摘要
目的：比较新型一期给药方案与传统三期给药方案对骨折愈合的促进作用，并初步探究其对骨形态发生蛋白（BMP）/Sma和Mad相关蛋白（Smad）通路的激活效应。方法：选取24只雄性SD大鼠，随机分为空白对照组、模型对照组、一期给药组（全程予综合方）和三期给药组（1~7 d予复元活血汤，8~28 d予和营止痛汤，28 d后予健步虎潜丸）。术后行X射线评估大鼠骨折愈合程度；测定（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）水平；苏木精-伊红（HE）染色观察骨痂组织愈合情况；免疫组化检测BMP2、Runt相关转录因子（Runx2）、Smad1蛋白水平；RT-qPCR检测BMP2、Runx2、Smad1的mRNA表达水平。结果：与模型对照组相比，一期给药组和三期给药组的骨折愈合进程均明显加快，一期给药组为著。模型对照组的ALP为（165±4.7）U/L，一期给药组和三期给药组分别为（233±12.2）U/L和（174±20.3）U/L，ALP在一期给药组中显著升高，提示其加速骨折修复显著优于模型对照组和三期给药组。一期给药组的ACP水平为0.192±0.027，显著低于模型对照组的0.340±0.017和三期给药组的0.265±0.014。HE染色显示，一期给药组的局部炎症浸润明显减少，软骨及新骨形成丰富；三期给药组亦见炎症减轻及胶原/软骨组织增多。免疫组化表明，一期给药组的Runx2表达水平为57.1%±5.9%，显著高于模型对照组的41.6%±3.1%和三期给药组的48.3%±4.0%，Smad和BMP2亦有不同程度的升高，RT-qPCR检测结果与上述免疫组化结果一致。结论：一期给药方案通过激活BMP/Smad信号通路有效促进骨折成骨与重塑，其效果优于三期给药方案。
Abstract
Objective To compare the promotive effects of the novel single-stage administration regimen and the traditional three-stage regimen on fracture healing, and to preliminarily investigate their roles in activating the BMP/Smad signaling pathway. Methods A rat tibial fracture model was established and randomly divided into four groups: blank control, model control, single-stage treatment (administered a comprehensive formula throughout the experiment), and three-stage treatment (administered Fuyuan Huoxue decoction on days 1-7, Heying Zhitong decoction on days 8-28, and Jianbu Huqian Pill after day 28). Post-surgery, X-ray imaging was used to assess the degree of fracture healing. Levels of Calcium (Ca), Phosphorus (P), Alkaline Phosphatase (ALP), and Acid Phosphatase (ACP) were measured. Histological examination via HE staining was performed to observe callus tissue healing. Immunohistochemistry was used to detect the protein levels of BMP2, Runx2, and Smad1. RT-qPCR was employed to quantify the mRNA expression levels of BMP2, Runx2, and Smad1. Results Compared with the model control group, both the single-stage and three-stage treatment groups showed significantly accelerated fracture healing, with the single-stage group exhibiting the most pronounced effect. Alkaline phosphatase (ALP) levels in the model control group were (165±4.7)U/L. However, the single-stage administration and traditional three-stage regimen groups showed ALP levels of (233±12.2)U/L and (174±20.3)U/L, respectively. The significant elevation of ALP in the single-stage administration suggests that its effect on promoting fracture repair was markedly superior to both the model control group and the traditional three-stage regimen. The acid phosphatase (ACP) level in the single-stage administration was 0.192±0.027, which was significantly lower than that in the model control group (0.34±0.017) and the traditional three-stage regimen (0.265±0.014). Hematoxylin-eosin (HE) staining revealed a marked reduction in local inflammatory cell infiltration and abundant formation of cartilage and new bone in the single-stage administration; the traditional three-stage regimen also exhibited reduced inflammation and increased collagen/cartilage tissue. Immunohistochemical analysis showed that the expression level of Runx2 in the single-stage administration was 57.1±5.94, significantly higher than that in the model control group (41.6±3.11) and the traditional three-stage regimen (48.3±4.04). Levels of Smad and BMP2 were also elevated to varying degrees, and RT-PCR results further corroborated this finding. Conclusion The single-stage comprehensive treatment regimen effectively promotes fracture osteogenesis and remodeling by activating the BMP/Smad signaling pathway, and its effect is superior to the three-stage treatment approach.
骨折是临床常见的创伤性疾病，其愈合过程复杂且受多种因素的调控，如炎症反应、软骨痂形成及骨重塑等。转化生长因子-β（TGF-β）超家族信号转导在众多生物系统中对细胞生长、分化和发育的调节发挥重要作用，其中骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）/Sma和Mad相关蛋白（Smad）信号通路在骨再生中尤为关键，该通路不仅参与成骨细胞的分化和骨组织的再生，还对骨折愈合的不同阶段具有动态的调控作用[1-2]。近年来，除手法复位外固定及手术治疗外，中医药在骨折治疗领域也展现出独特优势，其有利于改善患者临床症状、促进骨折快速愈合以及减少并发症[3]。例如桃红四物汤、和营止痛汤及壮筋养血汤等经典方剂，在桡骨骨折和胫骨骨折的临床治疗中得到了广泛应用，并取得较好的临床疗效[4-6]。中医传统三期分治理论认为，骨折的治疗应根据早期、中期、晚期的不同病理特点，采取“早期活血化瘀、中期和营止痛、后期补益肝肾”的治则进行动态干预，从而提高治疗的精准性及疗效[7]。目前，复元活血汤、和营止痛汤、健步虎潜丸在临床上被应用于骨折的治疗，并展现出良好的临床疗效[8-10]。尽管部分前期研究提示三期分治方案具有较好的临床疗效[11-12]，但仍缺乏与一期治疗的对比研究。关于三期给药治疗骨折的临床获益及其作用机制仍有待研究。本研究拟结合中医理论与现代分子生物学技术，探究新型一期给药方案与传统的三期方案在骨折愈合不同时期的药效作用差异，并揭示其可能的作用机制。旨在为中药复方制剂的临床合理应用提供科学依据，并为中药复方制剂促进骨折愈合提供新的治疗思路和方案。
1 材料与方法
1.1 材料
24 只雄性SD大鼠（质量约200 g），购自斯贝福（苏州）生物技术有限公司，实验动物生产许可证：SCXK（苏）2022-0006；合格证编号：B202405290350；实验动物使用许可证：SYXK（苏）2022-0038；实验动物饲养温度范围：20～26℃，严格控制昼夜节律。本实验得到南京拉姆达医药有限公司实验动物伦理委员会批准（编号：IACUC-2024050803）。
1.2 动物模型构建及分组处理
1）骨折模型构建：将24只大鼠适应性喂养1周后，于造模前48 h进行右下肢常规脱毛。使用0.3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉注射麻醉。实验在无菌条件下进行，右下肢常规消毒后，在右侧胫骨中下1/3处纵行切开皮肤及皮下组织，暴露右侧胫骨中下1/3部位。用锯造成3 mm横断骨折，骨折处理后植入克氏针，用生理盐水冲洗切口，逐层缝合切口。术后对动物进行分笼饲养，用常规饲料喂养和饮水。术后3 d，于肌肉注射青霉素，1次/d，每次40万IU，以预防感染。2）骨折分期：早期（骨折后1~7 d），为血肿机化演进期；中期（8~28 d），为原始骨痂形成期；晚期（28 d后），为骨痂改造塑形期。3）分组给药：在骨折模型制作后的次日，将所有动物按照随机数字表法随机分为4组，每组6只：空白对照组、模型对照组、三期给药组（早期给予复元活血汤0.95 g/kg、中期给予和营止痛汤0.75 g/kg、晚期给予健步虎潜丸0.87 g/kg）、一期给药组（全程给予三种复方制剂的综合方0.84 g/kg，且各给药时期给予的生药量与同期三期治疗组保持一致），给药方式为灌胃给药，给药剂量为每天单次给药剂量，按照大鼠每公斤体重计算给药剂量。
1.3 研究指标
影像学指标：分别于骨折后第8、29、56天采用X射线检测各组动物骨折线的变化及达到骨折愈合所需的时间，骨性愈合的判断标准为骨折间隙中可见新的骨形态形成。血液生化指标：骨折后56 d，腹主动脉取血处死动物，取血，离心，生化分析仪测定血清钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）水平。组织病理：骨折后第56天，取右侧骨折处骨痂组织（含骨折断端，长约3 cm的骨组织），将骨标本周围的筋膜、神经、血管及其他软组织清理干净，随后将骨标本（骨折侧）放入10%甲醛溶液固定24 h后，进行脱蜡、包埋、切片及苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，于显微镜下观察骨折愈合情况。BMP/Smad通路指标：骨折后第56天，取骨折侧骨标本于-80℃保存，采用实时荧光定量PCR检测骨痂组织中BMP2、Smad1和Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2） mRNA表达水平，采用免疫组化法检测BMP2、Smad1和Runx2蛋白表达水平。
1.4 统计学方法
实验数据以均数±标准差表示。组间差异采用单因素方差进行统计检验，事后多重比较采用Dunnett’s t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 药效学评价
影像学观察显示，骨折后第8天，模型对照组骨折线清晰，而一期给药组和三期给药组骨折线稍显模糊，初步形成骨痂；第29天，模型对照组骨折线稍模糊，但骨折区域愈合不明显，而一期给药组和三期给药组的骨折线进一步模糊，骨结构有所改善；至第56天时，模型对照组骨折区域仍未完全恢复，仍可见到骨折线，而一期给药组和三期给药组骨折区域修复较好，但仍有骨折痕迹。骨折后第56天，各组大鼠行为学表现呈现显著差异。空白对照组大鼠活动、负重能力正常。模型对照组大鼠活动明显受限，患肢负重能力显著下降，行走时可见跛行，患肢触地时存在疼痛反应，而一期给药组和三期给药组大鼠活动基本恢复正常，患肢负重能力接近正常大鼠，行走时无跛行，患肢触地时无明显疼痛反应（图1）。
2.2 各组血清生化指标
骨折后第56天，一期给药组大鼠的血清ALP水平为（219±12.2）U/L，显著高于模型对照组的（165±1.47）U/L和三期给药组的（174±20.3）U/L，差异均有统计学意义（P<0.05）。一期给药组的ACP水平为（0.192±0.027）μmol/（min・mL），显著低于模型对照组的（0.340±0.017）μmol/（min・mL）和三期给药组（0.265±0.014）μmol/（min・mL），差异均有统计学意义（P<0.05）。一期给药组和三期给药组的磷离子水平分别为（2.01±0.103）mmol/L和（1.96±0.09）mmol/L，比模型对照组的（2.45±0.18）mmol/L显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。一期给药组和三期给药组的钙离子水平分别为（2.51±0.041）mmol/L和（2.5±0.06）mmol/L，与模型对照组（2.74±0.05） mmol/L差异有统计学意义（图2）。
图1各组大鼠X射线影像学检查结果
图2各组大鼠血液中ALP、ACP、P和Ca水平比较
2.3 各组病理学结果
相对于空白对照组的正常骨组织与骨髓结构，模型对照组骨折部位可见大量胶原组织和成纤维细胞，并伴有大量炎症细胞浸润，炎症反应强烈；一期给药组大鼠骨痂组织炎细胞浸润减轻，骨痂内存在大量胶原组织和软骨组织，并可见片状骨组织及其中的骨细胞；三期给药组的骨痂内存在大量胶原组织，成纤维细胞及软骨细胞，炎细胞浸润减轻（图3）。
图3骨折后第56天各组大鼠病理学检测结果（HE染色，×400）
2.4 各组BMP/Smad通路激活差异
免疫组化结果显示，空白对照组中BMP2、Runx2和Smad1蛋白的表达水平均较低，模型对照组中上调，一期给药组中BMP2、Runx2和Smad1的表达较对照组显著上调（图4）。一期给药组Runx2阳性细胞比例为57.1%±5.9%，显著高于模型对照组的41.6%±3.1%和三期给药组的48.3%±4.0%；一期给药组中Smad1蛋白表达水平为（23.84±7.49）×106，显著高于模型对照组的（4.69±1.49）×106和三期给药组的（9.34±1.83）×106；一期给药组中BMP2的蛋白表达水平为（9.41±2.01）×106，显著高于模型对照组的（1.50±0.4）×106和三期给药组的（2.69±1.53）×106（图5）。qPCR实验结果表明，一期给药组的Runx2、Smad1、BMP2 mRNA水平分别为5.06±1.33、4.69±0.88、2.32±0.32，高于模型对照组的1.79±0.22、2.34±0.13、1.05±0.15，以及三期给药组的3.45±0.58、3.49±0.19、 1.70±0.05，差异均有统计学意义（P<0.05），见图6。
图4各组大鼠免疫组化结果（×200）
图5各组大鼠骨痂组织中BMP2、Smad1和Runx2蛋白表达水平比较
图6各组大鼠Runx2、BMP2及Smad1 mRNA表达水平比较
3 讨论
本研究结合中医理论与现代分子生物学技术，探究新型中药复方制剂一期给药方案对比“传统的三期分治”给药方案在骨折愈合不同时期的药效差异及潜在机制。结果提示，一期和三期给药组血清钙和磷离子浓度均显著低于模型对照组，两种中医骨折用药策略均能通过下调血钙、血磷浓度，驱动钙磷在骨折端沉积，加速矿化，有助于骨折愈合。然而，两种方案在作用机制和药效强度上存在差异：三期给药组中破骨细胞活性指标相对更高，成骨细胞相关指标则维持在较低水平，与模型对照组接近，提示该方案促进骨折修复的同时，更注重骨重塑的平衡；而一期给药组破骨细胞活性显著降低，成骨细胞活性明显增强，提示其在骨痂形成速度方面更具优势。病理学和影像学结果进一步验证了这一结论：一期给药组在骨组织修复程度、炎症反应控制及新骨形成速度等方面均优于三期给药组，表现出更显著的骨折修复效果。
前期研究表明，复元活血汤可改善肋骨及肢体骨折患者临床症状[13-15]，促进跟骨骨折患者的骨代谢及骨愈合[16-18]，且可缓解脊柱骨折患者炎症反应[19]；在坐骨神经损伤的大鼠模型中，该方还可抑制Src/Erk1/2信号通路活性[20]。和营止痛汤亦被报道可改善骨折患者的临床疗效[21-23]，并降低椎体压缩性骨折患者的血清学炎症指标[24-25]。此外，健步虎潜丸可改善胸腰椎椎体骨折患者疼痛症状、活动功能，并提高骨密度[26]，亦被报道可提高成骨细胞活性[27]。尽管如此，这些中药制剂促进骨折愈合的具体分子机制仍有待研究。BMP/Smad通路在骨折愈合中的作用在不同疾病中均有报道，Liu等[28]的研究提示BMP2蛋白过表达通过激活BMP/Smad信号通路促进老年骨质疏松性骨折的愈合和成骨能力，另有韩国学者报道白花丹苷通过激活BMP2/Smad和Wnt/β-Catenin来调控Runx2，促进骨生成，骨钙化，骨形成，进而促进骨折愈合[29]。此外，已有研究表明中医药治疗方案与该通路的关系，例如，研究表明骨碎补总黄酮通过激活BMP/Smad信号通路促进大面积胫骨缺失部位的新骨形成[30]；Ma等[31]的基础研究提示，骨康胶囊通过激活WNT/β-Catenin和BMP/Smad信号通路，不仅促进骨折愈合，还增加成骨细胞分泌骨保护素；此外，传统中药华蟾素亦被报道能显著逆转雌激素缺乏所致的骨质流失，并通过BMP/Smad和WNT/β-Catenin信号通路促进成骨分化。本研究揭示了复元活血汤、和营止痛汤及健步虎潜丸三种中药制剂在治疗骨折中的有效性与BMP/Smad信号通路上调相关。总体来看，一期给药组在成骨相关基因表达（Runx2、BMP2、Smad1蛋白）的表达上调幅度显著高于三期给药组，后者仅呈轻微升高。结合病理及免疫组化结果，笔者推测，新型一期给药方案通过更有效地激活BMP/Smad通路，在骨组织重塑、成熟骨小梁形成以及骨密度恢复等方面具有更优效应。该结果为中药复方制剂在骨折治疗策略的现代化、简便化提供了实验依据，尤其是对于依从性差、复诊困难的患者，新型一期给药方案可成为三期方案的有效替代，同时若患者伴明显骨质疏松或延迟愈合，可优先考虑“早期强化”策略，以迅速提升BMP/Smad活性，加速骨修复。
然而，本研究仍存在一定局限性。虽然结果提示新型一期给药方案对于骨折的治疗较“传统的三期分治方案”具有一定优效性，并初步揭示了相关机制，但由于研究主要基于动物模型，仍缺乏临床证据支持。此外，NOTCH信号通路、HEDGEHOG信号通路、WNT信号通路、ERK/MAPK信号通路均被报道与骨组织愈合相关。因此，除BMP/Smad信号通路外，其他可能参与中药复方制剂促进骨折愈合的信号通路仍有待探究。进一步研究可结合多组学等技术，深入探索新型一期给药方案治疗的全局机制，并启动前瞻性临床试验，以影像学愈合率、生物力学强度及患者报告结局为核心指标，进一步验证一期方案在真实世界中的有效性与安全性，为中医药骨折治疗的精准化与推广提供高质量证据。