摘要
目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）单独应用或与胆囊收缩素受体（CCKBR）抑制剂联合应用对胰腺癌细胞的抑制作用及可能的分子机制。方法：将胰腺癌MiaPaCa-2细胞分为四组：对照组、EGCG组、YF476组、EGCG和YF476联合组（E＋Y组），分别用对照培养基、50 μmol/L的EGCG、0.1 nmol/L的YF476、50 μmol/L的EGCG和0.1 nmol/L的YF476处理24 h、48 h，用CCK8法检测各组细胞的增殖能力，用葡萄糖乳酸试剂盒检测各组细胞糖酵解的变化，Western blot法检测各组细胞中糖酵解酶以及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路和CCKBR通路蛋白的表达。结果：CCK8结果显示，EGCG或YF476单独应用均可以抑制MiaPaCa-2细胞的增殖，联合用药组的效果最明显(P<0.05)。葡萄糖消耗和乳酸生成实验表明，EGCG或YF476单独应用均可以抑制MiaPaCa-2细胞的糖酵解，二者联合应用对糖酵解的抑制作用最明显(P<0.05)。Western blot结果表明，EGCG可以抑制糖酵解酶以及磷酸化PI3K和Akt的表达，而EGCG联合YF476对糖酵解酶以及磷酸化PI3K和Akt的抑制作用则最为显著（P<0.05），YF476单独应用可抑制糖酵解酶以及胆囊收缩素受体（CCKBR）和磷酸化PLC的表达，而EGCG联合YF476对糖酵解酶、CCKBR及其通路蛋白表达的抑制作用更加明显（P<0.05）。结论：EGCG或CCKBR抑制剂均可抑制人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2的增殖和糖酵解，二者联合应用抑制作用更为显著，其机制可能与抑制PI3K/Akt和CCKBR通路偶联有关。
关键词
Abstract
Objective To investigate the inhibitory effect and molecular mechanisms of epigallocatechin gallate (EGCG) on pancreatic cancer cells alone or in combination with cholecystokinin receptor (CCKBR) inhibitors. Methods The control group, EGCG group, YF476 group, and the combination group of EGCG and YF476 (E+Y group) were respectively treated with the control medium, 50 μmol/L EGCG, 0.1 nmol/L YF476, and 50 μmol/L EGCG and 0.1 nmol/L YF476 for 24 h and 48 h on pancreatic cancer MiaPaCa-2 cells. The proliferation ability of cells in each group was detected by CCK8 method. The changes in glycolysis of cells in each group were detected by glucose-lactate kit. The expressions of glycolytic enzymes and proteins in the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) pathway and CCKBR pathway in each group of cells were detected by Western blot method. Results The results of CCK8 showed that EGCG or YF476 alone could inhibit the proliferation of MiaPaCa-2 cells, and the combined effect of the two was more significant than that alone (P<0.05). Glucose consumption and lactate production experiments showed that either EGCG or YF476 alone could inhibit glycolysis in MiaPaCa-2 cells, and the combined effect of the two was more significant than that alone (P<0.05). The results of Western blot showed that EGCG could inhibit the expression of glycolytic enzyme and phosphorylated PI3K and Akt, and the inhibitory effect of EGCG combined with YF476 was more significant than that alone (P<0.05), and the expression of glycolytic enzyme, CCKBR and phosphorylated PLC was inhibited by YF476 alone, and the inhibitory effect of EGCG combined with YF476 on the expression of glycolytic enzyme, CCKBR and their pathway proteins was more obvious (P<0.05). YF476 alone could inhibit the expression of glycolytic enzymes, CCKBR and phosphorylated PLC, and the inhibitory effect of EGCG combined with YF476 was more significant than that alone (P<0.05). Conclusion Both EGCG and cholecystokinin receptor inhibitor can inhibit the proliferation and glycolysis of human pancreatic cancer cells MiaPaCa-2, the combined effect of them is more significant than that of alone, and the mechanism may be related to the inhibition of PI3K/Akt and CCKBR pathway coupling.
胰腺癌在工业化国家中属于高发的恶性肿瘤，我国每年有约5.2万男性和3.8万女性被确诊为胰腺癌[1]。确诊后，该病的平均生存期小于半年，5年生存率小于10%[1-2]。如此凶险的预后与胰腺癌起病的隐匿有关。因早期缺乏特异症状，胰腺癌在确诊时多已丧失行手术治疗的机会。而胰腺癌细胞对放疗及化疗均不敏感，致使患者预后差。
胰岛素受体（insulin receptor，IR）和胰岛素样生长因子1型受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF1R）均属于受体酪氨酸激酶家族，二者结构相似，与配体结合后可激活下游信号转导途径，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Janus酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）信号通路，这些通路涉及癌细胞增殖、凋亡、代谢及免疫调节等多个病理过程[3]。人正常的胆囊收缩素（CCK）靶细胞主要表达CCK2型受体（CCK2R），而人胰腺癌细胞则过度表达CCK2R[4-6]。CCK2R属G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR），被激活后可激活磷脂酶C（PLC），进而使4，5-二磷脂酰肌醇（PIP2）分解成1，4，5-三磷酸肌醇（PIP3）和甘油二酯（DAG）。PIP3可激活蛋白激酶B（AKT）并释放细胞内钙储备，DAG则激活蛋白激酶C（PKC）进而激活IR/IGF1R通路中的RAF激酶，使CCK2R和IR/IGF1R两系统发生偶联[7-8]。CCK2R与IR/IGF1R之间的偶联解释了为何单纯阻断CCK2R或IR/IGF1R均不能有效地抑制胰腺癌。本研究旨在联合应用IR/IGF1R抑制剂EGCG和CCK2R抑制剂YF476阻断CCK2R与IR/IGF1R之间的偶联，进而抑制胰腺癌细胞的增殖和糖酵解，从而为胰腺癌的治疗提供新靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
人源性胰腺癌原位细胞MiaPaCa-2购自中国科学院上海细胞库。细胞培养用DMEM培养基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶购自于美国Gibco公司，无糖无酚红DMEM（#D6540）、EGCG（#E8120）和青霉素、链霉素购自北京索莱宝科技有限公司，CCK受体抑制剂YF476（#HY-14850）购自于美国MedChemExpress公司。CCK8增殖毒性检测试剂盒（#C0037）购自北京碧云天公司。葡萄糖乳酸检测试剂盒购自南京建成生物技术有限公司，磷酸化IR（p-IR）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、磷酸化PLC（p-PLC）和磷酸化Akt（p-Akt）抗体购自美国CST公司，己糖激酶-2（HK-2）、丙酮酸激酶（PKM）、乳酸脱氢酶（LDH）、胆囊收缩素受体（CCKBR）、β-tubulin和β-actin抗体购自美国Sanata Cruz公司，辣根过氧化物酶（HRP）的山羊抗兔抗体和山羊抗小鼠抗体购自上海良森生物科技有限公司，小鼠抗山羊抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。增强化学发光底物检测试剂盒购自美国Perkin Elmer公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养于37℃，5%CO2的培养箱中。
1.2.2 CCK8法检测EGCG和YF476对MiaPaCa-2细胞增殖的影响
选择对数生长期的MiaPaCa-2细胞，用0.25%胰酶将其消化成单细胞悬液，调整细胞浓度，以每孔5×103个细胞接种于96孔板，随后置于37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h。用不含血清的DMEM稀释EGCG和YF476，使其终浓度分别50 μmol/L和0.1 nmol/L。将细胞分为四组，分别为对照组、EGCG组、YF476组、EGCG和YF476联合组（E＋Y组），每组加入不含血清的DMEM、50 μmol/L的EGCG、0.1 nmol/L的YF476、50 μmol/L的EGCG和0.1 nmol/L的YF476，每组设置10个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中分别孵育24、48 h。到达孵育时间后，于96孔板中每孔加入10 μL CCK8溶液，继续培养2 h后，于酶标仪中在450 nm处测定各孔的光密度（OD）值。按以下公式计算细胞增殖抑制百分比（%）=实验孔OD值/对照孔OD值×100%。
1.2.3 葡萄糖乳酸试剂盒检测EGCG和YF476对MiaPaCa-2糖酵解的影响
MiaPaCa-2细胞经胰腺消化制成单细胞悬液后，均匀接种于6孔板，待细胞融合密度达到90%以上，将无葡萄糖无酚红DMEM配置成含11.1 mmol/L葡萄糖的溶液，再用此溶液配制终浓度为50 μmol/L的EGCG、0.1 nmol/L的YF476以及同时含50 μmol/L的EGCG和0.1 nmol/L的YF476（E＋Y组），对照组为含11.1 mmol/L葡萄糖的无酚红DMEM溶液，将上述溶液孵育MiaPaCa-2细胞6 h，收集细胞上清液，按照葡萄糖和乳酸检测试剂盒说明书检测上述细胞上清液中葡萄糖乳酸的含量。细胞的葡萄糖消耗和生成乳酸计算方法见本课题组前期研究[9-10]。
1.2.4 Western blot法检测EGCG和YF476对MiaPaCa-2糖酵解酶和相关信号通路蛋白的影响
将处于对数生长期的MiaPaCa-2细胞消化成单细胞悬液，接种于6孔板，待细胞密度达90%以上，用不含血清的DMEM培养基配制终浓度为50 μmol/L的EGCG、0.1 nmol/L的YF476以及同时含50 μmol/L的EGCG和0.1 nmol/L的YF476（E＋Y组），对照组为不含血清的DMEM，处理细胞6 h，弃掉上清液，用RIPA裂解细胞，收集蛋白并检测蛋白浓度。取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，用Western blot法测糖酵解酶和相关信号通路蛋白的表达。一抗4℃孵育过夜，加入与一抗相对应的二抗室温孵育2 h，以β-actin作为内参，增强化学发光底物试剂盒检测曝光，结果应用Image J 软件进行分析。
1.3 统计学方法
数据用SPSS 22.0行统计学分析，符合正态分布的计量数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2细胞增殖的影响
CCK-8结果显示，单独应用EGCG、YF476均能抑制人胰腺癌MiaPaCa-2细胞的增殖，且48 h作用效果优于24 h作用效果，二者联合应用对癌细胞的抑制作用较单独应用时的效果显著，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
表1EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2细胞增殖的影响
注：a与同时点对照组比较，P<0.05；b与EGCG组比较，P<0.05；c与YF476组比较，P<0.05；d与同组24 h比较，P<0.05
2.2 EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2糖酵解的影响
胰腺癌MiaPaCa-2细胞在6 h培养条件下的葡萄糖消耗量为（24.69±6.20）nmol/μg蛋白、乳酸生成量为（6.19±0.75）nmol/μg蛋白，EGCG单独作用6 h可减少细胞葡萄糖的消耗和乳酸的生成，差异具有统计学意义（P<0.05）。单独应用YF476与对照组的葡萄糖消耗和乳酸生成差异无统计学意义。二者联合应用时，对细胞葡萄糖的消耗和乳酸的生成较单独应用时效果显著，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。Western blot结果显示：EGCG和YF476单独应用抑制了糖酵解酶HK-2、PKM和LDH的表达，当二者联合应用时，对糖酵解酶的抑制作用较单独应用效果显著，差异有统计学意义（P<0.05），见图1、表3。
表2EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影响
注：a与对照组比较，P<0.05；b与EGCG组比较，P<0.05；c与YF476组比较，P<0.05
图1EGCG和YF476单独和联合应用对MiaPaCa-2细胞糖酵解酶表达的影响
表3EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2细胞糖酵解酶表达的影响
注：a与对照组比较，P<0.05；b与EGCG组比较，P<0.05；c与YF476组比较，P<0.05
2.3 EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2对相关信号通路蛋白的影响
EGCG、YF476单独应用抑制了p-IR及其下游信号通路蛋白p-PI3K和p-Akt的表达，同时也抑制了p-CCKBR及其下游信号通路蛋白p-PLC的表达，差异有统计学意义（P<0.05）。二者联合应用的抑制作用比单独应用更强，差异有统计学意义（P<0.05），见图2、表4。
图2EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2细胞信号通路蛋白表达的影响
表4EGCG和YF476单独或联合应用对MiaPaCa-2细胞信号通路蛋白表达的影响
注：a与对照组比较，P<0.05；b与EGCG组比较，P<0.05；c与YF476组比较，P<0.05
3 讨论
癌细胞能分泌某些生长因子并表达相应的受体，通过自分泌机制实现自我支持[11]。这样的自分泌因子包括胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）和转化生长因子（TGF），对应的受体则包括IGF-1的受体IGF1R和EGF/TGF的受体EGFR、人表皮生长因子受体-2（HER2）等[11]。针对这一机制研发的受体抑制剂有很多，有些已在临床试用，但效果却不十分理想[12-13]。胰腺癌细胞自分泌的IGF-1与旁分泌的胰岛素在结构上相似，而IR与IGF1R在结构上也相似[3]。因此，胰岛素和IGF-1既激活自己的受体也激活对方的受体。IR/IGF1R被激活后，信号沿两条通路下传：一条通路由RAS-RAF-MEK-ERK等酶组成，另一条由RAS/IRS1-PI3K-AKT等酶组成，信号通路激活后参与细胞增殖、分化、代谢重编程以及凋亡的调控。EGCG对胰腺癌的抑制作用研究较多，EGCG能明显抑制胰腺癌SW1990细胞的增殖，其机制可能与其诱导SW1990细胞凋亡及调控细胞周期有关[14]。EGCG还可通过PI3K-Akt信号通路诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡[10，15]。本课题组前期研究表明EGCG作为IR/IGF1R抑制剂，通过PI3K-AKT通路抑制缺氧诱导因子1的表达，抑制IR/IGF1R的磷酸化水平，继而抑制癌细胞的增殖、迁移和糖酵解[9-10]。本研究检测了IR/IGF1R下游信号通路蛋白PI3K-AKT的磷酸化水平，其对PI3K-AKT磷酸化水平的抑制作用代表其对IR/IGF1R信号通路的抑制。
胰腺癌细胞较位于其他脏器的癌细胞有更强的生存和迁徙能力[16]，究其原因，胰腺癌细胞除享有自分泌支持外，还享有来自胰岛素的旁分泌支持和来自胃肠激素如CCK/促胰酶素的内分泌支持[5，17]。人正常的CCK靶细胞主要表达CCK2R，而人胰腺癌细胞则过度表达CCK2R[5-6]。CCK2R曾被认为是介导胃泌素促进肿瘤生长的受体，除了在胰腺癌中高表达，还在多种肿瘤中高表达，它可以促进包括胰腺癌在内的多种肿瘤（如肝癌、食管癌、脑垂体癌细胞、小细胞肺癌及非小细胞肺癌）的增殖、黏附、抗凋亡等作用[18]。在胰腺癌中，胃泌素可促进人胰腺癌细胞的抗凋亡作用，并降低其对化疗药的敏感性[19]。CCK可经CCKBR激活ERK1/2与PI3K/AKT通路上游中的小GTP酶Ras，进而引发细胞增殖与抗凋亡作用，也可经Gβγ激活PLC-γ1进而形成IP3，其在促肿瘤作用中涉及的信号通路纷繁复杂，且各条信号通路之间又存在着广泛交叉与联系[20]。本研究通过应用IR/IGF1R抑制剂EGCG和CCKBR抑制剂YF476单独或联合应用，观察其对胰腺癌细胞的抑制作用。结果显示EGCG和YF476单独应用均可抑制胰腺癌细胞的增殖，EGCG单独应用可抑制胰腺癌细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成以及糖酵解酶的表达，而YF476单独应用并未能使胰腺癌细胞葡萄糖的消耗和乳酸的生成减少，其对糖酵解酶的抑制则具有统计学意义，笔者推测可能是单独应用YF476时，其对葡萄糖消耗和乳酸生成的影响未在最佳药物浓度或最佳作用时间，因为本研究主要是观察两药联合应用的效果，所以当二者联合应用具有叠加效果时，并未追求每个药物作用的最佳化。EGCG和YF476单独应用均可抑制PI3K/AKT通路和CCKBR通路磷酸化蛋白的表达水平，二者联合应用对胰腺癌的抑制效果要于单一用药，因此笔者推测EGCG和YF476联合应用可通过抑制IR/IGF1R与CCKBR通路之间的偶联，进而达到抑制胰腺癌的效果。本研究的局限在于仅用了一种胰腺癌细胞系做验证，今后的研究将增加细胞系做深入探讨。
综上所述，EGCG联合YF476能抑制胰腺癌细胞的增殖和糖酵解，其作用机制可能是通过抑制IR/IGF1R和CCKBR通路之间的偶联实现。