摘要
目的：研究点按委中穴对多裂肌损伤大鼠局部组织结构变化影响，基于Nrf2信号通路探讨点穴治疗腰肌损伤的作用机制。方法：将40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、点穴组、抑制剂组，每组10只，局部注射布比卡因建立大鼠骨骼肌损伤模型，后两组给予压力传感器点穴治疗，共治疗2周。抑制剂组在点穴前注射Nrf2通路抑制剂鸦胆子苦醇（BRU），干预结束后，检测各组超声下腰椎多裂肌结构差异，并取双侧多裂肌组织及血清，观察各组肌肉HE染色，血清炎症因子白细胞介素（IL）-18、IL-1β水平，并检测肌酸激酶（CK）、环氧合酶-2（COX-2）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）、机械生长因子（MGF）、胞浆蛋白（Keap1）、核因子NF-E2相关因子（Nrf2）、结蛋白（Desmin）的蛋白和mRNA表达量。结果：与空白组比较，模型组腰肌超声局部组织肿胀，肌纤维损伤明显，HE染色肌纤维损伤水肿明显，血清炎症因子水平升高，COX-2、CK、Caspase-3蛋白和mRNA表达升高（P<0.01），Keap1、Nrf2、Desmin蛋白和mRNA表达升高（P<0.01），MGF蛋白和mRNA表达未见明显差异（P＞0.05）。与模型组比较，点穴组腰肌超声局部肿胀较轻，HE染色见炎症水肿较轻，血清炎症因子水平降低，COX-2、CK、Caspase-3蛋白和mRNA表达降低，MGF、Keap1、Nrf2、Desmin蛋白和mRNA表达升高（P<0.01）。与点穴组比较，抑制剂组的腰肌超声局部肿胀严重，HE染色见炎症水肿明显，血清炎症因子水平较高，COX-2、CK、Caspase-3蛋白和mRNA表达升高（P<0.01），MGF、Keap1、Nrf2、Desmin蛋白和mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：点按委中穴可一定程度改善腰肌损伤大鼠多裂肌炎症损伤病理状态，恢复受损组织结构。点穴刺激MGF表达并激活Nrf2通路，下调肌细胞修复性蛋白表达，可能是点按委中穴治疗腰肌损伤作用机制之一。
关键词
Abstract
Objective To investigate the effects on the structural changes of local tissues in rats with multifidus muscle injury by adopting the therapeutic method of regular acupressure at Weizhong acupoint and explore the mechanism of acupoint therapy for lumbar muscle injury based on the Nrf2 signaling pathway. Methods 40 SD rats were randomly divided into control group, model group, acupoint group, and the inhibitor group, (n=10). Upon the successful modeling, the latter two groups received acupoint intervention using pressure sensors for a total of two weeks, while the control and model groups were not intervened. The inhibitor group was injected with the Nrf2 pathway inhibitor brusatol (BRU) before acupuncture. After the intervention, structural differences in the lumbar multifidus muscle were detected via ultrasound. Bilateral multifidus muscle tissues and serum were collected to observe muscle HE staining and serum inflammatory factors IL-18, IL-1β. Furthermore, the levels of creatine kinase (CK), cyclooxygenase-2 (COX-2), caspase-3, andmechano growth factor (MGF), as well as cytoplasmic protein (Keap1), nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), and desmin protein and mRNA expression levels were measured. Results Compared with the control group, the model group showed local muscle swelling on ultrasound, and significant muscle fiber damage (P<0.01). HE staining revealed obvious muscle fiber damage and edema, and serum inflammatory factor levels were elevated. The expression of CK, COX-2, Caspase-3 proteins, and mRNA was increased (P<0.01), and the expression of Keap1, Nrf2, and Desmin proteins and mRNA was also elevated (P<0.01). No significant difference was observed in the expression of MGF protein and mRNA (P>0.05).Compared with the model group, the acupoint group showed lighter local muscle swelling on ultrasound, less inflammation and edema in HE staining, lower levels of serum inflammatory factors, and reduced expression of CK, COX-2, and Caspase-3 proteins and mRNA. The expression of MGF, Keap1, Nrf2, and Desmin proteins and mRNA was increased (P<0.01). Compared with the acupoint group, the inhibitor group showed more severe local muscle swelling on ultrasound, pronounced inflammation and edema in HE staining, higher levels of serum inflammatory factors, and increased expression of CK, COX-2, and Caspase-3 proteins and mRNA (P<0.01). The expression of Keap1, Nrf2, and Desmin proteins and mRNA was decreased (P<0.01). Conclusion Acupressure at the Weizhong point can improve the pathological state of inflammatory damage in the multifidus muscle of rats with lumbar muscle injury to some extent and restore the damaged tissue structure. Acupressure stimulation increases the expression of MGF and activates the Nrf2 pathway, downregulating the expression of myocyte repair proteins. This may be one of the mechanisms by which acupressure at the Weizhong point exerts its therapeutic effects on lumbar muscle injury.
Keywords
腰部肌肉的急慢性损伤会导致局部肌肉组织发生炎症反应，局部主要病理变化为肌肉、筋膜等软组织炎症水肿状态，这也是引起腰痛的主要原因[1-2]。多裂肌是脊柱稳定的锁链，它的损伤、萎缩及功能障碍是急慢性腰痛的重要原因。该类疾病近年来发病率逐年上升，严重影响患者的工作和生活，西医治疗腰肌损伤疼痛主要以非甾体抗炎药口服和外用为主，但总体疗效欠佳[3]。中医治疗多应用“腰背委中求”理论，通过刺激委中穴治疗腰痛，效如桴鼓。有研究已经探讨针刺委中穴对大鼠腰肌损伤后再生修复的影响[4]，而关于传统推拿点穴疗法的动物研究较少，基于此，本研究主要探讨点按大鼠委中穴对急性多裂肌损伤的影响，并基于经典Nrf2抗氧化物应激反应通路，探索其作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
选取SPF级雄性SD大鼠40只，质量（120±20）g，5周龄。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0002。本研究通过我院医学伦理委员会审批（批号：2023医伦审142）。
1.2 主要试剂及仪器
数字-模拟压力传感系统（香港艾固仪器仪表有限公司），Vino 6lab动物超声仪（江苏飞依诺科技股份有限公司），Nikon E100显微镜（日本Nikon公司），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），脱水机及包埋机（武汉俊杰电子有限公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。
1.3 大鼠分组和处理
1.3.1 大鼠模型制备
将40只大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组、点穴组、抑制剂组，每组10只，所有大鼠采用腹腔注射2%戊巴比妥钠进行麻醉（40 mg/kg），空白组不做处理，余三组大鼠局部注射布比卡因构建大鼠骨骼肌损伤模型[5]。应用肌骨超声观察腰多裂肌损伤水肿状态，均提示造模成功。
1.3.2 干预方式
造模结束后，每天固定时间进行干预，空白组只作同步捆绑固定，不做其他处理，余三组大鼠俯卧位捆绑固定四肢，应用异氟烷持续空气麻醉后，点穴组和抑制剂组应用压力传感仪轮流点按双侧委中穴[6]，力度参照既往研究资料[7]及本人预实验[8]中点穴手法压力的科学换算，设置压力值为0.5 N，压力维持时间15 s，每次操作3组，每组间隔5 s，每天1次，共治疗2周。抑制剂组于首次点穴前腹腔注射鸦胆子苦醇（BRU）2 mg/kg[9]。委中穴详见动物穴位图谱[10]。干预2周后取材：1）每组应用戊巴比妥钠腹腔麻醉后剃背毛，测大鼠多裂肌超声，然后同步取材双侧多裂肌组织，固定、冷却、冻存、待测。2）取5 mL动脉血，室温静置，离心，将上层血清置于-20℃冰箱保存。
1.4 多裂肌肌骨超声
超声操作医师对实验分组情况不了解，应用Vino 6lab动物超声仪确定多裂解位置后，观察超声图像，测定肌肉水肿、厚度、弹性及连续性等指征。采用肌肉损伤程度的超声分级评分表[11]对其进行评分。
1.5 病理HE染色
取实验组织，置于4%多聚甲醛中固定，然后以梯度乙醇脱水，浸蜡，包埋，连续切片，再将切片脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素染色后用水冲洗，然后用伊红液染色，脱水封片，显微镜下观察图像形态学变化。
1.6 血清炎症因子
取冻存的血清，参照试剂盒说明书，应用ELISA法检测血清白细胞介素（IL）-18、IL-1β水平。
1.7 蛋白印迹法（Western blot）检测并检测肌酸激酶（CK）、环氧合酶-2（COX-2）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3）、机械生长因子（MGF）、胞浆蛋白（Keap1）、核因子NF-E2相关因子（Nrf2）、结蛋白（Desmin）蛋白表达水平
取损伤多裂肌组织，加入裂解液研磨，离心后取上清液，进行BCA蛋白定量，电泳，转膜，将膜置于5%脱脂乳封闭，然后用一抗封闭液孵育抗体，洗涤，孵育二抗，洗涤，化学发光法检测，以软件Image J分析蛋白达量。
1.8 PCR检测CK、COX-2、Caspase-3、MGF、Keap1、Nrf2、Desmin的mRNA表达水平
取损伤的多裂肌组织，应用RNA提取试剂盒提取组织细胞RNA，应用SYBR荧光染料试剂盒进行荧光定量PCR。以U6作为实验内参，将SYBR Green染料标记在RNA，然后转录并检测RNA表达量。根据2-△△CT法计算样本的相对表达量。
1.9 统计学分析
采用SPSS 24.0软件进行统计分析，实验数据采用表示，多组间比较用方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 多裂肌肌骨超声结果
空白组：大鼠多裂肌形态饱满，肌纤维结构清晰可见，弹性正常；模型组：大鼠受损肌纤维不连续，肿胀，肌纤维弹性高，肌肉结构完整，局部液性暗区范围局限，超声评分高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）；点穴组：肌纤维比较连续，肿胀较轻，肌肉弹性略高，但肌纤维结构仍未恢复至正常，少数肌肉结构欠清晰，超声评分较低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；抑制剂组，肌纤维部分断裂，明显肿胀，肌纤维弹性最高，局部可见大量液性暗区形成，肌肉结构破坏，模糊不清，较点穴组差异明显（P<0.05）。见图1，表1。
图1各组大鼠多裂肌超声比较
表1各组大鼠多裂肌超声评分和血清炎症因子水平比较
注：a与空白组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.01；c与点穴组比较，P<0.01
2.2 HE染色结果
空白组：结构正常。模型组：损伤局部出现较多的红色新生肌纤维，细胞体积增大、肿胀，炎症损伤程度高于空白组。点穴组：损伤区大部分被新生的肌纤维代替，细胞形态较规则，炎症损伤程度低于模型组。抑制剂组：骨骼肌大片坏死，以炎性细胞浸润为主，细胞体积增大、肿胀明显，形状十分不规则，炎症损伤程度高于点穴组。见图2。
2.3 血清炎症因子IL-18、IL-1β水平
模型组的IL-18、IL-1β水平高于空白组，点穴组低于模型组，抑制剂组高于点穴组，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。
图2各组大鼠HE染色比较（×400）
2.4 Western Blot及PCR检测结果
2.4.1 肌肉损伤炎症凋亡指标
模型组多裂肌组织中的CK、COX-2及Caspase-3蛋白和mRNA表达水平高于空白组，点穴组低于模型组，抑制剂组高于点穴组，差异均有统计学意义（P<0.05）。各组蛋白及mRNA表达情况见图3、图4。
2.4.2 Nrf2通路相关指标比较
模型组多裂肌组织中的Keap1、Nrf2、Desmin蛋白和mRNA表达量高于空白组，点穴组的MGF、Keap1、Nrf2、Desmin蛋白和mRNA表达量均高于模型组，抑制剂组的MGF、Keap1、Nrf2、Desmin蛋白及mRNA表达均低于点穴组，差异均有统计学意义（P<0.05），见图3、4。
图3各组Western Blot检测结果比较
图4各组PCR检测结果比较
3 讨论
“腰背委中求”是中医经络治疗经典理论，委中穴作为膀胱经合穴，在治疗腰痛方面，起着至关重要的作用，《灵枢·经脉》：“膀胱足太阳之脉，其支者，从腰中，下夹脊，贯臀，入腘中”可见膀胱经之夹脊，入腘中是重要的循行路径，表层竖脊肌和深层多裂肌均为其分野，研究发现委中穴已经成为治疗腰背肌筋膜疼痛最常用穴位之一[12]，实验证实，远端循经取穴比局部取穴更能加快肌细胞的再生[13]。
Keap1-Nrf2通路（简称Nrf2通路）目前被认为是对抗氧化应激损伤中最重要的通路[14]。既往研究已经证实Nrf2通路在大鼠腓肠肌损伤模型中的保护作用[15]，这也在本研究中模型组Nrf2通路蛋白表达增高中体现，发挥肌细胞自我抗氧化修复的作用。该通路上游的MGF具有力学敏感性的特点，机械负荷可以诱导大鼠细胞中MGF表达增加，进而促成肌细胞增殖和修复[16-17]，而该作用的发挥依赖Nrf2通路完成[18]．MGF可以激活蛋白激酶Cε，直接上调Nrf2通路，导致下游相关蛋白表达增加，发挥保护细胞的作用[19]。Desmin作为Nrf2通路下游蛋白之一，是肌细胞骨架蛋白中重要标志性蛋白[20]，在肌卫星细胞中呈现强阳性表达，是骨骼肌损伤修复的重要标志物[21-22]。本实验中，点穴组诱发了MGF高表达，可能是上调抗氧化通路并激活下游肌细胞蛋白修复进程的重要触发点。
本实验结果显示，与空白组比较，多裂肌炎症损伤大鼠模型之局部肌肉超声、HE染色、炎症及细胞损伤标志物（COX-2、IL-18、IL-1β）及细胞损伤凋亡标志物（CK、Caspase-3）方面均可见肌肉组织炎症损伤的异常状态，由此可见造模成功，在经过规律点穴干预后，相关指标表明，点穴组多裂肌组织表现为炎症吸收和细胞修复，可见点按委中穴促进了多裂肌组织形态恢复，较未予干预肌肉自然修复的模型组比较，效果更优。而抑制剂组炎症和细胞损伤凋亡指标未见明显改善。进一步研究发现，点穴组MGF、Keap1、Nrf2、Desmin的蛋白和mRNA表达明显高于模型组，可见点穴推拿治疗手段作为一种特殊的机械力刺激，可以诱导MGF高表达，从而上调Nrf2通路，加速了腰椎多裂肌再生肌细胞成肌分化进程，促进了损伤组织尽快恢复，炎症吸收、肌细胞修复以及抑制凋亡的作用，可见点穴手法助力该通路表达；而抑制剂组中通路蛋白和mRNA表达明显低于点穴组，可知抑制剂组虽然触发了MGF表达，但并没有上调该通路的蛋白和mRNA表达，其通路下游Desmin的表达也未被激活，自体抗氧化机能启动受阻，细胞炎症损伤凋亡状态恢复困难，这与Nrf2通路表达受阻有直接关系。由此可见，点按委中穴可有效改善大鼠腰椎多裂肌细胞炎症损伤状态，并促进肌细胞修复，其作用机制可能与增强Nrf2核转位，上调Nrf2通路有关。本研究从Nrf2通路角度探索了临床中点按委中穴治疗腰痛可能的作用机制，进一步为寻找经络推拿疗法治疗急慢性腰肌损伤靶点提供了实验研究依据。