摘要
目的：探讨柚皮苷对脂多糖（LPS）诱导的退变髓核细胞的保护作用及其分子机制，为开发退行性椎间盘疾病（IVDD）新型治疗策略提供理论依据。方法：构建LPS诱导的退变髓核细胞模型，并对退变髓核细胞施加不同浓度（10~40 μmol/L）的柚皮苷进行干预处理，用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测细胞外基质（ECM）相关蛋白如Ⅱ型胶原蛋白（Collagen Ⅱ）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）及基质金属蛋白酶-13（MMP-13），炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6），凋亡相关因子如B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）、半胱天冬酶2（Caspase-2）以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路相关蛋白，如丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（MEK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38）的表达情况。通过转染P38小干扰RNA（siRNA）敲低P38蛋白表达，进一步探究P38在IVDD中的作用。结果：LPS处理显著下调Collagen II和Aggrecan表达，上调MMP-3和MMP-13活性，诱导TNF-α、IL-6分泌，促进细胞凋亡，同时增强MAPK信号通路中MEK、ERK和P38蛋白的表达。柚皮苷逆转上述病理改变，上调Collagen II和Aggrecan表达，下调MMP-3和MMP-13活性，降低TNF-α、IL-6水平，减少细胞凋亡，抑制MEK、ERK和P38蛋白表达。P38 siRNA转染组中，P38蛋白表达降低，ECM合成相关蛋白表达上调，炎症因子水平显著降低。结论：柚皮苷可通过靶向P38 MAPK通路调控IVDD进程，抑制退变髓核细胞的ECM降解、炎症反应和细胞凋亡，为IVDD的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。
关键词
Abstract
Objective To investigate the protective effect of naringin on lipopolysaccharide (LPS)-induced degenerated nucleus pulposus cells and its molecular mechanism, and to provide a theoretical basis for the development of novel therapeutic strategies for intervertebral disc degeneration (IVDD). Methods Model of LPS-induced degenerating myeloid cells was constructed, and different concentrations (10-40 μmol/L) of naringin were applied to the degenerating myeloid cells for intervention treatments, protein immunoblotting (Western Blot) and other techniques were used to detect extracellular matrix (ECM)-associated proteins [e.g. Collagen II, Aggrecan, Matrix metalloproteinase-3(MMP-3), MMP-13], inflammatory factors [e.g. Tumor necrosis factor-α(TNF-α), Interleukin-6 (IL-6)], apoptosis-related factors [B cell lymphoma-2(Bcl-2), Caspase-2], and expression of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway-related proteins [(Mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK), Extracellular regulated protein kinases (ERK), P38]. In addition, P38 protein expression was knocked down by transfection of P38 small interfering RNA (siRNA) to further investigate the role of P38 in IVDD. Results LPS treatment significantly down-regulated the expression of Collagen II and Aggrecan, up-regulated the activities of MMP-3 and MMP-13, induced the secretion of TNF-α and IL-6, and promoted apoptosis, and enhanced the expression of MEK, ERK, and P38 proteins in the MAPK signalling pathway. Naringin intervention dose-dependently reversed the above pathological changes, up-regulated the expression of Collagen II and Aggrecan, down-regulated the activities of MMP-3 and MMP-13, decreased the levels of TNF-α and IL-6, reduced apoptosis, and inhibited the expression of MEK, ERK and P38 proteins. In the group transfected with P38 siRNA, the expression of P38 proteins was reduced, the expression of proteins related to ECM synthesis was up-regulated, and the expression of inflammation-related proteins was increased. In the P38 siRNA transfected group, P38 protein expression was reduced, ECM synthesis-related protein expression was up-regulated, and the level of inflammatory factors decreased significantly. Conclusion Naringin can regulate IVDD by targeting the P38 MAPK pathway and inhibit ECM degradation, inflammation and apoptosis in degenerated Nucleus Pulposus cells, which provides a new potential target and therapeutic strategy for the treatment of IVDD.
退行性椎间盘疾病（intervertebral disc degeneration，IVDD）是引发下腰痛的关键因素，严重影响人群的劳动能力和生活质量[1]。髓核作为椎间盘的核心结构，由髓核细胞和富含水分的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）组成，对维持椎间盘正常功能和力学特性至关重要[2]。随着年龄增长及机械应力等因素影响，髓核细胞发生退变，其中涉及复杂的细胞及分子生物学变化[3]。
正常情况下，髓核细胞通过合成Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、蛋白聚糖（Aggrecan）等ECM成分维持椎间盘结构的完整与弹性，并通过精细调控平衡基质合成与降解及细胞存活[4-5]。然而，在退变过程中，这种平衡被打破。退变髓核细胞所处微环境发生改变，炎症因子水平升高，ECM降解酶表达上调，导致ECM过度降解，椎间盘的弹性和抗压能力下降[6]。同时细胞凋亡增加，进一步减少了髓核细胞数量，加速髓核细胞退变[7]。目前，非手术治疗（如物理、药物治疗）仅能缓解症状，手术治疗存在风险且不适用于早期患者[1]。因此探究其退变机制、寻找治疗靶点意义重大。
柚皮苷是柑橘类水果中的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[8]。近期研究显示其可通过抑制核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路减轻椎间盘炎症，但其对ECM代谢及凋亡的调控机制尚未明确。此外，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路在椎间盘退变中异常激活，其中P38 MAPK通过调控基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）表达及细胞凋亡参与退变[9-10]。然而，柚皮苷在椎间盘退变中的作用及其分子机制仍待深入研究。
本研究通过体外构建脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的髓核细胞退变模型，探讨柚皮苷对ECM代谢、炎症反应及凋亡的调控作用，并解析其是否通过抑制P38 MAPK通路发挥作用，以期为IVDD的治疗提供新靶点。
1 材料与方法
1.1 细胞培养与LPS处理
人髓核细胞HNPC（武汉普诺赛公司，货号CP-H097）用含10%胎牛血清（美国Gibco公司，货号A5256701）和1%青霉素-链霉素双抗（上海碧云天公司，货号C0222）的高糖DMEM（美国Gibco公司，货号11965118）完全培养基，在含5%CO2、37℃培养箱中培养，为正常组。采用LPS（上海碧云天公司，货号ST1470-10mg）诱导退变：取对数生长期细胞，用含25 μg/mL LPS的完全培养基处理12 h，为LPS组。采用不同浓度（10、20、40 μmol）柚皮苷（西安天广源生物公司，货号10236-47-2）进行挽救实验，分别为LPS+10 μmol柚皮苷组、LPS+20 μmol柚皮苷组、LPS+40μmol柚皮苷组。
1.2 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低与白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）干预
使用上述完全培养基培养HNPC，为正常组。使用P38 MAPK siRNA（美国Cell signaling technology公司，货号#6564）及转染试剂盒（美国赛默飞公司，货号L3000075）敲低P38 MAPK。HNPC培养至适宜汇合度后，按说明书将脂质体Lipo3000与Opti-MEM混合，另将siRNA（终浓度1 μmol/L）与Opti-MEM混合，二者孵育20 min后加入培养皿，培养72 h，为P38 siRNA组。髓核细胞先经10 ng/mL的IL-1（上海碧云天公司，货号P5835-10μg）干预24 h后，再转染P38 siRNA，为P38 siRNA+IL-1组。
1.3 蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测炎症及凋亡蛋白水平
收集LPS组、LPS+10μmol柚皮苷、LPS+20μmol柚皮苷、LPS+40μmol柚皮苷组、P38 siRNA组和P38 siRNA+IL-1组细胞，用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测浓度。经6%~15% SDS-PAGE分离后转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，10%牛奶封闭1~2 h，4℃孵育一抗过夜，包括Collagen Ⅱ、Aggrecan、基质金属蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、B细胞淋巴瘤-2基因（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶-2（Caspase-2）、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38）和β-actin，均购自美国Abcam公司。室温孵育二抗1~2 h后，用超敏增强型化学发光试剂（ECL）试剂盒（上海碧云天公司，货号P0018S）成像，Image J分析条带相对灰度值，每组重复3次。
1.4 细胞凋亡情况检测
采用Hoechst 33342/PI试剂盒（上海碧云天公司，货号C1056）进行检测：每1 mL细胞染色缓冲液加5 μL Hoechst染色液和5 μL PI染色液配置工作液。细胞接种于6孔板中，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，每孔加1 mL工作液，4℃孵育20~30 min，采用尼康TS2倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）观察拍照，Image J分析凋亡细胞数，每组重复3次。
1.5 细胞活性检测
采用Calcein AM试剂盒（上海碧云天公司，货号C2013S）检测细胞活性：正常组与LPS组细胞用PBS洗涤后，加入工作液，与37℃避光孵育30 min，用德国徕卡Thunder Imager倒置荧光显微镜观察拍照，Image J分析细胞活性，每组重复3次。
1.6 统计学方法
使用GraphPad Prism软件8.0.2版对数据进行统计分析，计量资料以均值±标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，然后进行Bonferroni校正检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS对髓核细胞炎症和凋亡的影响情况
与正常组比较，LPS组中Collagen Ⅱ、Aggrecan、Bcl-2蛋白的表达量降低，而MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-6和Caspase-2蛋白的表达量升高，且细胞凋亡水平显著上升，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。
图1LPS对髓核细胞炎症和凋亡的影响情况
2.2 柚皮苷干预对髓核细胞炎症和凋亡的影响情况
与LPS组比较，LPS+10 μmol柚皮苷组、LPS+20 μmol/L柚皮苷组、LPS+40 μmol/L柚皮苷组的Collagen Ⅱ、Aggrecan和Bcl-2蛋白表达显著升高，而MMP-3、MMP-13、TNF-α和IL-6和Caspase-2蛋白表达量降低，同时细胞活性显著提高，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。
图2柚皮苷干预对髓核细胞炎症和凋亡的影响情况
2.3 柚皮苷干预对髓核细胞MAPK通路影响
与正常组比较，LPS组的MEK、ERK和P38蛋白表达量显著上调；与LPS组比较，LPS+10 μmol/L柚皮苷组、LPS+20 μmol/L柚皮苷组、LPS+40 μmol/L柚皮苷组的MEK、ERK和P38蛋白表达量均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。
2.4 敲降P38基因对髓核细胞炎症和凋亡的影响
与正常组比较，P38 siRNA组的P38、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-6及Caspase-2蛋白表达显著下调，P38 siRNA组的Collagen Ⅱ、Aggrecan及Bcl-2蛋白表达上调，细胞活性显著升高；与P38 siRNA组比较，P38 siRNA+IL-1组P38、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-6及Caspase-2蛋白表达显著上调，P38 siRNA+IL-1组的Collagen Ⅱ、Aggrecan及Bcl-2蛋白表达下调，细胞活性显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见图4。
图3柚皮苷干预对髓核细胞MAPK通路影响情况
图4敲降P38基因对髓核细胞炎症和凋亡的影响
3 讨论
本研究结果显示，LPS诱导的退变髓核细胞中，ECM的关键成分Collagen Ⅱ和Aggrecan表达水平显著降低，而降解酶MMP-3、MMP-13表达水平显著升高，这与既往研究一致，提示退变过程中髓核细胞合成ECM能力下降，降解加速，破坏椎间盘结构[11-12]。同时，退变细胞中炎症因子TNF-α、IL-6表达水平显著升高，表明其处于强炎症微环境中，过高的炎症因子不仅可诱导MMPs表达、加速ECM降解，还会影响细胞存活[13-14]。此外，本研究的凋亡相关检测显示，退变细胞中抑凋亡因子Bcl-2表达降低，促凋亡因子Caspase-2表达升高，细胞凋亡增加，进一步减少了髓核细胞数量，影响椎间盘功能[15]。
不同浓度柚皮苷干预均对退变髓核细胞产生保护作用：20 μmol/L及40 μmol/L柚皮苷可显著上调Collagen Ⅱ、Aggrecan表达，下调MMP-3、MMP-13表达，抑制ECM降解；20 μmol/L及40 μmol/L柚皮苷可降低TNF-α、IL-6水平，减轻炎症反应；10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L柚皮苷均能上调Bcl-2，下调Caspase-2，减少细胞凋亡并提高细胞活性。上述结果证实，柚皮苷可通过抑制ECM降解、减轻炎症、减少凋亡从而保护退变的髓核细胞[8，16]。
MAPK信号通路是细胞内重要的信号转导途径之一，参与调节细胞的增殖、分化、凋亡以及炎症反应等多种生物学过程[17-18]。本研究显示LPS组MEK、ERK、P38表达显著上调，提示三者在退变细胞中活性增强，而柚皮苷干预（10、20、40 μmol/L）可显著下调三者表达，抑制MAPK通路活性。进一步通过P38 siRNA敲低实验验证：抑制P38可上调Collagen Ⅱ、Aggrecan及Bcl-2蛋白表达水平，下调MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-6及Caspase-2蛋白表达水平，提高细胞活性；反之，促进P38表达则产生相反效果。这表明MAPK通路（尤其是P38）在髓核细胞退变中起关键作用，柚皮苷可能通过抑制该通路发挥保护作用[19-20]。
尽管本研究取得了进展，但仍存在一定的局限性。首先，本研究仅在体外细胞水平进行了实验，虽然体外实验能够较好地控制实验条件，明确柚皮苷对退变髓核细胞的作用及机制，但细胞在体外培养环境与体内环境存在差异，未来需要进一步开展动物实验，验证柚皮苷在体内的治疗效果及安全性。其次，虽然本研究揭示了柚皮苷通过抑制MAPK信号通路发挥保护作用，但MAPK信号通路下游存在复杂的分子网络，其具体的下游分子机制及是否存在其他信号通路的参与仍有待深入研究。此外，本研究中柚皮苷的浓度设置相对有限，未来需要进一步优化柚皮苷的浓度范围，探索其最佳治疗剂量。
综上所述，本研究明确了退变髓核细胞存在ECM降解加剧、炎症反应增强及凋亡增多的病理变化，证实了柚皮苷对退变髓核细胞具有保护作用，其机制与抑制MAPK信号通路活性相关。
