摘要
目的：基于腹腔巨噬细胞NOD样受体家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）表达探讨清胰汤减轻急性胰腺炎（AP）相关肺损伤的作用机制。方法：SPF级雄性SD大鼠30只随机分为对照组、AP组和AP+清胰汤组，每组10只。采用雨蛙素联合脂多糖（LPS）腹腔注射诱导大鼠AP模型，AP+清胰汤组大鼠在第一次注射雨蛙素前3 h和LPS注射后9 h分别给予清胰汤(17.136 g/kg)灌胃。模型制备成功后12 h，检测各组大鼠血清淀粉酶活性和肺表面活性蛋白A（SP-A）含量，观察胰腺和肺组织病理学改变；行腹腔灌洗分离巨噬细胞进行转录组学测序，并以荧光定量PCR和Western blot验证；用ELISA法检测腹腔巨噬细胞分泌白细胞介素（IL）-1β、IL-18水平。结果：与AP组比较，AP+清胰汤组大鼠胰腺和肺组织病理学损伤减轻，血清淀粉酶活性降低、SP-A含量升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；转录组学分析发现三组共同差异基因328个，KEGG通路富集分析及验证结果均表明NLRP3在AP组表达上调，在AP+清胰汤组表达下调（P<0.05）；与AP组比较，AP+清胰汤组大鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、IL-18水平降低（P<0.05）；胰腺组织病理学评分、肺组织病理学评分与NLRP3 mRNA及蛋白表达均呈正相关。结论：清胰汤减轻AP相关肺损伤的作用机制与抑制腹腔巨噬细胞NLRP3表达、减少炎性细胞因子释放有关。
关键词
Abstract
Objective To investigate the mechanism of Qingyi decoction in reducing acute pancreatitis (AP)-related lung injury based on the expression of NOD like receptor family pyrin domain protein 3 (NLRP3) of peritoneal macrophages. Methods Thirty SPF male SD rats were randomly divided into control group, AP group and AP+Qingyi decoction group, with 10 rats in each group. AP model was induced by intraperitoneal injection of cerulein combined with lipopolysaccharide (LPS). Rats in AP + Qingyi decoction group were given Qingyi decoction (17.136 g/kg) by gavage 3 h before the first injection of cerulein and 9 h after LPS injection. Twelve hours after the successful preparation of the model, the serum amylase activity and lung surfactant protein A (SP-A) content of rats in each group were detected, and the histopathological changes of pancreas and lung were observed; Peritoneal macrophages were isolated by peritoneal lavage for transcriptomic sequencing, and verified by fluorescent quantitative PCR and Western blot; The levels of IL-1 β and IL-18 secreted by peritoneal macrophages were detected by ELISA. Results Compared with the AP group, the pathological injury of pancreas and lung tissue, and serum amylase activity were decreased, the serum SP-A content was increased in the AP+Qingyi decoction group(P<0.05). Transcriptomic analysis found 328 common differential genes in the three groups. KEGG pathway enrichment analysis and validation results showed that NLRP3 expression was up-regulated in AP group and down regulated in AP+Qingyi decoction group (P<0.05). Compared with the AP group, the levels of IL-1β and IL-18 secreted by peritoneal macrophages in the AP+Qingyi decoction group were decreased (P<0.05). There was a positive correlation between pancreatic histopathological score and NLRP3 expression, between NLRP3 expression and lung histopathological score. Conclusion The mechanism of Qingyi decoction in alleviating AP associated lung injury is related to inhibiting the expression of NLRP3 of peritoneal macrophages and reducing the production of inflammatory cytokines.
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是导致住院治疗的常见急腹症之一，其中约有20%的患者合并严重的局部和全身并发症[1]，持续存在器官功能衰竭的患者病死率可高达40%[2]。AP的西医疗法以对症和支持疗法为主，采用中西医结合疗法可将AP患者的病死率降至18%左右[3]。腹腔巨噬细胞在AP发生早期即被活化，释放大量促炎细胞因子，这些因子反过来进一步诱导其自身和中性粒细胞活化，引发炎症级联反应，促使炎症迅速从局部向全身扩散；而通过抑制促炎细胞因子生成调控腹腔巨噬细胞活化状态，可减轻炎症，改善器官功能，阻断病程进展[4-5]。清胰汤是临床治疗AP的常用中药复方，可降低患者全身炎症反应，有效防治AP向重症发展[6]，但其对腹腔巨噬细胞的调控作用及机制尚不清楚。本研究采用雨蛙素联合脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）腹腔注射诱导大鼠AP模型，基于转录组学筛选调控腹腔巨噬细胞活化的关键分子，并探讨清胰汤改善AP相关肺损伤的机制。
1 材料与方法
1.1 动物
30 只SPF级雄性SD大鼠，体质量（190±10）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养于恒温恒湿、12 h光/暗循环环境，自由进食水。所有实验均按照动物护理委员会的动物护理和处理指南进行，本实验方案经天津医科大学动物伦理与福利委员会（编号：TMUaMEC2018031）和天津市南开医院实验动物伦理委员会（编号：NKYY-DWLL-2023-178）审查批准。
1.2 主要试剂
雨蛙素（纯度99.97%）和LPS购自美国MedChemExpress生物科技公司；NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）购自英国Abcam艾博抗（上海）贸易有限公司，血清淀粉酶活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，大鼠肺表面活性蛋白A（pulmonary surfactant-associated protein A，SP-A）ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物技术有限公司，白细胞介素（IL）-1β、IL-18的ELISA检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.3 清胰汤制备
清胰汤由柴胡、黄芩、胡连、杭芍、木香、元胡、大黄、芒硝组成，各中药饮片比例为3∶2∶2∶3∶2∶2∶3∶2。所有中药饮片由天津市南开医院中药房提供。将柴胡、黄芩、胡连、杭芍、木香、元胡加入8倍体积的水浸泡30 min后煮沸30 min，倒出药汤备用；再向药渣中加水4倍体积水煮沸20 min时加入大黄，继续煎煮10 min，冲入芒硝；最后，合并两次煎煮获得的药液，在80℃下浓缩至1.72 g/mL。
1.4 模型制备、分组及处理
将30只大鼠适应性饲养7 d后，按照随机数字表法分为对照组、AP组和AP+清胰汤组，每组10只。采用腹腔内注射雨蛙素联合LPS诱导AP模型[7]。雨蛙素注射剂量为50 μg/kg，两次注射间隔为0.5 h，共注射6次，最后一次注射后立即按10 mg/kg剂量注射LPS。对照组仅注射生理盐水。AP+清胰汤组大鼠在第一次注射雨蛙素前3 h和最后一次注射雨蛙素后9 h分别予以清胰汤（17.136 g/kg，相当于临床等效剂量的2倍）灌胃。在注射LPS后12 h，经内眦取血后，异氟烷吸入性麻醉大鼠，行腹腔灌洗分离腹腔巨噬细胞，最后取胰腺和肺组织。
1.5 HE染色和组织病理学评分
1.6 血清淀粉酶活性和SP-A含量测定
采用淀粉-碘比色法测定淀粉酶活性，采用双抗夹心法测定SP-A含量，按试剂盒操作手册进行。
大鼠麻醉成功后，消毒、固定、备皮，剪开腹部皮肤及肌层，暴露腹膜，用20 mL无菌注射器向腹腔注入16 mL完全培养基（DMEM）和4 mL空气，手持解剖板快速水平振荡2 min，回抽完全培养基约12 mL。重复腹腔灌洗2次，将3次回收的腹腔灌洗液合并，以500 ×g离心10 min，取上层液体再次离心后获得腹腔灌洗液上清冻存备用，下层细胞沉淀用DMEM重悬，置培养皿中于37℃、5％CO2培养箱孵育2 h后换液，培养液离心后去除细胞碎片和未贴壁细胞，留取培养液上清，获得纯化的大鼠原代腹腔巨噬细胞，置于-80℃冻存备用。
1.8 腹腔巨噬细胞的转录组学分析
转录组测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。主要步骤：腹腔巨噬细胞总RNA提取、完整性鉴定和定量；cDNA合成、纯化、末端修复、加尾并连接测序接头；PCR扩增、产物纯化，获得文库；上机Illumina测序，进行差异基因分析。差异表达基因分析以|log2FC|≥1且FDR＜0.05为标准。
1.9 实时荧光定量PCR检测腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA表达
用TRIZOL法提取腹腔巨噬细胞总RNA，定量后行反转录，取1.0 g cDNA，以GAPDH为内参行实时荧光定量PCR检测NLRP3 mRNA表达。NLRP3上游引物：5’-CTCACCTCACACTCCTGCTG-3’，下游引物：5’-AGAACCTCACAGAGCGTCAC-3’；GAPDH上游引物：5’-ACGGCAAATTCAACGGCACAG-3’，下游引物：5’-ACACCAGTAGACTCCACGACATAC-3’。
1.10 Western blot检测腹腔巨噬细胞NLRP3蛋白表达
用RIPA裂解液提取腹腔巨噬细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，SDS-PAGE分离总蛋白，电转印至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加一抗（1∶1000 NLRP3，1∶1500 GAPDH）低温孵育过夜；洗膜后加二抗孵育1.5 h，利用ECL仪器进行化学发光显影，凝胶成像仪扫描蛋白条带行密度分析，以NLRP3平均光密度值/GAPDH平均光密度值来表示NLRP3的相对蛋白表达量。
1.11 ELISA法检测IL-1β、IL-18水平
采用ELISA试剂盒测定腹腔灌洗液上清和腹腔巨噬细胞培养液上清中IL-1β、IL-18水平，按试剂盒操作手册进行。
1.12 统计学方法
采用SPSS 24.0统计软件分析。计量资料以表示，三组比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。采用Spearman相关性分析腹腔巨噬细胞NLRP3表达与胰腺、肺组织病理损伤评分之间的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 清胰汤对大鼠胰腺和肺组织的病理学损伤的影响
AP组大鼠胰腺小叶间隔、部分腺泡间隔及细胞间隔增宽，可见腺泡细胞坏死、炎细胞浸润及融合的坏死灶；肺组织可见明显的肺泡壁增厚，部分肺泡塌陷、充血及炎细胞浸润。AP+清胰汤组大鼠胰腺和肺组织病理损伤较模型组减轻。AP组胰腺和肺组织病理学评分高于对照组，AP+清胰汤组大鼠的组织病理学评分低于AP组，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。
图1三组大鼠胰腺和肺组织病理学改变及评分（HE，×200）
2.2 清胰汤对大鼠血清淀粉酶活性和SP-A含量的影响
AP组大鼠血清淀粉酶活性较对照组升高，SP-A含量较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与AP组比较，AP+清胰汤组大鼠血清淀粉酶活性降低、SP-A含量升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
图2三组大鼠血清淀粉酶活性和SP-A含量比较
2.3 清胰汤对腹腔巨噬细胞转录组学测序结果的影响
2.3.1 差异基因分析
AP组与对照组比较共鉴定出623个上调基因，339个下调基因；AP+清胰汤与AP组比较共鉴定出650个上调基因，920个下调基因（图3A、3B）。进一步分析两个比较组之间差异基因的重叠关系，发现共同差异基因328个，作为清胰汤调节AP腹腔巨噬细胞的潜在靶点（图3C）。
2.3.2 KEGG功能富集分析
对差异基因进行KEGG通路富集分析发现，AP组与对照组比较，上调的差异基因富集于通路的前五位为破骨细胞分化、细胞因子与受体相互作用、金葡萄球菌感染、利什曼病、Nod样受体（NLR）信号通路，AP+清胰汤组与AP组比较，下调的差异基因富集于居前五位的通路是细胞因子与受体相互作用、NLR信号通路、利什曼病、甲型流感、IL-17信号通路，见图4。
2.4 清胰汤对腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA和蛋白表达的影响
荧光定量PCR和Western blot结果显示：AP组大鼠腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA和蛋白表达较对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与AP组比较，AP+清胰汤组腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA和蛋白表达均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。
2.5 清胰汤对腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、IL-18水平的影响
AP组大鼠腹腔灌洗液和巨噬细胞培养液中IL-1β、IL-18水平较对照组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与AP组比较，AP+清胰汤组腹腔灌洗液和巨噬细胞培养液中IL-1β、IL-18水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图6。
2.6 腹腔巨噬细胞NLRP3表达与胰腺、肺组织病理损伤的相关性分析
胰腺组织病理损伤评分与腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA及蛋白表达呈强正相关，腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA及蛋白表达与肺组织病理损伤评分呈强正相关（P<0.001），见图7。
图3清胰汤影响AP腹腔巨噬细胞的差异表达基因分析
图4清胰汤影响AP腹腔巨噬细胞差异表达基因的KEGG分析
图5清胰汤降低腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA和蛋白表达
图6清胰汤降低腹腔灌洗液和巨噬细胞培养液中IL-1β、IL-18水平
图7胰腺组织病理损伤评分、腹腔巨噬细胞NLRP3 表达及肺组织病理损伤评分之间的相关性分析
3 讨论
AP相关肺损伤是AP最早且最常见的并发症之一，也是导致其病死率升高的主要原因，阐明AP相关肺损伤的发生机制，对临床防治策略的制定具有重要意义[12]。SP-A是一种由肺泡Ⅱ型上皮细胞合成和分泌的糖蛋白，当肺泡结构破坏时，分泌入血的SP-A减少，因此可作为评价肺组织结构完整性的指标之一[13]。本研究利用雨蛙素联合LPS诱导法建立大鼠AP模型，检测结果显示，AP模型大鼠血清淀粉酶活性升高，SP-A含量降低，结合病理学观察结果，证实胰腺和肺组织均发生损伤，而清胰汤能同时改善AP大鼠胰腺及其相关肺损伤。
腹腔巨噬细胞是腹腔内最主要的常驻固有免疫细胞，受刺激活化后，吞噬功能与细胞因子分泌能力增强，既能启动并加剧炎症反应，又参与损伤修复的调控，在AP的发病和转归中扮演复杂而关键的双重角色[14]。现已证实腹腔巨噬细胞是一群具有高度异质性和功能多样性的细胞群体，除了经典活化的M1型与替代活化的M2型这两种极化表型外，还存在M2a、M2b、M2c、M2d等多种过渡状态表型；这些表型能连续相互转化，其表达和分泌的细胞因子也存在交叉重叠，构成复杂而有序的动态调控网络[15-16]。AP早期，腺泡细胞损伤释放的胰蛋白酶、高迁移率族蛋白B1及细胞外ATP等激活腹腔巨噬细胞，巨噬细胞释放促炎因子与趋化因子，募集中性粒细胞与单核细胞至胰腺及腹腔，进一步加剧炎症级联反应，导致全身炎症反应综合征及远隔器官损伤[4]。
为了探究腹腔巨噬细胞在AP所致肺损伤中的作用机制，本研究对大鼠腹腔巨噬细胞进行了转录组测序分析，并对差异基因进行KEGG通路富集分析，发现NLR信号通路关键蛋白的基因表达在AP大鼠中上调，清胰汤干预可下调这些关键蛋白的基因表达。NLRP3是一种研究较为清楚的胞内模式识别受体，是NLR信号通路的核心组分。生理状态下，细胞内NLRP3及其下游的IL-1β前体和IL-18前体处于极低水平；当NLRP3被相应配体激活后，引发核因子κB（NF-κB）核转位，进而诱导IL-1β、IL-18等基因的转录与表达；同时，活化的NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白、Caspase-1前体组装形成多蛋白复合体，启动NLRP3炎症小体活化，导致过度的炎症反应，从而促进疾病进程[17]。
最近有研究采用雨蛙素刺激AR42J腺泡细胞构建AP细胞模型，发现其释放的外泌体miR-24-3p通过靶向NLRP3诱导大鼠腹腔巨噬细胞激活及细胞焦亡[18]，这一研究提示AP发生时腹腔巨噬细胞的活化源于受损的腺泡细胞，腹腔巨噬细胞NLRP3在调控腹腔巨噬细胞激活过程中发挥重要作用。本研究通过转录组测序、qPCR和Western blot验证，AP大鼠腹腔巨噬细胞中NLRP3 mRNA和蛋白表达水平升高，IL-1β和IL-18分泌增多，而清胰汤可下调NLRP3 mRNA和蛋白表达，抑制腹腔巨噬细胞激活，减少IL-1β和IL-18生成。进一步的相关分析表明，胰腺损伤、肺损伤之评分与腹腔巨噬细胞NLRP3 mRNA及蛋白表达之间呈强正相关，提示腹腔巨噬细胞NLRP3表达增强促进AP相关肺损伤的发生。
综上所述，NLRP3是调控腹腔巨噬细胞表型和功能的关键，并参与AP相关肺损伤的作用的发生和进展。清胰汤治疗可改善AP相关肺损伤的作用，其作用机制与抑制腹腔巨噬细胞NLRP3表达，减少促炎细胞因子释放，减轻炎症有关。靶向抑制巨噬细胞NLRP3表达有望成为治疗AP的新策略。