摘要
目的：基于过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）/肉毒碱棕榈酰转移酶-1（CPT-1）信号通路探讨补阳还五汤改善2型糖尿病（T2DM）合并高脂血症脂质代谢紊乱的作用机制。方法：将40只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、辛伐他汀组和补阳还五汤组，每组10只。除空白组外均采用高脂高糖饮食+链脲佐菌素法建立T2DM合并高脂血症大鼠模型，空白组、模型组用生理盐水灌胃，辛伐他汀组给予辛伐他汀2.1 mg·kg-1·d-1灌胃，补阳还五汤组给予补阳还五汤6.39 g·kg-1·d-1灌胃，给药8周取材，期间监测大鼠血糖水平。采用HE染色观察大鼠肝脏组织病理变化，生化法检测血清脂质代谢指标总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇水平，酶联免疫吸附测定法检测血清视黄醇结合蛋白4（RBP4）水平，采用聚合酶链式反应及蛋白免疫印迹法检测肝脏组织PPARα及CPT-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果：与空白组比较，模型组大鼠空腹血糖升高，肝细胞脂肪变性且有淋巴细胞浸润，血清脂质代谢指标异常，血清RBP4水平升高，肝脏组织中PPARα和CPT-1 mRNA和蛋白的表达量下降，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，补阳还五汤组第8周空腹血糖降低，补阳还五汤组与辛伐他汀组肝细胞脂肪变性显著减少，未见明显炎性细胞浸润，血清脂质代谢指标显著改善，肝脏组织中PPARα和CPT-1 mRNA和蛋白表达升高，补阳还五汤组的血清RBP4含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：补阳还五汤可能通过激活脂质代谢信号通路PPARα/CTP-1，从而提高酶活性、加速脂肪酸转运及氧化分解、减少脂质沉积，进而起到治疗T2DM合并高脂血症的作用。
关键词
Abstract
Objective To explore the mechanism of Buyang Huanwu decoction in improving lipid metabolism disorder in type 2 diabetes mellitus (T2DM) complicated with hyperlipidemia based on the peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPARα)/carnitine palmitoyltransferase-1 (CPT-1) signaling pathway.Methods Forty male SD rats were randomly divided into blank group, model group, simvastatin group and Buyang Huanwu decoction group, with 10 rats in each group. Except for the blank group, the other groups were established with a rat model of T2DM complicated with hyperlipidemia by a high-fat and high-sugar diet + streptozotocin (STZ) method. The blank group and model group were given normal saline by gavage, the simvastatin group was given simvastatin at 2.1 mg·kg-1·d-1 by gavage, and the Buyang Huanwu decoction group was given Buyang Huanwu decoction at 6.39 g·kg-1·d-1 by gavage. The rats were sacrificed after 8 weeks of treatment, the blood glucose levels of the rats were monitored during this period. HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissue, and biochemical methods were used to detect the levels of total cholesterol, triglycerides, low-density lipoprotein cholesterol and high-density lipoprotein cholesterol in serum. The levels of serum retinol binding protein 4 (RBP4) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The expressions of PPARα and CPT-1 mRNA and protein in liver tissue were detected by polymerase chain reaction and Western blotting. Results Compared with the blank group, the model group had elevated fasting blood glucose, fatty degeneration of liver cells and lymphocyte infiltration, abnormal lipid metabolism indicators in serum, elevated serum RBP4 levels, and decreased expressions of PPARα and CPT-1 mRNA and protein in liver tissue, with statistically significant differences (P<0.05). Compared with the model group, the Buyang Huanwu decoction group had decreased fasting blood glucose at the 8th week, significantly reduced fatty degeneration of liver cells, no obvious inflammatory cell infiltration, significantly improved lipid metabolism indicators in serum, increased expressions of PPARα and CPT-1 mRNA and protein in liver tissue, and decreased serum RBP4 content, with statistically significant differences (P<0.05).Conclusion Buyang Huanwu decoction may play a therapeutic role in T2DM combined with hyperlipidemia by activating the lipid metabolism signaling pathway PPARα/CPT-1, thereby increasing enzyme activity, accelerating the transport and oxidation of fatty acids, and reducing lipid deposition.
2 型糖尿病（type2 diabetes mellitus，T2DM）人群高脂血症的患病率高达85%，其主要类型为混合性血脂异常[1]。T2DM合并高脂血症显著增加了动脉粥样硬化、心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）以及卒中的风险，是导致T2DM患者死亡后果的重要因素之一[2]，因此控制糖尿病患者的血脂水平尤为重要。
中医药治疗具有多靶点、多途径、整体协调防治等优势。研究表明，补阳还五汤可以降低血脂、血糖水平，减轻胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），改善糖脂代谢[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体α/肉毒碱棕榈酰转移酶-1（peroxisome proliferator-activated receptor α/carnitine palmitoyltransferase-1，PPARα/CPT-1）信号通路是调控机体脂质代谢的重要通路，但补阳还五汤能否通过上调PPARα/CPT-1通路从而改善T2DM合并高脂血症脂质代谢紊乱目前尚不明确，故本研究以T2DM合并高脂血症大鼠模型为研究对象，探究补阳还五汤对其脂质代谢紊乱的影响及作用机制，以期为T2DM合并高脂血症的治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 资料
1.1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠40只，体质量160～200 g，8周龄，购自黑龙江中医药大学实验动物中心[SCXK（黑）2023-001]。本实验通过黑龙江中医药大学实验动物伦理审查委员会批准（编号：2024062802）。
1.1.2 药物
补阳还五汤组成：黄芪120 g，当归6 g，赤芍5 g，地龙3 g，川芎3 g，红花3 g，桃仁3 g，购自黑龙江中医药大学附属第一医院中药局，并由煎药室统一煎制。
1.1.3 实验仪器与试剂
GA-3型血糖仪（长沙三诺生物传感股份有限公司），RT-6100型酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司），CFX Connect型实时定量聚合酶链式反应（Real-time polymerase chain reaction，PCR）仪（美国Bio-Rad公司），辛伐他汀片（遂成药业股份有限公司，批号H20083616），逆转录试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒（武汉塞尔维生物科技有限公司，批号分别为G3337、G3326），抗体PPARα、CPT-1（美国Abcam公司，批号分别为ab314112、ab220789），大鼠视黄醇结合蛋白4（retinol binding protein 4，RBP4）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号JL10628）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与造模
实验大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法随机抽取10只作为空白组，给予基础饲料常规饮食。其余30只给予高脂高糖饮食（高脂饲料配方：基础饲料添加15%蛋黄粉，2%胆固醇，10%白砂糖，15%猪油，0.2%胆酸钠，57.8%的基础饲料，购于青岛大任富城畜牧公司）4周后，不禁水，禁食12 h，腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mol/L），空白组腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，注射后2 h恢复高脂高糖饮食，72 h后自尾静脉采血测定随机血糖，以随机血糖≥16.7 mmol/L认定糖尿病模型造模成功[4]，继续高脂高糖饮食，复制高脂血症模型，参考第4版《药理实验方法学》[5]标准，当血清脂质代谢指标有一项水平异常，则认为造模成功。
将30只成模大鼠按随机数字表法分为模型组、辛伐他汀组、补阳还五汤组，每组10只，于糖尿病模型造模成功后2周开始灌胃，补阳还五汤组给予补阳还五汤6.39 g·kg-1·d-1灌胃，辛伐他汀组给予辛伐他汀2.1 mg·kg-1·d-1灌胃，空白组、模型组给予等体积的生理盐水灌胃，1次/d，给药8周。
1.2.2 基本指标监测
观察并记录大鼠进食量，皮毛光泽度，小便量和精神状态。
1.2.3 标本采集
大鼠给药8周后，称重后腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，室温静置2 h，以3 000 r/min离心15 min，血清分离后分装于无菌离心管内。取肝脏组织，生理盐水洗净后分为两部分，一部分置于冻存管液氮速冻，转移至-80℃冰箱保存，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。
1.2.4 血脂、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平检测
取材后由我院检验科检测大鼠血清中的甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；用血糖仪检测大鼠血糖数值。
1.2.5 HE染色观察肝脏病理变化
取固定于4%多聚甲醛溶液的肝脏组织，经梯度乙醇脱水、包埋、切片（4 μm）、脱蜡后，苏木素染色、伊红染色，脱水封片，显微镜下观察。
1.2.6 ELISA法检测血清RBP4水平
严格按照RBP4 ELISA试剂盒说明书测定大鼠的血清RBP4水平。
1.2.7 实时定量PCR检测肝脏PPARα、CPT-1 mRNA水平
提取大鼠肝脏组织总RNA，逆转录后合成cDNA，各引物序列见表1。按照试剂盒的说明书进行实时定量PCR反应，基因扩增条件：95℃预变性30 s；95℃15 s，60℃30 s，共循环40次。用ΔΔCT法对实时定量PCR结果进行相对定量分析。
表1引物序列
1.2.8 蛋白免疫印迹法检测肝脏PPARα、CPT-1蛋白表达情况
5 μL蛋白电泳后，电转移至PVDF膜，加入一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤缓冲液洗涤3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗。按1∶1比例混合发光液A和B，与PVDE膜反应1 min之后进行曝光，用AIWBwellTM分析软件进行数据分析。
1.2.9 统计学方法
实验数据采用SPSS 26.0软件进行分析处理，以表示。满足正态分布及方差齐性的数据使用单因素方差分析，进一步多重比较采用LSD-t法检验；若不满足上述条件则使用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况
空白组大鼠精神状态良好、进食量正常；模型组大鼠出现精神欠佳，尿量及进食量多等表现；用药8周后，补阳还五汤组和辛伐他汀组一般情况均有所好转。实验治疗期间模型组死亡1只，补阳还五汤组死亡1只，因取材过程中操作失误，空白组与辛伐他汀组各损失1只。
2.2 补阳还五汤对T2DM合并高脂血症大鼠FBG水平的影响
与空白组相比，模型组大鼠FBG水平显著升高（P<0.01），经补阳还五汤治疗后，大鼠第8周的FBG水平降低（P<0.05），补阳还五汤组与辛伐他汀组大鼠第4~8周FBG水平略呈下降趋势，补阳还五汤与辛伐他汀组之间无统计学差异（P>0.05），见表2。
表2各组大鼠FBG水平比较
注：a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
2.3 补阳还五汤对T2DM合并高脂血症大鼠血清脂质含量的影响
与空白组相比，模型组大鼠的TC、TG、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低（P<0.05）；与模型组比较，补阳还五汤组与辛伐他汀组TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高（P<0.05），补阳还五汤与辛伐他汀组之间无统计学差异（P>0.05），见表3。
表3各组大鼠血清脂质含量比较
注：a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
2.4 补阳还五汤对T2DM合并高脂血症大鼠肝脏组织病理结构的影响
光镜下，空白组肝脏组织结构完整，肝细胞和肝血窦以中央静脉为中心呈放射状排列，未见明显异常；与空白组比较，模型组较多肝细胞水肿，胞质疏松淡染，细胞肿胀，肝小叶分界不明显，存在肝脏脂肪变性，胞质可见大小不一的圆形空泡，较多肝血窦扩张，少量汇管区可见纤维结缔组织增生，伴少量淋巴细胞浸润；与模型组比较，补阳还五汤组与辛伐他汀组的肝脏组织病理结构均有不同程度的改善，极少量肝细胞发生水肿，脂质空泡数量显著减少，空泡变小，未见明显炎性细胞浸润，见图1。
图1各组大鼠肝脏病理学切片比较（HE，×400）
2.5 补阳还五汤对T2DM合并高脂血症大鼠血清中RBP4含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠血清中RBP4含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，补阳还五汤组RBP4含量显著降低（P<0.01），辛伐他汀组与模型组RBP4含量无统计学差异（P>0.05）；补阳还五汤组RBP4含量显著低于辛伐他汀组（P<0.01），见表4。
表4各组大鼠血清中RBP4含量比较
注：a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与辛伐他汀组比较，P<0.05
2.6 补阳还五汤对T2DM合并高脂血症大鼠肝脏组织PPARα、CPT-1 mRNA表达的影响
与空白组比较，模型组肝脏组织PPARα、CPT-1 mRNA表达显著减少（P<0.01）；与模型组比较，辛伐他汀组与补阳还五汤组PPARα、CPT-1 mRNA表达显著增加（P<0.01），但辛伐他汀组与补阳还五汤组间无统计学差异（P>0.05），见表5。
表5各组大鼠肝脏组织PPARα、CPT-1 mRNA表达水平比较
注：a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
2.7 补阳还五汤对T2DM合并高脂血症大鼠肝脏组织PPARα、CPT-1蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组PPARα、CPT-1蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，辛伐他汀组与补阳还五汤组PPARα、CPT-1蛋白表达显著增加（P<0.01）；与辛伐他汀组比较，补阳还五汤组CPT-1蛋白表达显著增加（P<0.01），PPARα蛋白表达无统计学差异（P>0.05），见图2，表6。
图2各组大鼠肝脏组织中PPARα、CPT-1蛋白表达条带
表6各组大鼠肝脏组织中PPARα、CPT-1蛋白表达水平比较
注：a与空白组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与辛伐他汀组比较，P<0.05
3 讨论
T2DM合并高脂血症是导致CVD风险增加的主要因素之一，且危险程度比单独的任何一个风险因素都高[6]。单纯强化血糖控制并不能降低T2DM并发症的发病率，研究表明全面的积极控制血糖、血压和血脂等危险因素可以明显降低糖尿病泛血管病变的发生率，因此治疗不能仅集中于血糖控制，更应重视T2DM合并高脂血症患者的血脂管理[7]。
T2DM合并高脂血症属中医“消渴血浊”“痰证”“瘀证”等范畴，总属本虚标实之证，以痰浊、血瘀为标，脾虚、气虚、阴虚为本。补阳还五汤出自《医林改错》，是治疗气虚血瘀证的代表方，全方共7味药，方中重用生黄芪，甘温大补元气，为君药；当归尾活血通络而不伤血，为臣药；赤芍、川芎、桃仁、红花协同当归尾活血祛瘀，地龙通经活络，引诸药之力直达络中，诸药合用共奏补气活血通络之功[8]。研究证明，补阳还五汤能够加速脂肪的代谢，减轻肝脏脂肪变性，降低脂质过氧化程度，降低患者的TC、TG及FBG水平，提高患者的胰岛素敏感性[9-10]。
TC、TG、LDL-C以及HDL-C水平是反映机体脂质代谢情况的基本指标。T2DM患者的血脂谱以混合型血脂异常多见，包括：空腹和餐后高甘油三酯血症；HDL-C水平降低；TC和LDL-C水平正常或轻度升高；LDL-C颗粒亚型发生改变，小而密的LDL-C颗粒增加[11]。肝脏是体内脂质代谢的主要器官，当脂质代谢紊乱，血脂含量异常升高时，肝脏组织结构会表现出肝细胞空泡变性、水肿及炎性细胞浸润等相应的病理性改变。本研究结果证实，补阳还五汤可明显降低T2DM合并高脂血症大鼠的TC、TG和LDL-C水平，提升HDL-C水平；病理学切片结果显示，补阳还五汤可明显减轻T2DM合并高脂血症大鼠肝脏组织脂质蓄积，改善炎症浸润病变。提示补阳还五汤具有良好的改善脂质代谢紊乱的作用。
PPARα是一种配体激活后调节基因表达的转录因子，在肝细胞中高度表达。肝脏中的脂肪酸水平通过增强脂肪酸β氧化过程而降低，PPARα的激活可上调参与脂肪酸β氧化途径的基因的表达[12]，增加细胞脂肪酸的摄取、酯化和运输，以控制脂质稳态[13]。此外，PPARα的激活还可能参与调节葡萄糖稳态，从而改善脂质代谢紊乱，临床研究显示[12-14]，T2DM合并高脂血症患者接受特异性PPARα激动剂治疗后，FBG、空腹胰岛素和IR水平显著降低，TG和非HDL-C水平也稳定降低，HDL-C水平逐渐升高。CPT-1是线粒体脂肪酸β氧化的关键限速酶，是PPARα参与脂质代谢过程中的重要下游靶基因，研究表明，激活PPARα/CTP-1通路，可以改善肝脏脂肪变性，抑制脂质合成，促进脂肪酸β氧化[15]。
RBP4是一种新型脂肪因子，主要由脂肪组织和肝细胞产生[16]。RBP4升高与许多疾病和代谢综合征相关，包括T2DM、IR、血脂异常、CVD等。研究发现[17]内脏肥胖与RBP4水平较高有关，血清RBP4浓度反应了人类异位脂肪的积累，RBP4水平可在定期运动和与减肥手术相关的体重减轻后降低。脂肪组织中RBP4表达增加继而血清RBP4升高被认为会导致全身IR，是判断IR的有力标志物[18]。IR是肥胖与糖尿病诱发血脂异常的关键影响因素，不仅导致肝脏中TG代谢异常，还可诱发其他血脂异常发生[19]。因此，降低血清RBP4含量可以减少体内TG积累，显著改善IR，进而改善脂质代谢异常。
本研究结果显示，T2DM合并高脂血症模型大鼠可引起肝脏PPARα和CTP-1的m RNA和蛋白表达水平显著下降以及血清RBP4含量增加，补阳还五汤可显著上调大鼠肝脏组织PPARα和CTP-1表达，降低血清RBP4含量。提示补阳还五汤改善糖脂代谢紊乱的作用可能与PPARα/CTP-1通路及脂代谢相关蛋白有关。
高血糖会损害胰岛素靶组织中的胰岛素信号传导，加剧葡萄糖摄取系统损害，所以治疗T2DM合并高脂血症，缓解高血糖仍然是重要一环。本研究结果表明，补阳还五汤干预后，T2DM合并高脂血症大鼠FBG水平有下降趋势，但并不显著，故临床上应用补阳还五汤治疗T2DM合并高脂血症时，仍需联合降糖药物。
综上所述，补阳还五汤可有效改善脂质代谢紊乱，其作用机制可能是通过激活脂质代谢信号通路PPARα/CTP-1，从而提高酶活性、加速脂肪酸转运、促进脂肪酸β氧化分解、减少脂质沉积，进而发挥降脂作用。未来还需做目标蛋白的敲除等更深层次的研究，以进一步明确补阳还五汤的作用机制。