摘要
目的：探究红景天苷对绝经后骨质疏松模型大鼠的骨保护作用及其对谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达的影响。方法：将18只SD雌性大鼠随机分为3组，每组6只：假手术组、模型组、红景天苷组，假手术组：行假手术处理，模型组：行大鼠双侧卵巢摘除，建立绝经后骨质疏松大鼠模型，红景天苷组：模型成功后，给予大鼠红景天苷水溶液（40 mg/kg）腹腔注射，模型组给予同等体积的生理盐水腹腔注射，每天1次，连续治疗2个月后，大鼠行双能X射线骨密度仪（DXA）拍摄，取大鼠血清行ELISA检测其骨钙素（OC）、I型前胶原氨基端前肽（PINP）、Ⅰ型胶原羧基末端肽（β-CTX）及4-羟基壬烯醛（4-HNE）水平，取大鼠股骨组织，行Micro-CT、Western blot、qRT-PCR、免疫组化检测。结果：DXA结果显示，较假手术组，模型组大鼠BMD明显降低，证明模型成功；治疗2个月后，红景天苷组的BMD较模型组明显升高（P<0.01）。Micro-CT结果显示，红景天苷组BV/TV、Tb.Th及Tb.N较模型组回升，Tb.Sp降低（P<0.05）。ELISA结果表明，与假手术组比较，模型组OC、PINP水平降低，β-CTX、4-HNE升高，红景天苷组OC、PINP水平较模型组升高，β-CTX、4-HNE水平降低（P<0.01）。qRT-PCR和Western blot显示，模型组GPX4表达水平降低，红景天苷组相较于模型组GPX4表达水平明显升高。免疫组化显示，与假手术组比较，模型组GPX4蛋白表达水平明显降低，红景天苷组表达水平较模型组明显升高（P<0.01）。结论：红景天苷通过调控GPX4的表达水平抑制铁死亡进程，能有效治疗大鼠绝经骨质疏松，提升骨量，改善其骨质疏松情况。
关键词
Abstract
Objective To investigate the bone-protective effects of Salidroside on postmenopausal osteoporosis model rats and its influence on glutathione peroxidase 4 (GPX4) expression. Methods A total of 18 female SD rats were randomly divided into three groups, with six rats in each group. The groups were the sham-operated group, the model group, and the Salidroside group. The sham surgery group underwent sham operation, while the model group underwent bilateral ovariectomy to establish a postmenopausal osteoporosis rat model. Salidroside group: After successful modeling, rats were administered Salidroside solution (40 mg/kg) via intraperitoneal injection, while the model group received an equal volume of physiological saline via intraperitoneal injection, once daily for two months. Subsequently, rats underwent DXA testing, serum samples were collected for ELISA testing, and femoral bone tissue was harvested for Micro-CT, Western blot, qRT-PCR, and immunohistochemical analysis. Results DXA results showed that compared with the sham-operated group, BMD in the model group was significantly reduced, confirming the success of the model. After drug administration, BMD in the Salidroside group was significantly higher than that in the model group (P<0.01). Micro-CT results showed that the red ginseng glycoside group had significantly higher BV/TV, Tb.Th, and Tb.N compared to the model group, while Tb.Sp was significantly lower (P<0.05). ELISA results indicated that compared with the sham-operated group, serum osteocalcin (OC) and type I procollagen N-terminal propeptide (PINP) levels were significantly reduced in the model group, while type I collagen C-terminal propeptide (β-CTX) levels were significantly increased, and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) levels were significantly elevated. The Salidroside group showed significantly higher levels of OC and PINP compared to the model group, while β-CTX and 4-HNE expression levels were significantly lower (P<0.01). qRT-PCR and Western blot analysis showed that GPX4 expression levels were reduced in the model group, while the Salidroside group exhibited significantly higher GPX4 expression levels compared to the model group. Immunohistochemistry showed that compared with the sham-operated group, the GPX4 protein expression levels in the model group were significantly reduced, while those in the Salidroside group were significantly increased compared with the model group (P<0.01). Conclusion Salidroside inhibits the ferroptosis process by regulating the expression levels of GPX4, effectively treating postmenopausal osteoporosis in rats, increasing bone mass, and improving their osteoporosis condition.
绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是绝经后妇女因雌激素水平急剧下降导致骨代谢失衡的一种高发性、高致残性退行性疾病，其核心病理特征包括骨量显著减少、骨微结构破坏及骨密度降低，最终增加骨折的发生风险[1]。研究表明，雌激素缺乏引发的氧化应激与活性氧（reactive oxygen species，ROS）过度积累是驱动PMOP骨流失的关键因素之一，它不仅能直接损伤骨细胞，还可能激活特定的细胞死亡通路[2]。
铁死亡作为一种铁依赖性的、由脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡形式，其主要特征包括ROS的过量产生、脂质过氧化和细胞内铁的积累[3]。在骨组织微环境中，持续的氧化应激可能诱导骨细胞（如成骨细胞、骨细胞）发生铁死亡，从而破坏骨形成与骨吸收的稳态平衡，这被认为是PMOP骨质流失的潜在新机制[4]。鉴于氧化应激（特别是ROS过量）是铁死亡的核心驱动因素之一，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）作为细胞内关键的抗脂质过氧化酶，通过将毒性磷脂氢过氧化物还原为无害的磷脂醇，在抑制铁死亡进程中扮演核心角色。GPX4的表达下降或活性丧失已被广泛认定为铁死亡发生的关键标志和直接驱动因素[5]。因此，靶向调控GPX4以抑制骨细胞铁死亡，为PMOP的治疗提供了新的思路。
红景天苷是传统中药红景天的主要活性成分，其以强大的抗氧化应激和抗铁死亡活性而备受关注[6]。鉴于PMOP中氧化应激及潜在铁死亡的参与，以及GPX4在其中的核心调控作用，笔者推测红景天苷可能通过激活GPX4通路，抑制骨组织中的铁死亡过程，从而发挥骨保护效应。基于此，本研究通过双侧卵巢切除术（OVX）建立PMOP大鼠模型，探究红景天苷对PMOP大鼠骨量流失的治疗效果，以及其是否通过调控GPX4表达及其下游的铁死亡信号通路来发挥骨保护作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
组织/细胞匀浆器（杭州米欧仪器有限公司）、Micro-CT（型号SkyScan 1276，比利时Bruker公司）、Real-Time PCR系统（美国Roche公司）、光学显微镜（日本Olympus公司）、高速冷冻离心机（安徽中科都菱商用电器股份有限公司）、ELISA试剂盒（中国酶联公司）、Trizol（美国Thermo公司）、FastQuant逆转录试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、高效RIPA裂解液（50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1%NP-40，0.1%SDS）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、GAPDH、ECL发光液、BCA蛋白测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、GPX4单克隆抗体（中国Selleck生物公司）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（武汉三鹰生物技术有限公司）。
1.2 实验动物
18只6周龄雌性SD大鼠（体质量180～220 g）购自北京华阜康生物公司。适应性饲养5 d后，置于标准SPF级动物房，恒温、恒湿，自由饮食。动物实验经天津医院动物伦理委员会批准（编号：医伦审2024051）。
1.3 动物模型构建及治疗
SD大鼠适应性饲养1周后，术前禁食12 h，随机分为三组：假手术组、模型组、红景天苷组，每组6只。1）建模。模型组和红景天苷组大鼠经异氟烷诱导麻醉后维持，剃除大鼠背部腹部两侧毛发，碘伏消毒，以大鼠最后肋骨下缘为标志，脊柱两侧旁开1.5 cm各作一长约1~1.5 cm的纵向切口，钝性分离肌肉层，打开腹腔，用可吸收线结扎卵巢与输卵管连接处，摘除双侧卵巢，逐层缝合手术切口，关闭腹腔。6周后，对大鼠行双能X射线骨密度仪（DXA）拍摄，评估骨密度（BMD），确认造模成功。假手术组仅暴露卵巢后原位缝合，术后连续3 d注射青霉素。2）干预。红景天苷组：造模成功后，将红景天苷溶解于37℃的注射用生理盐水中，浓度为20 mg/mL，磁力搅拌器持续搅拌，每日以40 mg/kg剂量于大鼠腹腔注射红景天苷水溶液，持续给药2个月。模型组和假手术组每日给予相同体积的生理盐水腹腔注射。
1.4 组织标本获取
给药2月后，再次行DXA拍摄评估BMD变化情况，随后摘眼球取血，用离心机1500 r/min离心20 min收集血清，使用ELISA试剂盒检测血清中血清骨形成标志物骨钙素（OC）和I型前胶原氨基端前肽（PINP）水平，骨吸收标志物Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（β-CTX）水平，以及4-羟基壬烯醛（4-HNE）水平。取大鼠双侧股骨，剔除股骨周围软组织，一侧用无菌的PBS冲洗，过液氮后，-80℃冷冻保存；另外一侧置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，待进一步处理。
1.5 qRT-PCR检测股骨组织中GPX4 mRNA表达水平
将-80℃冻存的股骨取出，在液氮中用无菌的咬骨钳咬成绿豆粒大小，随后在组织/细胞匀浆器中研磨骨组织至粉末状，每50 mg组织加入1 mL Trizol匀浆，随后加入200 μL氯仿分层，离心取上清，加入等量的异丙醇沉淀RNA，用75%乙醇洗涤2次，采用ddH2O溶解RNA，随后进行浓度测定，用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，Premix EX Taq II 试剂盒进行扩增后，进行熔解曲线分析，采用2−ΔΔCt方法分析GPX4 mRNA的表达水平。
1.6 Western blot检测股骨组织中GPX4蛋白表达水平
股骨组织前处理同1.5，RIPA∶PMSF=100∶1配置，冰孵进行蛋白裂解30 min，4℃以12 000 r/min离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，配10%分离胶和5%浓缩胶（SDS-PAGE胶），每孔蛋白上样10 μg，120 V恒压电泳60 min，300 mA湿法转膜50 min，5%BSA封闭液封闭1 h，TBST（含0.1% Tween-20）洗膜，孵育一抗GPX4（1∶1000）、GAPDH（1∶2000）4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，随后孵育二抗（1∶20 000）1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL曝光液，用凝胶成像仪采集图像并分析蛋白相对表达量。用Image J软件分析GPX4蛋白条带的相对灰度，计算GPX4相对表达量。
1.7 使用Micro-CT扫描股骨
取多聚甲醛固定后的股骨，使用Micro-CT进行扫描，扫描电压85 kV，电流200 μA，分辨率5 μm。重建三维立体结构后，使用CTAn测量不同区骨小梁的微观结构，选择股骨远端松质骨长约1 cm为感兴趣区（ROI），进行骨小梁参数分析，包括骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间距（Tb.Sp）、骨小梁数目（Tb.N）。
1.8 免疫组化检测GPX4阳性细胞比例
取Micro-CT扫描后的股骨，室温下用10%EDTA（pH=7.4）脱钙4周，隔天更换一次脱钙液（脱钙过程中使用注射器针头针刺，当骨组织变软或针刺时没有阻力感即可终止脱钙）。脱钙完成后，行常规石蜡包埋处理，进行5 μm连续切片，用于免疫组化染色。石蜡切片常规脱蜡复水，微波进行抗原修复，3%H₂O₂室温孵育，5%BSA封闭，GPX4一抗（1∶200）孵育4℃过夜，PBS冲洗3次，每次10 min，HRP标记二抗室温孵育30 min，PBS冲洗3次，每次10 min，DAB显色，采用超纯水终止反应，苏木素复染核，脱水后进行树脂胶封片，全片扫描。用Image J软件对免疫组化细胞进行相对计数，计算阳性细胞比例。
1.9 统计学分析
采用GraphPad Prism 9.0软件进行实验绘图，数据采用表示，多组间差异比较行方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠给药前后BMD变化
给药前，模型组和红景天苷组的BMD均低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.01），证实造模成功；给药2个月后，模型组的BMD明显低于假手术组，红景天苷组的BMD明显高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。
表1各组大鼠给药前后BMD比较
注：a与假手术组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.01
2.2 各组大鼠血清骨代谢相关指标
与假手术组比较，模型组OC和PINP水平降低，β-CTX、4-HNE水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.01）。红景天苷组OC和PINP水平高于模型组，β-CTX、4-HNE低于模型组，差异均具有统计学意义（P<0.01），见表2。
表2各组大鼠骨代谢、铁死亡标志物水平比较
注：a与假手术组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.01
2.3 qRT-PCR和Western blot结果
与假手术组比较，模型组GPX4的mRNA表达量显著降低，红景天苷组GPX4的mRNA表达量较模型组明显回升，差异具有统计学意义（P<0.05，图1A）。模型组GPX4蛋白表达量较假手术组显著下调，而红景天苷组中GPX4蛋白表达量较模型组明显上调，差异具有统计学意义（P<0.01，图1B）。
图1各组的GPX4基因（A）和GPX4蛋白（B）表达水平比较
2.4 各组大鼠骨小梁微观结构分析
与假手术组比较，模型组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N均明显降低，而Tb.Sp显著增加，差异均具有统计学意义（P<0.001）。红景天苷组BV/TV、Tb.Th及Tb.N较模型组显著回升，Tb.Sp则显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。
图2各组大鼠骨小梁参数比较
2.5 免疫组化结果
假手术组、模型组及红景天苷组大鼠骨组织内的GPX4阳性细胞比例分别为43.17%±5.44%、21.33%±3.83%及43.33%±5.70%，模型组低于假手术组，红景天苷组高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.01），见图3。
图3组大鼠股骨组织内的GPX4阳性细胞比例比较
3 讨论
红景天苷是一种分子式为C14H20O7的苯丙烷苷类化合物，体外实验研究发现，红景天苷能有效增加成骨细胞的增殖[7]，并且具有非常低的细胞毒性[8]。相关研究还发现红景天苷调控骨形态发生蛋白7的表达，促进成骨细胞分化来加速骨组织再生，抑制破骨细胞活性来影响骨稳态平衡[9]。ROS和抗氧化剂之间的平衡在骨质疏松的发展中起着显著作用[10]，而红景天苷可以通过激活Nrf2信号通路和减轻氧化应激来发挥其防御作用，同时促进碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原α1链和骨钙素等成骨分化标志物的表达水平[11]。Zhang等[12]对OVX小鼠模型腹膜内注射红景天苷检测血液中氧化应激标志物变化，结果发现与未接受红景天苷的对照组比较，红景天苷处理的小鼠血液中的谷胱甘肽（GSH）水平升高，丙二醛（MDA）水平降低，尤其是在接受较高浓度红景天苷治疗的小鼠中。
铁死亡是一种以脂质过氧化为特征的铁依赖性调节细胞死亡形式，是导致各种病理状况的重要因素[13]。最近的研究发现，铁死亡似乎通过多种机制对骨稳态产生不利影响[14]。研究表明，成骨细胞发生铁死亡后的数量减少，进一步导致骨基质的生成减少，直接影响骨形成的能力[15]。骨质疏松症患者经常出现铁蓄积，成骨细胞中的铁蓄积通过Fenton反应产生羟基自由基，进而触发脂质氧化并促进铁死亡[16]，其中负责抑制脂质过氧化的GPX4活性降低，是成骨细胞发生铁死亡的关键[17]。骨细胞在骨重塑和矿化过程中起重要作用，发生铁死亡的骨细胞可以通过调节破骨细胞介导的骨吸收进一步促进骨量流失，骨细胞中GPX4的表达降低加重了OVX建模后骨细胞铁死亡，并进一步加剧了骨量的流失，Nrf2可能是关键的调节通路[18]。成骨细胞与破骨细胞相互协调并维持着骨平衡，铁死亡可以通过改变自噬活性间接调节破骨细胞前体细胞的活性，最终影响骨吸收。也有研究表明铁死亡产生的ROS可通过核因子-κB信号通路促进破骨细胞的形成，增加骨吸收[19]。
目前，很多研究发现红景天苷可以通过多个途径抑制疾病中所出现的铁死亡进程，进而改善疾病的发展进程。研究发现红景天苷可以通过对氧化应激和神经元铁死亡的抑制作用有效改善小鼠的认知障碍缺陷[20]。Feng等[21]研究指出，红景天苷可以通过减弱铁死亡标志物（包括脂质ROS积累、铁过载、脂质过氧化和线粒体功能障碍）显著增强心肌细胞活力，进而防止心肌细胞的铁死亡。Zhen等[22]研究发现，红景天苷通过调控花生四烯酸代谢相关的铁死亡，改善败血症诱导的脓毒血症。还有研究发现，红景天苷可以通过调节sirt1/foxo1通路减弱脂多糖诱导的关节炎中软骨细胞铁死亡发生，保护了软骨细胞外基质的完整性，减缓了软骨退变的发生[23]。
本研究基于铁死亡经典负调控基因GPX4进行研究，发现在绝经后骨质疏松大鼠模型的GPX4表达明显下调，说明绝经后骨质疏松中发生铁死亡，正常的成骨-破骨的平衡被打破，导致骨量流失，骨小梁稀疏，严重者发生脆性骨折。而给予红景天苷治疗后，GPX4的表达水平明显上调，铁死亡受到抑制，机体恢复正常的骨重塑的动态平衡。因此，红景天苷可能通过调控骨细胞GPX4的表达水平进而影响细胞的铁死亡，恢复正常的骨代谢。