05）。与模型组及原方生肌玉红膏组相比，改良生肌玉红膏组DFU大鼠创面组织IL-1β、IL-6、MMP-9蛋白表达均降低（P<0.05），IL-4、IL-10、Arg-1的表达均升高（P<0.05）。空白组与改良生肌玉红膏组AGEs表达差异无统计学意义（P>0.05），模型组及西药组的AGEs表达高于空白组（P<0.05）。与模型组相比，改良生肌玉红膏组AGEs、RAGE和p-AKT明显下降（P<0.05），与西药组相比，改良生肌玉红膏组AGEs、PI3K和p-AKT明显下降（P<0.05）。与原方生肌玉红膏组相比，改良生肌玉红膏组p-AKT明显下降（P<0.05）。结论：改良生肌玉红膏可促进DFU愈合，其机制可能与通过AGEs/RAGE/PI3K/AKT信号通路调控巨噬细胞极化，改善DFU炎症状态有关。
关键词
Abstract
Objective To explore the mechanism of modified Shengji Yuhong ointment in promoting the healing of diabetes foot ulcer (DFU) based on animal experiments. Methods Forty male SD rats were randomly divided into blank group (n=8) and diabetes group (n=32). Record the changes in wound size of each group of rats during the experiment. HE staining was used to observe the morphology of rat wound tissue, and CD86 and CD206 immunohistochemistry were used to detect changes in M1/M2 macrophages in the wound; ELISA was used to detect the concentrations of IL-1β, IL-6, IL-4, IL-10, Arg-1, and MMP-9 in wound tissues, and Western blot was used to detect the expression of AGEs-RAGE-PI3K-AKT protein in rat ulcer wound tissues. Results Modified Shengji Yuhong ointment can reduce the concentrations of IL-1β, IL-6, and MMP-9 in ulcer tissue of DFU rats, increase the concentrations of IL-4, IL-10, and Arg-1, significantly reduce the inflammation of ulcer wounds in DFU rats, regulate the polarization of M1/M2 macrophages and the expression of AGEs, RAGE, PI3K, and AKT proteins in ulcer wounds. Conclusion The modified Shengji Yuhong ointment can promote the healing of DFU, and its mechanism may be related to regulating macrophage polarization and improving the inflammatory state of DFU through the AGEs/RAGE/PI3K/AKT signaling pathway.
糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者由于下肢远端神经病变和（或）不同程度的血管病变，导致足部溃疡和（或）深部组织破坏，伴或不伴足部感染，是糖尿病患者截肢、致残甚至死亡的主要原因[1]。在中国，超过19%的DFU患者最终截肢，截肢术后5年病死率近40%[2]，带来沉重的社会经济负担[3]。明代陈实功《外科正宗》中记载的生肌玉红膏具有祛腐敛疮、活血生肌的作用，临床上广泛用于各种创面的治疗。针对DFU的创面特点，经减毒增效改良的传统生肌玉红膏治疗DFU疗效显著。改良生肌玉红膏作为治疗DFU的临床改良方，更具针对性且疗效更佳，但其促进DFU愈合的作用机制尚未明确。本研究基于晚期糖基化终末产物（AGEs）/晚期糖基化终末产物受体（RAGE）/磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路，并通过动物实验验证，探讨改良生肌玉红膏促进DFU愈合的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选取SPF级雄性SD大鼠40只，10~14周龄，体质量350~500g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司[动物合格证：SCXK（京）2023-0053]。大鼠普通饲料、糖尿病饲料均由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供[饲料合格证：SCXK（京）2024-0001]。本研究由中国中医科学院西苑医院伦理委员会审批通过（批准号：2022XLA152-2）。
1.2 实验药物
生肌玉红膏由当归、白芷、血竭、紫草、轻粉和甘草组成。改良生肌玉红膏由当归、白芷、血竭、紫草、黄柏和甘草组成，辅以蜂蜡和麻油制成膏剂，由中国中医科学院西苑医院制剂室制作。含银藻酸盐敷料由山东威高药业股份有限公司生产（批号：20240325WG01）。
1.3 实验试剂与仪器
白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-4、IL-10 ELISA试剂盒（北京欣博盛生物科技有限公司，批号分别为R240802-007a、R240601-003a、R240705-002a、R241010-010a），Arg-1抗体（北京华英生物技术研究所，批号20241010），MMP-9 ELISA试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20241016），AGEs抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-1158r），RAGE抗体（GeneTex，批号GTX23611），PI3K抗体（成都正能生物技术有限责任公司，批号GTX132597），AKT抗体（美国CST公司，批号4060S）。DR-200BS酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司），Power Pac电泳仪/半干转印槽（美国Bio-Rad有限公司），Mini P-4电泳槽/湿转转印槽（北京凯元信瑞仪器有限公司），OI-X6 Touch化学发光成像仪（广州光仪生物科技有限公司）。
1.4 实验方法
1.4.1 动物造模、分组干预及取材
实验大鼠适应性喂养1周后，随机取32只大鼠采用高糖高脂饲料结合20%蔗糖水自由饮用喂养4周。将150 mg链脲佐菌素（STZ）溶于10 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH值4.4）中，配成15 g/L的STZ溶液。按50 mg/kg一次性腹腔注射。72 h后，以大鼠空腹尾静脉血糖＞16.65 mmol/L为糖尿病模型构建成功。将32只成模大鼠分为模型组、西药组（含银藻酸盐敷料组）、原方生肌玉红膏组、改良生肌玉红膏组，每组8只。剩余8只大鼠为空白组，用普通饲料喂养4周后，自腹腔一次性注射不含STZ的0.1 mol/L、pH值4.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在糖尿病大鼠造模成功后1周，自腹腔注射4%水合氯醛麻醉，在所有大鼠的腰背部取2.0 cm×2.0 cm正方形区域，使用脱毛剂脱毛。切除皮肤及皮下组织至浅筋膜，形成缺损性创面。每天用50%冰醋酸涂抹创面1次，1周后形成DFU大鼠模型。然后于大鼠颈部粘贴实验鼠专用伊丽莎白圈，防止其舔舐、啃咬创面。
空白组和模型组大鼠创面用凡士林油纱外敷，西药组外敷含银藻酸盐敷料，原方生肌玉红膏组予生肌玉红膏纱布外敷，改良生肌玉红膏组予改良生肌玉红膏纱布外敷。每间隔1天换药1次，共换药7次。
致创后第14天，局部麻醉各组大鼠，切取大鼠溃疡中心部位创面皮肤组织，修剪为4 mm×5 mm（约1 g）大小。将其均分成4份，分别进行HE染色、免疫组化、ELISA及Western blot检测。
1.4.2 溃疡创面组织HE染色形态学观察及免疫组织化学检测
将取材的创面组织样本用10%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色，于光学显微镜下随机选取视野拍照，观察创面组织结构变化、毛细血管增生及炎症细胞浸润情况。
应用免疫组织化学方法检测各组大鼠创面样本组织CD86（M1型巨噬细胞标志物）和CD206（M2型巨噬细胞标志物）。苏木素将细胞核染为蓝色，DAB显色阳性表达为棕黄色。使用HPIAS-100高清晰度彩色病理图像分析系统观察免疫组化结果。根据染色强度和阳性细胞百分比计算M1（CD86）、M2（CD206）巨噬细胞及M1/M2巨噬细胞（CD86/CD206）比值并评估巨噬细胞变化情况。
1.4.3 ELISA检测创面组织炎症因子水平
取创面组织样本剪碎，称重后以质量︰裂解液体积=1︰5的比例加入预冷的裂解液。使用匀浆机粉碎制成创面组织匀浆，以3000 r/min离心10 min，取上清检测如下指标：采用酶联免疫双抗体夹心法测定MMP-9（于450 nm波长处测定吸光度值）；采用酶联免疫吸附法测定IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10（于450 nm波长处测定吸光度值）；采用比色法测定Arg-1（精氨酸在碱性介质中与甲萘酚和次氯酸钠生成红色物质，于525 nm波长处测定其吸光度，据此计算精氨酸含量）。
1.4.4 Western blot检测大鼠溃疡创面组织AGEs、RAGE、PI3K及AKT蛋白的表达
取创面样本组织剪碎，称重后以质量：裂解液体积=1︰9的比例加入预冷的RIPA裂解缓冲液，匀浆、离心后提取上清液获得组织蛋白。将蛋白样品与BCA工作液按1︰8比例混匀，于37℃孵育30 min。使用酶标仪于570 nm波长处读取光密度（OD）值并计算组织蛋白浓度。用RIPA裂解液调整蛋白浓度，样品终浓度为2 μg/μL。每个条带加载20 μg的蛋白质样品，经SDS-PAGE电泳、转膜后，染色并观察转膜效果。按照抗体说明书，加入稀释的AGEs、RAGE、PI3K、AKT一抗（1︰1000），于4℃孵育过夜；洗膜后，加入二抗（1︰10 000），室温孵育40 min；用TBST洗膜6次，每次3 min。将膜放在成像仪的托盘上，滴加ECL发光液，拍摄生成图片。曝光后的胶片直接扫描，用Image J软件将图片由JPEG格式转为TIFF格式，采用Total Lab Quant V11.5软件读取条带的积分光密度（IOD）值。
1.5 统计学分析
采用R语言进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用箱线图展示结果，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 创面组织细胞形态学观察
HE染色显示，模型组炎性细胞渗出较明显，表皮残缺模糊、细胞排列混乱。相比于模型组，原方生肌玉红膏组炎性细胞渗出减少，毛细血管增生明显。改良生肌玉红膏组表皮连续且完整，炎性细胞渗出明显减少，毛细血管增生少于西药组和原方生肌玉红膏组，真皮层可见较多胶原纤维沉积，见图1。
图1各组大鼠创面组织细胞形态学结果（HE染色，×200）
2.2 免疫组织化学检测结果
各组M1巨噬细胞（CD86）差异无统计学意义（P>0.05）。与空白组相比，M2巨噬细胞（CD206）在模型组和西药组中表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，改良生肌玉红膏组M1与M2巨噬细胞的比值（CD86/CD206得分）降低，差异有统计学意义（P<0.05），巨噬细胞由M1向M2极化明显，见图2、3。
图2各组大鼠创面免疫组化CD86、CD206检测（×200）
图3各组大鼠创面免疫组化检测结果比较
2.3 创面组织中IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、Arg-1及MMP-9表达水平
ELISA检测结果显示，与空白组相比，模型组大鼠创面肉芽组织中IL-1β、IL-6、MMP-9含量升高，IL-4、IL-10、Arg-1含量下降（P<0.05）。与模型组相比，各给药组IL-1β、IL-6、MMP-9含量下降（P <0.05），而IL-4、IL-10、Arg-1含量升高（P<0.05）。与西药组相比，原方生肌玉红膏原方组IL-1β、IL-6、MMP-9含量升高，IL-4、IL-10、Arg-1含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与原方生肌玉红膏组相比，改良生肌玉红膏组IL-1β、IL-6、MMP-9含量下降，IL-4、IL-10、Arg-1含量升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1各组大鼠创面组织炎症因子水平比较
注：a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与西药组比较，P<0.05；d与原方生肌玉红膏组比较，P<0.05
2.4 大鼠DFU创面组织AGEs、RAGE、PI3K及AKT蛋白质表达水平
与空白组相比，模型组、西药组、原方生肌玉红膏组和改良生肌玉红膏组RAGE、PI3K和p-Akt蛋白表达水平均升高（P<0.05）；模型组、西药组、原方生肌玉红膏组AGEs蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），而改良生肌玉红膏组AGEs蛋白表达升高差异无统计学意义（P>0.05）。与模型组相比，改良生肌玉红膏组AGEs、RAGE和p-Akt蛋白表达水平降低（P<0.05）。与西药组相比，改良生肌玉红膏组AGEs、PI3K和p-Akt蛋白表达水平降低（P<0.05）。与原方生肌玉红膏组相比，改良生肌玉红膏组p-Akt表达水平降低（P<0.05），见图4、5。
3 讨论
DFU是糖尿病最严重的并发症之一，严重时可导致感染、愈合延迟甚至截肢。在我国，DFU的年发病率为8.1%，其复发率和截肢率均较高[4-5]。DFU在中医属“脱疽”范畴，中医药治疗“脱疽”历史悠久。中药单味药及复方通常含多种成分，可作用于多个靶点，产生协同效应，从而提高DFU愈合率[6]。生肌玉红膏的功效为祛腐敛疮、活血生肌，临床广泛应用于各类创面治疗。传统生肌玉红膏含轻粉，其主要成分为氯化亚汞，长期小剂量外用可致全身毒性，尤以肾、肝及神经毒性显著[7]。DFU常需长期换药，故存在汞中毒风险。此外，DFU中医局部辨证多属湿热证。针对上述特点，去除原方中有毒的轻粉，加入具清热燥湿、抗菌抑菌之效的黄柏，制成改良生肌玉红膏，以期减毒增效，临床应用显示其疗效显著。
图4各组大鼠创面组织中AGEs、RAGE、PI3K、p-AKT蛋白表达情况
图5各组大鼠创面组织中AGEs、RAGE、PI3K、p-AKT蛋白表达水平比较
改良生肌玉红膏中含有槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山萘酚等有效活性成分。槲皮素是天然的抗氧化剂，具有抗炎、抗糖尿病的作用[8]，可增强肉芽组织生长、上皮再生、胶原沉积，从而促进DFU愈合[9]。β-谷甾醇可促进糖尿病伤口中的血管生成、选择性激活M2巨噬细胞的增殖及胶原蛋白合成[10]。豆甾醇能改善糖脂代谢紊乱、减轻肝脏脂肪积累[11]。山萘酚可减轻炎症和氧化应激，降低胰岛β细胞凋亡[12]。此外，改良生肌玉红膏中还含有多种生物活性的柚皮素，能够抑制慢性创面中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生和炎症因子的表达[13]，从而更好地促进DFU愈合。AGEs是蛋白质或脂质在高糖环境在下经糖化形成的非酶糖基化产物，可以导致炎症、氧化应激和组织损伤。RAGE是AGEs的特异性受体。AGEs结合RAGE后激活促炎信号通路，被认为是导致DFU不愈合的主要原因[14]。应用AGEs抑制剂、RAGE阻滞剂可减轻糖尿病症状，以及包括糖尿病足、视网膜病变在内的并发症进展。DFU创面蓄积的AGEs与其受体RAGE结合后，可以启动PI3K及其效应蛋白AKT的下游激活。细胞实验表明，敲低RAGE可下调AKT水平，并抑制细胞增殖[15]。黄柏中的小檗碱等有效成分可作为RAGE抑制剂，通过抑制PI3K/AKT信号通路进而抑制NF-κB，改善糖尿病并发症[16]。PI3K/AKT是经典信号通路，在伤口修复中发挥积极作用，可激活AKT信号直接影响巨噬细胞的存活、极化和迁移[17]。巨噬细胞极化是巨噬细胞不同功能表型的动态转化过程，在免疫调节、组织稳态和疾病进展中起关键作用。经典活化的M1巨噬细胞通过分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6和IL-1β等细胞因子发挥促炎作用；活化的M2巨噬细胞则表现出抗炎特性，支持组织修复和血管生成，同时吞噬能力增强，通过清除凋亡细胞和碎片抑制炎症发生[18]。在正常的伤口愈合过程中，M1/M2型巨噬细胞交替发挥关键作用。DFU患者巨噬细胞极化失衡，M1型巨噬细胞持续浸润，而M2型极化受到抑制[19]。巨噬细胞功能的失调导致炎症反应过度、生长因子生成减少，延缓血管生成和胶原沉积，导致DFU慢性化。巨噬细胞极化受到多种信号级联调节。其中，PI3K-AKT信号通路是细胞内重要的信号转导通路，该通路异常激活可导致下游NF-κB通路激活，导致炎症因子进一步释放，形成慢性炎症，并促进巨噬细胞M1极化；相反，抑制PI3K-AKT信号通路，则抑制促炎的巨噬细胞M1极化[20]。因此，推测改良生肌玉红膏可能通过AGEs/RAGE/PI3K/AKT通路调控M1/M2巨噬细胞极化来促进DFU愈合。
本研究通过高糖高脂饮食+STZ构建2型糖尿病大鼠模型并诱导DFU形成后，PI3K/AKT信号通路显著激活，这与AGEs/RAGE通路的激活相关。应用改良生肌玉红膏显著清除了AGEs，从而抑制了PI3K/AKT信号通路的过度激活。此外，改良生肌玉红膏还显著下调了RAGE的表达；各组AGEs/RAGE表达水平与PI3K/AKT表达水平呈正相关，表明抑制AGEs/RAGE通路可能是改良生肌玉红膏抑制PI3K/AKT信号通路的关键机制。与西药组及原方生肌玉红膏组相比，改良生肌玉红膏组具有更好的抑制效果。通过对溃疡创面进行巨噬细胞分型免疫组化检测及炎症因子检测，改良生肌玉红膏组大鼠巨噬细胞由M1向M2极化较模型组更为显著，同时IL-1β、IL-6和MMP-9等促炎因子水平显著下降，而IL-4、IL-10和Arg-1等抗炎因子显著上升。这表明改良生肌玉红膏可以通过调控巨噬细胞极化显著降低炎症水平，从而促进DFU愈合。
综上所述，改良生肌玉红膏可以清除AGEs、抑制RAGE并调控PI3K/AKT信号通路，促进M2型巨噬细胞极化，改善DFU慢性炎症状态，从而促进其愈合。