摘要
目的：建立糖尿病合并动脉硬化致下肢慢性缺血的大鼠模型，研究清热活血方调节糖尿病下肢血管病变蛋白激酶C（PKC）信号通路的作用机制。方法：选用50只SPF级大鼠，高脂饲料喂养、腹腔注射链脲佐菌素诱导2型糖尿病，应用血管内球囊损伤股动脉血管内皮的方法制作糖尿病合并动脉硬化致下肢慢性缺血的动物模型。随机分为模型组（等体积纯净水）、辛伐他汀组[3.6 g/(kg•d)]、清热活血方小剂量组[6.3 g/(kg•d)]、清热活血方大剂量组[12.6 g/(kg•d)]，另设假手术组（等容积纯净水），每组10只，定时灌胃给药，连续4周。其中假手术对照组仅穿刺血管、交换导丝，不损伤股动脉，不注射链脲佐菌素，给予普通饲料喂食。取大鼠患侧血管进行病理切片，并以HE、Masson染色观察血管结构变化，以及胶原、平滑肌细胞、内皮细胞在血管壁的分布。用常规生物化学法测定血葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平、用ELISA法检测晚期糖基化终末产物（AGEs）含量；用Western blotting法检测蛋白激酶C（PKC）、肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）、血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运蛋白（GLUT-4）及血管生成素-1（ANG-1）的表达水平。结果：与假手术组比较，模型组血管厚度不均，血管内膜增生，中膜增厚，血管平滑肌细胞数量增多，排列不均；各治疗组均有所改善。与假手术组比较，模型组GLU、TC、TG、AGEs、GLUT4、PKC、VEGF水平升高（P<0.05），HDL、LDL具有升高趋势，但无统计学差异（P>0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组GLU水平明显升高（P<0.05），其余指标均有不同程度好转；与模型组比较，清热活血方小剂量组TG、TC、AGES水平显著降低（P<0.05），PKC、VEGF、IP3R、Ang-1、GLUT4水平显著升高（P<0.05），HDL、LDL水平有所好转，但无统计学差异（P>0.05）；清热活血方大剂量组GLU、TC、TG水平显著降低（P<0.05），PKC、Ang-1、VEGF、IP3R水平显著升高（P<0.05）。结论:清热活血方可以显著改善大鼠体内的糖脂代谢，促进新生血管生成，减轻血管胶原纤维沉积，抑制糖尿病大鼠下肢血管腔内损伤后动脉粥样硬化的发展，其机制与调节PKC/IP3R/GLUT4信号通路的相关蛋白表达相关。
Abstract
Objective To through the rat model of chronic ischemia of lower limbs caused by diabetes combined with arteriosclerosis, to study the mechanism of Qingre Huoxue formula regulating PKC signaling pathway in lower limb angiopathy of diabetes. Methods Fifty SPF-grade rats were selected, and type 2 diabetes was induced by feeding them a high-fat diet and intraperitoneal injection of streptozotocin. An animal model of chronic lower limb ischemia caused by diabetes complicated with arteriosclerosis was established by intravascular balloon injury to the femoral artery endothelium. The rats were randomly divided into 5 groups with 10 rats in each group: model group (equal volume of purified water), simvastatin group[3.6 g/(kg•d)], small-dose Qingre Huoxue formula group [6.3 g/(kg•d)], large-dose Qingre Huoxue formula group [12.6 g/(kg•d)], and sham operation group (equal volume of purified water). Gastric administration was performed regularly for 4 consecutive weeks. The sham operation control group only received vascular puncture and guidewire exchange without femoral artery injury, no streptozotocin injection, and was fed with a normal diet. Pathological sections were prepared from the affected blood vessels of the rats. HE and Masson staining were used to observe the changes in vascular structure, as well as the distribution of collagen, smooth muscle cells, and endothelial cells in the vascular wall. Routine biochemical methods were used to determine the levels of glucose (GLU), total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). ELISA was used to detect the content of advanced glycation end products (AGEs). Western blotting was used to detect the expressions of protein kinase C (PKC), inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R), vascular endothelial growth factor (VEGF), glucose transporter-4 (GLUT-4), and angiopoietin-1 (ANG-1). Results Vascular pathology showed that compared with the sham surgery group, the model group had uneven vascular thickness, with hyperplasia of the intima and media, increased number and uneven arrangement of VSMCs; All treatment groups showed improvement. Compared with the sham surgery group, the levels of GLU, TC, TG, AGEs, GLUT4, PKC, and VEGF in the model group increased (P<0.05), and there was an increasing trend in HDL and LDL, but there was no statistical difference (P>0.05); Compared with the model group, the simvastatin group showed a significant increase in GLU levels (P<0.05), while other indicators showed varying degrees of improvement (P>0.05); Compared with the model group, the levels of TG, TC, and AGES in the low-dose group were significantly reduced (P<0.05), while the levels of PKC, VEGF, IP3R, Ang-1, and GLUT4 were significantly increased (P<0.05). The levels of HDL and LDL improved, but there was no statistical difference (P>0.05); High dose group GLU TC、TG, The levels of PKC, Ang-1, VEGF, and IP3R significantly decreased (P<0.05), while the levels of PKC, Ang-1, VEGF, and IP3R significantly increased (P<0.05). Conclusion Qingre Huoxue formula can significantly improve the metabolism of glucose and lipid in rats, promote the formation of new blood vessels, reduce the deposition of vascular collagen fibers, and inhibit the development of atherosclerosis after intravascular injury in lower limbs of diabetes rats. Its pathological mechanism is related to the expression of related proteins regulating PKC/IP3R/GLUT4 signaling pathway.
糖尿病下肢血管病变（lower extremity arterial disease in diabetic patient，LEADDP）是由糖尿病（diabetic mellitus，DM）长期发展所致外周动脉疾病（peripheral arterial disorder，PAD）最常见的类型之一[1]。LEADDP的临床主要表现为下肢间歇性跛行、麻木、感觉减退、静息痛、踝肱指数异常，甚至出现破溃[1]。研究表明，DM相关截肢率在全球大部分地区呈增加趋势，且80%以上的大截肢由慢性肢体威胁性缺血（chronic limb-threatening ischemia，CLTI）引起[2]。在我国，糖尿病引起的下肢截肢率为19.03%，超过因糖尿病相关PAD接受膝以上截肢的人，永远不会恢复到非卧床状态，给患者家庭和社会带来了巨大的负担[1，3]。目前研究表明，蛋白激酶C（PKC）通路参与控制细胞的增殖、分化、存活、侵袭、迁移和凋亡的多种信号传导系统，PKC被认为是治疗心血管疾病、癌症等疾病的重要靶点[4]，干预与其相关的PKC/IP3R/GLUT4信号通路可能是治疗LEADDP的关键。
中医认为“血瘀”是导致血管病变的重要病机[3]。糖尿病属“消渴”，病机为阴虚热盛[5]。临床实践中，清热活血方以莪术、鸡血藤为君，黄连、葛根为臣，地龙为佐，桂枝为使治疗LEADDP，在活血化瘀的基础上辅以清热滋阴，能有效缓解症状，促进伤口愈合。本研究通过动物实验分析清热活血方对大鼠糖脂代谢的影响，并探索该方干预PKC/IP3R/GLUT4信号通路的机制，以期提高LEADDP的治疗水平。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选用雄性SPF级SD大鼠50只，体质量（350～500）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。饲养于中国中医科学院西苑医院屏障级动物室，许可证号：SYXK（京）2018-0018。本实验经中国中医科学院西苑医院医学伦理委员会批准（批准号：2021XLC053-2）。
1.2 实验药物
清热活血方共煎后浓缩，由中国中医科学院西苑医院制剂室提供。辛伐他汀片（10 mg/片），由哈药集团三精明水药业有限公司生产（批号：1202005）。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）由美国Sigma-Aldrich公司生产（批号：XBB2432V）。
1.3 主要试剂及仪器
高脂饲料购自北京科奥协力饲料有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0012。晚期糖基化终末产物（AGEs）试剂盒（批号：20211220）购自南京建成生物工程研究所。PKC抗体（批号：1608-1）购自美国Epitomics公司。肌醇1，4，5-三磷酸受体（IP3R）抗体（批号：GTX133104）购自美国GeneTex公司。血管内皮生长因子（VEGF）（批号：Ab46154）、葡萄糖转运蛋白（GLUT-4）抗体（批号：Ab216661）、血管生成素-1（ANG-1）抗体（批号：Ab102015）均由英国Abcam科技公司生产，北京科忠智生物技术开发有限公司提供。Cobas 6000型全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司），E1101型电泳仪（美国Bio-Rad公司），ACCU-CHEK血糖仪（德国Roche诊断有限公司）。
1.4 球囊诱导的糖尿病下肢缺血模型建立
参照课题组前期方法[6]，高脂饮食诱导加小剂量（25 mg/kg）STZ构建高脂糖尿病大鼠模型。以快速血糖＞11.1 mmol/L为建模成功标准。
2 %戊巴比妥钠腹腔注射（0.2 mL/100g）麻醉仰卧位固定大鼠。腹股沟中点作纵行2 cm切口。充分暴露股浅动脉至髂外动脉，1%利多卡因局部浸润股动脉。穿刺入股总动脉，导入导丝及球囊，球囊压力2~4 atm，持续30 s，并沿血管走形轻柔推拉球囊，反复2次后，撤除球囊、导丝。于股总动脉中段、股浅动脉近端不完全结扎。逐层缝合关闭切口。术后肌内注射青霉素钠20万U/（kg•d），连续注射3 d预防感染，建立慢性下肢缺血模型。
1.5 动物分组及给药
术后1周，将40只大鼠按随机数表随机分为4组，每组10只：模型组，灌胃等量纯净水；辛伐他汀组[3.6 mg/（kg•d）]；清热活血方小剂量组[6.3 g/（kg•d）]；清热活血大剂量组[12.6 g/（kg•d）]。余10只大鼠设为假手术组（仅穿进导丝不进行球囊损伤后正常缝合，灌胃等量纯净水，普通饲料喂食），给药组大鼠灌胃等容积药物混悬液，除假手术组外均继续喂食高脂饲料，每组10只大鼠，连续给药4周。
1.6 观察指标及方法
灌胃4周后处死大鼠，腹主动脉取血5 mL，采用已糖激酶法检测大鼠葡萄糖（GLU）；酶比色法检测总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）；比色法检测甘油三酯（TG）水平；酶联免疫吸附法（ELISA）检测AGEs。钝性分离大鼠右侧股动脉后包埋、切片并进行HE、Masoon染色，光学显微镜观察血管病理形态改变。Western blotting检测PKC、IP3R、Ang1、GLUT4、VEGF等蛋白表达水平。
1.7 免疫蛋白印迹（Western blotting）检测PKC、IP3R、Ang-1、GLUT4、VEGF等蛋白表达水平
根据大鼠股动脉组织重量以1∶9比例加入裂解液，低温状态匀浆、离心后取上清分装保存。BCA法测得各组指标血清蛋白浓度，加入RIPA调整蛋白浓度至4 mg/mL。每孔检测蛋白样品20 μg，以90 V电压浓缩样品20 min，以160 V分离蛋白样品，转模后用丽春红试剂染色观察转模效果。用3%BSA-TBST稀释一抗：PKC（总）（1∶1000）、IP3R（1∶1000）、VEGF（1∶2000）、Ang-1（1∶1000）、GLUT-4（1∶1000）。用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗：山羊抗兔IgG（H+L）辣根过氧化物酶（1∶10 000）、山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶100 000）。ECL加到膜上后反应3~5 min并曝光、定影。
1.8 统计学方法
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，多组比较采用方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 清热活血方对糖尿病下肢球囊损伤致下肢缺血模型病理形态的影响
HE染色结果显示，假手术组血管形态规则，内膜平滑，管壁厚度均一，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）分布均匀紧凑；模型组血管管壁厚度不均，血管内膜增生、中膜增厚，VSMC数量增多，排列不均；3个治疗组血管壁厚度均有所减少，清热活血方大、小剂量组的VSMC数量减少更为明显。Masoon染色显示，假手术组血管壁仅有少量胶原纤维沉积（染色为蓝色），模型组胶原纤维沉积明显，清热活血方小剂量组改善最佳，见图1。
2.2 清热活血方对糖尿病下肢球囊损伤致下肢缺血模型糖脂代谢的影响
与假手术组比较，模型组血清GLU、AGEs、TC、TG水平升高（P<0.05）。与模型组比较，辛伐他汀组血清GLU水平明显升高，清热活血方大剂量组血清GLU水平明显降低，清热活血方小剂量组AGEs水平明显降低，3个治疗组TC、TG水平明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；清热活血方大、小剂量对HDL、LDL的影响不显著（P>0.05），见表1。
2.3 清热活血方对糖尿病下肢球囊损伤致下肢缺血模型PKC通路蛋白表达的影响
与假手术组比较，模型组PKC、VEGF、GLUT4含量升高（P<0.05）；与模型组比较，辛伐他汀组Ang-1、GLUT4升高，清热活血方小剂量组PKC、IP3R、Ang-1、VEGF、GLUT4含量升高，清热活血方大剂量组PKC、IP3R、Ang-1、VEGF含量升高，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
图1大鼠股动脉HE染色、Masoon染色结果（×200）
3 讨论
中医虽无PAD病名，但常根据其临床表现及发病特点，可将其归属于“脉痹”“脱疽”范畴。《针灸甲乙经》描述其“发于足趾名曰脱疽，其状赤黑，不死，治之不衰，急斩去之，治不去必死矣”。此疾病具有症状明显、患者生活质量差、预后欠佳、社会和经济负担重等特点，宜早期干预、防治并重[7]。脉痹多继发于消渴，基本病机为阴津亏损，燥热为盛，日久损伤脉络，发而为病，病位在血管[8]。《濒湖脉学•经脉与脉气》云：“脉乃血派，气血之先，血之隧道，气息应焉。”脉为机体供养全身的通道，气血津液通行其中，治疗脱疽既要活血通脉，亦不可忽视清养肺胃之阴。陈可冀院士善从血瘀论治脉痹，在长期临床实践过程中认识到此类患者致病具有“阴虚燥热、血行壅滞”的特点，拟清热活血方，方中莪术破血消癥通络、鸡血藤补气活血通络两者共为君药；葛根清热生津通络、黄连泻火解毒为臣；地龙活血通络为佐；桂枝温经通脉，引归四肢为使。六药共用活血化瘀，加以虫类药物、藤类药物强化活血通络，兼以益气养阴生津，攻补兼施，共奏清热活血、养阴通络之功，为中医药治疗糖尿病性周围血管病提出了新思路。现代药理学表明清热活血方有降血糖、抗炎[9-10]、抗氧化[11]、抗血栓、抗纤维化[12]、抑制VSMC异常增生[13-14]、扩张血管[15]等作用。糖尿病作为心脑血管病及周围血管病的高危因素之一，高血糖状态是引起各种并发症的重要诱因[16]。
表1各组大鼠糖脂代谢指标比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
表2各组大鼠模型PKC通路蛋白水平比较
注：a与假手术组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
本研究结果显示，清热活血方对于血脂的影响与辛伐他汀类似。此外，辛伐他汀组升高了GLUT4的含量，与以往研究结果类似[17]。但有前期研究发现他汀类药物降低了胰岛素敏感性，加重了胰岛素抵抗[18]，其机制需进一步研究。AGES与RAGE结合激活二酰基甘油-蛋白激酶C（DAG-PKC）通路[19]。在磷脂酶C（PLC）的作用下使磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）断裂为DAG与IP3两个部分，DAG可于质膜上与PKC结合，活化PKC，PKC的活性还与细胞液内Ca2+的浓度有关。IP3与内置网上的IP3R结合导致细胞内Ca2+浓度增加，进一步造成PKC活性增强[20]。有研究表明PKC的激活可导致GLUT4的转位[21]，与本实验结论相同。VEGF促进新生血管生成，Ang-1使新生血管成熟、稳定[22]。PKC可通过激活ERK1/2通路诱导VEGF的转录，促进血管新生[23]，PKC还可通过激活NADPH氧化酶和HIF-1α通路，促进细胞分泌Ang-1，加速血管生成[24]。本研究结果发现清热活血方大、小剂量组均可显著升高VEGF、Ang-1的水平，促进侧支循环生成，使远端组织得到有效的血液供应。
综上所述，清热活血方可通过激活PKC通路改善大鼠糖脂代谢、进血管新生，以延缓动脉粥样硬化的发生发展，为中医药治疗2型糖尿病性周围血管病提供了依据。