摘要
目的：探讨丹黄消炎方对糖尿病性创面MCP-1/MCPIP1/NF-κB通路的影响。方法：将40只Wistar大鼠随机挑出10只作为空白组，剩余30只制备糖尿病大鼠创面模型，并随机分为模型组、丹黄凝胶组、湿润烧伤膏组、空白凝胶组，每组6只，各组每天予相应药物换药一次，干预7天及14天取材，观察大鼠创面情况，ELISA检测大鼠血清中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白细胞介素1β（IL-1β）含量，Western Blot检测大鼠创面组织中单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白（MCPIP1）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、核因子κB蛋白P65（P65）、人核因子κB抑制蛋白α（IKBα）蛋白含量，PCR检测大鼠创面组织中MCP-1、IL-1β mRNA表达量。结果：干预7天及14天后，与模型组比较，丹黄凝胶组和湿润烧伤膏组大鼠创面愈合情况更加良好，丹黄凝胶组和湿润烧伤膏组血清MCP-1、IL-1β水平较低，创面组织MCPIP1含量较高，P65、IKBα、HMGB1蛋白含量较低，创面组织MCP-1、IL-1β mRNA表达量较低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：丹黄消炎方可调节糖尿病溃疡大鼠模型创面的炎症反应，其机制可能是降低MCP-1、HMGB1、P65、IKBα等促炎因子水平，提高MCPIP1等抗炎因子水平。
关键词
Abstract
Objective To investigate the effect of Danhuang Xiaoyan prescription on the MCP-1/MCPIP1/NF-κB pathway in diabetic wounds. Methods Forty Wistar rats were randomly selected, with 10 rats set aside as the blank group and the remaining 30 rats used to establish a diabetic rat wound model. These 30 rats were then randomly divided into the model group, the Danhuang group, the Moist Burn Ointment group, and the blank gel group, with 6 rats in each group. Each group was treated with the corresponding medication once a day. Samples were collected after 7 and 14 days of intervention to observe the wound conditions of the rats. The levels of MCP-1 and IL-1β in the rat serum were detected by ELISA, and the protein contents of MCPIP1, HMGB1, P65, and IKBα in the wound tissues were detected by Western Blot. The mRNA expression levels of MCP-1 and IL-1β in the wound tissues were detected by PCR. Results After 7 and 14 days of intervention, compared with the model group, the wound healing conditions of rats in the Danhuang gel group and the Moist Exposed Burn Ointment group were better, the Danhuang gel group and MEBO group exhibited significantly lower serum MCP-1 and IL-1β levels (P<0.05), higher MCPIP1 content in wound tissues (P<0.05), and reduced protein levels of P65, IKBα, and HMGB1 (P<0.05). The mRNA expression of MCP-1 and IL-1β in wound tissues was also significantly decreased (P<0.05). Conclusion Danhuang Xiaoyan prescription promotes diabetic wound healing in rats by regulating the MCP-1/MCPIP1/NF-κB pathway, modulating inflammation, and reducing pro-inflammatory factors (MCP-1, HMGB1, P65, IKBα) while enhancing anti-inflammatory factors such as MCPIP1.
糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是一种常见且严重的糖尿病并发症，该病具有高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率以及治疗费用高昂等特点。据统计，在全球约5.37亿糖尿病患者中，19%～34%的患者在一生中可能患有DFU，且溃疡复发率很高[1]，20%的DFU患者在1年内复发率约为40%，3～5年的复发率为65%[2]。国内研究表明，DFU患者治疗费用逐年上升，2020年已高达4万余元[3]。因此，寻找更多有效的DFU治疗方法极为关键。本课题团队前期研究中证实，丹黄消炎液可有效有效促进创面愈合，控制感染，改善创面分泌物脓液质地、脓液气味、创面腐肉量等糖尿病足局部创面症状[4-6]，调节炎性细胞浸润，抑制耐药菌感染[7]，促进血管生成和肉芽组织生长[8]，促进上皮间质转化[9]。但其部分机制尚不明确，成为阻碍丹黄消炎方广泛推广应用的瓶颈。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1/CCL2）等多个CC类趋化因子家族成员被证明可能参与促进糖尿病足溃疡创面愈合[10-12]。本研究从MCP-1/MCPIP1/NF-κB介导的炎症反应角度进一步探讨丹黄消炎方对于DFU创面愈合的作用机制，为其临床应用和推广提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
健康清洁级雄性Wistar大鼠40只，8周龄，体质量（200±10）g，购自河北蓝梦生物医药科技有限公司，实验动物许可证号SCXK（京）2017-0005。高脂高糖饲料购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，成分为：大鼠维持饲料67%、猪油10%、蔗糖20%、胆固醇2.5%、胆酸钠0.5%，合格证号SCXK（京）2015-0015。链脲佐菌素（STZ）购自北京索莱宝科技用有限公司，大鼠MCP-1 ELISA试剂盒（货号EK0902）、大鼠IL-1β ELISA试剂盒（货号EK0393）及单核细胞趋化蛋白1诱导蛋白（monocyte chemotactic protein-1 induced protein，MCPIP1）一抗均购自武汉博士德公司，P-IKBα一抗、p-P65一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）一抗、HRP标记山羊抗兔、HRP标记山羊抗小鼠购自武汉三鹰生物技术有限公司，PCR引物购自上海生工生物工程公司，RT-6100酶标仪购自深圳雷杜公司，DEM-3洗板机购自北京拓普公司，VE180电泳装置、VE186转膜装置、5200化学发光仪购自上海天能科技有限公司，StepOne Plus荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。
丹黄消炎液是天津中医药大学第一附属医院的院内制剂（津药制字Z20160001号），药物构成为：黄芪、皂角刺、丹参、当归、大黄、金银花、黄柏，各药物比例为4∶3∶2∶2∶1∶1∶2。丹黄消炎凝胶是丹黄消炎液与卡波姆凝胶制成的中药外用凝胶剂，由天津中医药大学天津市现代中药重点实验室制备，制备所需中药饮片来自天津中医药大学第一附属医院中药房，简要制备流程为：中药材粉碎、煮沸、浸泡、过滤得中药液、中药液与凝胶混合加热至完全溶解、搅拌均匀、冷却至凝胶剂形成。丹黄消炎方在临床中用剂型为洗液剂，在本实验中选用凝胶剂，目的在于剂型改良、扩展适用范围。湿润烧伤膏（美宝）由汕头美宝制药有限公司生产，国药准字Z20000004，用于湿润烧伤膏组。卡波姆凝胶基质（空白凝胶）购自西安拉维亚生物科技有限公司，用于空白凝胶组。本研究通过本院伦理委员会审批（批号：NKYY-DWLL-2020-007）。
1.2 实验方法
1.2.1 造模方法
将所有Wistar大鼠经适应性喂养后，用随机数字表法从40只大鼠中随机挑出10只作为空白组，剩余30只作为糖尿病组。空白组予普通饲料喂养，糖尿病组大鼠进行高脂高糖饲料持续喂养7周。成功诱导胰岛素抵抗后，自大鼠腹腔一次性注射27.5 mg/kg STZ。正常对照组大鼠给予一次性腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射完成3 d后，测大鼠随机血糖值大于16.7 mmol/L者视为成功构建了糖尿病模型。
待糖尿病大鼠模型稳定2周后，建立创面模型，将所有大鼠（包括空白组及糖尿病组）背部剃毛备皮，用电推剪剃毛后，再用脱毛膏进行脱毛，次日禁食不禁水8 h，然后以4%异氟烷诱导麻醉，3%异氟烷维持麻醉。麻醉满意后，将大鼠俯卧位固定在鼠板上，剪开皮肤全程至筋膜，剪去直径2 cm的圆形皮肤及皮下组织后，止血并用生理盐水冲洗创面，即成创面模型。30只大鼠注射STZ后死亡2只，血糖未达标1只，最终成模率90%。
1.2.2 分组及干预
成模后，选取24只大鼠，进一步随机分为4组：模型组、空白凝胶组、丹黄凝胶组、湿润烧伤膏组，每组6只。丹黄凝胶组、湿润烧伤膏组、空白凝胶组分别使用丹黄消炎液凝胶、湿润烧伤膏、空白凝胶换药，模型组、空白组每天用棉签蘸取生理盐水浸润清洁创面，无菌辅料包扎。各组换药频次均为1次/d。
1.2.3 取材
干预后第7、14天，分别对各组大鼠进行血样及创面组织取材：自每只大鼠目内眦取血约2 mL，室温放置1 h后，以3500 r/min离心10 min后取血清，-80℃冻存，用于ELISA检测。自创面组织取材，麻醉满意后沿着创面边缘约2 mm处环形取下整个创面，深度至筋膜层。将取下的圆形创面组织置于磷酸盐缓冲液（PBS）中进行清洗至无血液成分残留，清洗完毕后，每份样本剪切为大小均等的4份样本，用锡箔纸包裹后于-80℃冻存，用于Western Blot检测和RT-qPCR检测。
1.3 指标检测
1.3.1 ELISA检测大鼠血清中MCP-1、IL-1β含量
取经过预处理的各组大鼠血清样本，按照试剂盒说明书进行所有操作，用酶标仪于450 nm波长测各孔吸光度，根据标准曲线计算MCP-1、IL-1β含量。
1.3.2 Western Blot检测大鼠创面组织中MCPIP1、HMGB1、P65、p-IKBα蛋白含量
按照免疫印记法操作步骤，取各组大鼠创面组织样本，PBS洗涤后，剪成小块置于匀浆管中，加入细胞裂解液，匀浆后，置于冰上裂解30 min，以15 000 r/min离心10 min，收集上清液为蛋白样本。经电泳、转膜、封闭、洗膜后，加入MCPIP1（1∶1000）、HMGB1（1∶1000）、P65（1∶1000）、p-IKBα（1∶1000）、β-actin（1∶10000）抗体封闭，4℃孵育摇床过夜，加HRP标记二抗（1∶5000）室温孵育1 h，洗膜后用ECL显影，使用成像分析仪成像，Image J分析蛋白条带灰度值。
1.3.3 RT-qPCR检测大鼠创面组织中MCP-1、IL-1β mRNA表达量
取100 mg组织和1 mL的Trizol，使用匀浆仪充分研磨，经相分离、沉淀、洗涤、溶解，提取出RNA，并逆转录为cDNA。进行荧光定量PCR，反应条件为95℃ 1 min，95℃ 15s，60℃ 60s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法解析目的基因的mRNA表达量（β-actin为内参基因）。引物序列见表1。
表1引物序列
1.4 统计学分析
采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料用均值±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义，绘图采用GraPhPad Prism 10软件。
2 结果
2.1 大鼠创面愈合情况
干预第7天，各组创面较前均有缩小趋势，其中空白组创面面积最小，其余4组创面面积相似。各组创面基底部可见新鲜肉芽组织生长，空白组最显著，其次分别是湿润烧伤膏组、丹黄凝胶组、空白凝胶组、模型组，模型组和空白凝胶组仍可见少量的分泌物。空白组、湿润烧伤膏组和丹黄凝胶组出现创面局部结痂伴上皮化。
干预第14天，各组创面面积继续缩小，其中空白组已趋于愈合，其次是丹黄凝胶组、湿润烧伤膏组、空白凝胶组、模型组。各组创面颜色淡红，丹黄凝胶组创面被痂皮覆盖，模型组和空白凝胶组仍可见少量的分泌物。总体看来，空白组愈合趋势最佳，其次是丹黄凝胶组和湿润烧伤膏组，最后是空白凝胶组和模型组。大鼠创面愈合情况见图1。
图1各组大鼠创面愈合情况
2.2 不同时间点丹黄消炎方对大鼠血清MCP-1、IL-1β水平的影响
干预第7天和第14天时，与模型组比较，丹黄凝胶组、湿润烧伤膏组MCP-1、IL-1β水平均明显降低（P<0.05），空白凝胶组MCP-1、IL-1β水平差异无统计学意义（P＞0.05）；湿润烧伤膏组与丹黄凝胶组MCP-1、IL-1β水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。
表2干预7、14天各组大鼠血清MCP-1、IL-1β水平比较
注：a与模型组比较，P<0.05
2.3 不同时间点各组大鼠创面组织中的MCPIP1、HMGB1、p-P65、p-IKBα蛋白含量比较
干预第7天和第14天时，与模型组相比，湿润烧伤膏组、丹黄凝胶组的MCPIP1含量明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），P65、IKBα、HMGB1含量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），空白凝胶组的MCPIP1、HMGB1、p-P65、p-IKBα蛋白含量差异无统计学意义（P＞0.05）。湿润烧伤膏组与丹黄凝胶组的MCPIP1、HMGB1、p-P65、p-IKBα含量差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、3。
2.4 不同时间点各组大鼠创面组织中MCP-1、IL-1β mRNA表达量比较
干预第7天和第14天时，与模型组比较，湿润烧伤膏组、丹黄凝胶组MCP-1、IL-1β mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），空白凝胶组MCP-1、IL-1β mRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。湿润烧伤膏组与丹黄凝胶组MCP-1、IL-1β mRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。
3 讨论
糖尿病足溃疡属于中医学“脱疽”的范畴。《针灸甲乙经》[13]记载道：“发于足趾，名曰脱疽，其状赤黑不死，治之不衰，急斩去之，治不去必死矣。”结合古代和现代医家学术思想，王军教授认为糖尿病足溃疡的主要病机有三：正虚、血瘀、毒侵。针对此三大病机，王军教授根据自己多年临床诊疗经验，结合对古今医学的传承发掘开发出丹黄消炎方，该方由黄芪、丹参、当归、皂角刺、大黄、金银花、黄柏等药物组成，具有扶正、活血、解毒的功效，是本院治疗糖尿病足溃疡以及各种难愈性创面的主要外用药物。本方中，黄芪和丹参共为君药，黄芪，性微温、味甘，能补气固表、托毒排脓、敛疮生肌。丹参，性微寒、味苦，能活血祛瘀、凉血消痈。当归、皂角刺为臣药。当归，性温，味甘、辛，具有补血活血、调经止痛的功效。当归配上黄芪、丹参两味君药，既能补气生血，又能补血活血，达到扶正活血的功效。皂角刺，性温、味辛，可透毒排脓，配伍黄芪可扶正托毒。大黄、银花、黄柏为佐药，三者均为清热解毒类中药，常用于治疗痈疽、疔疮，共达清热解毒、燥湿消肿之效。全方各药配伍，共凑补气养血、活血化瘀、解毒消痈、托毒生肌之效。王军教授团队经过20余年的临床应用和相关研究，发现丹黄消炎液可有效有效促进创面愈合，控制感染，改善创面分泌物脓液质地、脓液气味、创面腐肉量等糖尿病足局部创面症状。
图2不同时间点大鼠创面组织中的MCPIP1、HMGB1、p-P65、p-IKBα蛋白条带图
图3不同时间点大鼠创面组织中MCPIP1、HMGB1、p-P65、p-IKBα含量比较
表3干预7、14天各组创面组织中MCP-1、IL-1β mRNA表达量比较
注：a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
MCP-1属于CC趋化因子家族，已被证实在多种炎症、免疫反应中发挥重要作用[14]。创面修复是一个复杂的生物学过程，MCP-1参与了创面修复的全部过程，介导了炎症的启动及消退。在创伤后24h内，中性粒细胞吞噬创面中细胞碎片，释放MCP-1等趋化因子，促进单核细胞向伤口募集[15-16]。糖尿病性创面中抗炎趋化因子如IL-10减少，导致MCP-1表达失调，蛋白水平持续升高，致使巨噬细胞发生强烈而持久的浸润反应，创面炎症难以消退，从而愈合缓慢，形成慢性难愈性创面[14]。MCPIP1又称MCP-1诱导蛋白，由MCP-1等多种因子刺激表达而来，是体内重要的诱导性的炎症反应抑制因子，在免疫炎症反应中高度表达，近年来因为其在免疫调节及抑制炎症方面的显著作用而备受关注。MCPIP1是调节NF-κB炎症信号通路中的关键分子，起到负向调控NF-κB通路活化、减轻炎症反应的作用[17]。HMGB1是一种免疫炎症因子，广泛分布于各类细胞的细胞核与细胞质中[18]。MCP-1与HMGB1在炎症反应中形成正反馈作用，在高糖环境中，HMGB1从细胞核转移至胞质和胞外，通过激活多种信号通路（如ERK、JNK、p38）促进MCP-1的表达，加剧炎症反应[19]。而MCP-1进一步招募免疫细胞，释放更多HMGB1和其他炎症因子，放大炎症级联反应。
本研究结果表明，丹黄消炎凝胶可降低大鼠血清MCP-1、IL-1β水平及创面组织中的HMGB1、P65、p-IKBα蛋白含量，减少炎症反应，下调MCP-1和IL-1β的mRNA表达，提高抗炎因子MCPIP1蛋白含量，负向调控NF-κB炎症通路。此外，丹黄凝胶组与阳性药物湿润烧伤膏组比较，结果差异并无统计学意义，证明丹黄消炎方抑制炎症效果不弱于当前临床认可的湿润烧伤膏。空白凝胶组与模型组结果差异并无统计学意义，排除了凝胶基质的干扰，进一步证明是中药丹黄消炎方的所起的作用。
综上所述，丹黄消炎方可以调节糖尿病溃疡大鼠模型创面的炎症反应，促进大鼠糖尿病性创面愈合。其机制可能是降低MCP-1、HMGB1、P65、IKBα等促炎因子水平，提高MCPIP1等抗炎因子水平。