摘要
目的：基于Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路研究灭幽汤发酵液对幽门螺杆菌感染相关性胃炎小鼠的治疗作用及机制。方法：44只雄性SPF级BALB/c小鼠，随机取34只，采用幽门螺杆菌菌液灌胃（隔天1次，共6次）制备幽门螺杆菌感染模型，其余10只为对照组；于最后一次灌胃后14天，各取2只小鼠行快速尿素酶实验和Giemsa染色，确认造模成功后，随机分为模型组、灭幽汤组、发酵液组和西药组，共4组。每组8只，给予相应药物治疗14 d。采用快速尿素酶实验检测幽门螺杆菌根除率，Giemsa及HE染色观察幽门螺杆菌定植及炎症浸润情况，并用免疫组化及实时荧光定量PCR检测胃组织TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白及mRNA表达水平，ELISA检测血清肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-8水平。结果：与对照组比较，模型组小鼠胃黏膜可见大量炎症细胞浸润及幽门螺杆菌，TLR4、Myd88和NF-κB的蛋白与mRNA表达水平及血清TNF-α、IL-8含量明显升高（P<0.05）。与模型组比较，灭幽汤组、发酵液组及西药组胃黏膜炎症减轻，相关基因蛋白与mRNA的表达水平及血清TNF-α、IL-8含量均降低（P<0.05）。与灭幽汤组比较，发酵液组及西药组各项检测指标均降低（P<0.05）。结论：灭幽汤及其发酵液均可抑制幽门螺杆菌定植，减轻胃黏膜炎症，且发酵液的疗效更佳，其治疗机制与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。
关键词
Abstract
Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of the fermentation broth of Mieyou decoction on mice with Helicobacter pylori infusion-associated gastritis based on the Toll-like receptor 4 (TLR4)/myeloid differentiation factor 88 (MyD88)/nuclear transcription factor-κB (NF-κB) signaling pathway. Methods Forty-four mice were marked as the blank group (10 mice) and the model group (34 mice). After 7 days of adaptive rearing, H.pylori bacterial liquid was gavaged once every other day for a total of 6 times. After 14 days of conventional feeding, 2 mice from each group were selected for the Rapid Urease Test (RUT) and Giemsa staining to detect whether the modeling was successful. The remaining mice were divided into the control group, the model group, the Mieyou decoction group, the fermentation broth group and the Western medicine group, with 8 mice in each group. The drug intervention lasted for 14 days. The mice were sacrificed to obtain gastric tissues, andRUT was used to detect the H.pylori eradication rate of the mice. Giemsa and HE staining were used to observe the colonization and inflammatory infiltration of H.pylori in mice. The protein and mRNA levels of TLR4, MyD88 and NF-κB in mouse gastric tissues were detected by IHC method and real-time fluorescence quantitative PCR. The expression changes of TNF-α and IL-8 in the serum of mice were evaluated by ELISA. Results Compared with the blank group, a large number of inflammatory cell infiltrations and the presence of Helicobacter pylori could be observed in the gastric mucosa of mice in the model group. The protein and mRNA levels of TLR4, Myd88 and NF-κB, as well as the serum contents of TNF-α and IL-8, were significantly increased (P < 0.05). Compared with the model group, the gastric mucosal inflammation of mice in the Mieyou decoction group, the fermentation broth group and the Western medicine group improved, and the expression levels of each protein and mRNA as well as the serum contents of TNF-α and IL-8 all decreased (P < 0.05). Compared with the Mieyou decoction group, the gastric mucosal inflammation of mice in the fermentation broth group and the Western medicine group improved, and the levels of expression of each protein and mRNA as well as the serum contents of TNF-α and IL-8 decreased (P < 0.05). Conclusion Both the Mieyou decoction and its fermentation broth can inhibit the colonization of Helicobacter pylori, reduce gastric mucosal inflammation, and the fermentation broth has better therapeutic effects. Its therapeutic mechanism is related to the inhibition of the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway.
幽门螺杆菌进入人体后主要定植于胃部及十二指肠等区域，长期感染可加重胃部炎症，并可诱发胃癌等消化系统肿瘤[1-2]。我国幽门螺杆菌的感染率高达到40.66%[3]，严重影响人们的生活质量，因而根除幽门螺杆菌的必要性逐渐显现。四联疗法是目前根除幽门螺杆菌的主要治疗方案，但近年来抗生素的滥用使该菌产生了很高的耐药性，甚至许多患者出现了胃肠道菌群失调等不良反应。此外，使用抗生素导致的胃黏膜病变也缺少相关有效干预手段，因此寻找更优的治疗方案迫在眉睫。
中医药不仅对已产生耐药性的幽门螺杆菌有明显抑菌作用，并且在改善不良反应方面也较有成效[4]。本课题组前期研究发现，灭幽汤在治疗脾胃湿热型幽门螺杆菌感染慢性胃炎中，清除幽门螺杆菌和改善症状方面优于西药，但仍有近40%的患者不能获得满意疗效[5-6]。近年研究发现，植物乳杆菌（lactiplantibacillus plantarum，L.plantarum）可耐受pH值为2.5的人工胃液，并能抑制幽门螺杆菌的生长[7-8]。因此本研究应用L.plantarum发酵灭幽汤，比较灭幽汤及其发酵液治疗幽门螺杆菌感染相关性胃炎的疗效，并基于Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路探讨其作用机制，为优化根除幽门螺杆菌诊疗方案提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物品系及实验菌株
44 只6周龄的雄性SPF级BALB/c小鼠，体质量（20±2）g，购自湖南普瑞玛药物研究中心有限公司（合格证号：430726231100226065，许可证号：SCXK（湘）2022-0011，伦理编号：IACUC-KY2023019）。植物乳杆菌BNCC336421菌株，购于北纳生物。幽门螺杆菌悉尼标准菌株（Sydney strain I，菌体含有空泡细胞毒素A和细胞毒素相关蛋白A）购于北京保藏生物科技有限公司。
1.2 试剂
枸橼酸铋钾颗粒1.0 g（天圣制药集团股份有限公司，生产批号：1230406），克拉霉素片0.25 g（山东新华制药股份有限公司，生产批号：2212059），泮托拉唑钠肠溶片40 mg（杭州康恩贝制药有限公司，生产批号：23221207），替硝唑片0.5 g（丽珠集团制药厂，生产批号：20220305）。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（CSB-E04741m，武汉华美生物工程有限公司）、白细胞介素-8（IL-8）ELISA试剂盒（EMC104，欣博盛生物有限公司）、TLR4抗体（GB11519，塞维尔生物科技有限公司）、MyD88抗体（23230-1-AP）、NF-κB抗体（10745-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。
1.3 灭幽汤制备
灭幽汤原材料（黄芩15 g，蒲公英20 g，三七6 g，白及10 g，青皮10 g，陈皮10 g，乌贼骨15 g）购自湖南中医药大学第一附属医院。药材以1∶8的比例加水浸泡30 min，随后加热回流提取45 min，过滤收集药液；再按1∶6加水继续回流提取，过滤后合并两次收集的中药液，使用旋转蒸发仪浓缩至0.4 g/mL备用。
1.4 灭幽汤发酵液制备
于灭幽汤中药液加入4%的浓度为1×108 CFU/mL的L.plantarum菌悬液，封口膜棉绳封口，置于37℃摇床上，以160 r/min进行摇菌发酵72 h。
1.5 幽门螺杆菌培养及菌液制备
将100 μL幽门螺杆菌菌液接种于固体培养基，待表面稍干后，倒置培养基于三气培养箱中培养。经革兰染色、尿素酶试验、氧化酶试验及触酶试验鉴定后，刮取新鲜菌落，使用细菌比浊仪测定并调整菌液浓度为1×109 CFU/mL。
1.6 模型制备及处理
适应性饲养7 d后，随机数字表法将小鼠分为对照组10只、模型组34只。模型组小鼠每只灌胃0.2 mol/L的NaHCO3溶液0.25 mL、30 min后灌胃浓度为1×109 CFU/mL的幽门螺杆菌悬液0.4 mL，隔天灌胃1次，共6次，对照组小鼠以相同方式灌胃等量生理盐水。14 d后，自对照组及模型组中随机各取2只小鼠，取靠近幽门处的胃黏膜组织，进行快速尿素酶检测和吉姆萨（Giemsa）染色，用以验证造模是否成功。证实幽门螺杆菌成功种植后，将剩余32只小鼠随机分为模型组、灭幽汤组、发酵液组和西药组，每组8只。灭幽汤组和发酵液组分别灌胃灭幽汤及灭幽汤发酵液，剂量均为11.18 g/kg；西药组灌胃四联药物（枸橼酸铋钾颗粒、克拉霉素片、泮托拉唑钠肠溶片和替硝唑片）混悬液，剂量为297.7 mg/kg，对照组和模型组灌胃等量生理盐水，1次/d，均连续灌胃14 d。
1.7 尿素酶检测幽门螺杆菌根除情况
剪取胃幽门部的胃黏膜组织，置于含有尿素酶试剂的EP管中，封口膜封口，于37℃恒温培养24 h后观察结果。若试剂由黄色变为红色为阳性，说明小鼠的胃黏膜组织中有幽门螺杆菌定植；试剂未变色为阴性，提示小鼠未被感染。
1.8 HE染色观察胃黏膜炎症细胞浸润情况
小鼠胃组织经甲醛固定后，石蜡包埋，切片，脱蜡复水，进行苏木素-伊红染色，脱水，透明，使用中性树脂封片并充分晾干后采集图像。
1.9 Giemsa染色观察幽门螺杆菌定植情况
小鼠胃组织脱水、包埋、切片步骤同HE染色。二甲苯脱蜡清洗，置于Giemsa染缸浸染，0.5％乙酸洗2 min，冲洗。乙醇脱水，二甲苯透明，封片晾干后图像采集。
1.10 免疫组化法检测TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平
将小鼠胃组织于60℃烤片12 h，切片脱蜡，抗原修复，加入1%高碘酸。依次孵育一抗、二抗后，DAB试剂显色，复染，脱水，透明，封片，晾干后图像采集。利用Image J软件计算阳性面积率，分析TLR4、MyD88及NF-κB蛋白的表达水平。
1.11 实时荧光定量PCR检测TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表达水平
Trizol法提取小鼠胃组织RNA，然后行逆转录及PCR扩增，使用2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。引物序列见表1。
表1TLR4、MyD88和NF-κB引物序列
1.12 ELISA检测血清中TNF-α、IL-8水平
试验结束后，所有小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血0.6 mL，静置于室温1 h后，在4℃环境下，以2 000 ✕g离心15 min，取上层血清0.1 mL，按说明书配置试剂，加样温育1.5 h，用生物素标记抗体工作液温育1 h，酶结合物工作液温育0.5 h，显色终止反应，在450 nm波长测量光密度（OD）值，绘制标准曲线并计算各样品中的TNF-α、IL-8含量。
1.13 统计学方法
本研究数据使用SPSS 26.0软件进行分析，数据同时满足正态分布且方差齐，以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠胃炎造模情况
对照组小鼠胃黏膜结构完整，未见幽门螺杆菌菌株定植；模型组小鼠胃黏膜下层水肿，黏膜层局部可见大量蓝紫色短杆状幽门螺杆菌菌株定植，见图1。
图1小鼠造模情况评估（Gimesa染色中黑色箭头示幽门螺杆菌菌体，呈蓝紫色短杆状）
2.2 幽门螺杆菌根除情况
对照组小鼠检测结果均为阴性，模型组小鼠检测结果均为阳性，灭幽汤组有4例阳性（50%），发酵液组有3例阳性（37.5%），西药组有3例阳性（37.5%）。
2.3 胃黏膜组织病理形态学变化
对照组小鼠胃黏膜上皮细胞结构完整，未见炎症细胞浸润；模型组胃黏膜较对照组变薄，部分上皮细胞坏死脱落，胃小凹及腺体结构欠完整，腺体排列紊乱，黏膜下血管有明显出血，可见大量炎细胞浸润；灭幽汤组、发酵液组及西药组小鼠胃黏膜组织病理学损伤均明显减轻，见图2。
图2各组小鼠胃黏膜组织病理学结果（HE染色，×200）
2.4 胃组织Giemsa染色
对照组小鼠胃黏膜层腺体排列整齐，未见幽门螺杆菌；模型组小鼠胃黏膜下层水肿，结缔组织疏松，可见大量呈短棒状的幽门螺杆菌；灭幽汤组小鼠胃黏膜层局部可见少量幽门螺杆菌；发酵液组及西药组小鼠胃黏膜层可见极少量幽门螺杆菌分布，见图3。
图3各组小鼠胃黏膜组织幽门螺杆菌感染情况（Giemsa染色，箭头示幽门螺杆菌菌体，呈蓝紫色，短杆状）
2.5 各组小鼠为组织中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平比较
与对照组比较，模型组小鼠胃组织TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，灭幽汤组、发酵液组及西药组TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平均降低（P<0.05）；与灭幽汤组比较，发酵液组和西药组TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平均降低（P<0.05），见图4、表2。
图4各组小鼠胃黏膜中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达（免疫组化染色，×100）
表2各组小鼠胃黏膜TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平比较
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与灭幽汤组比较，P<0.05
2.6 各组小鼠胃黏膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达水平比较
与对照组比较，模型组小鼠黏膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，灭幽汤组、发酵液组及西药组TLR4、MyD88和NF-κB 的mRNA表达水平均降低（P<0.05）；与灭幽汤组比较，发酵液组和西药组TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达水平降低（P<0.05），见表3。
表3各组小鼠胃黏膜TLR4、MyD88和NF-κB 的mRNA表达水平比较
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与灭幽汤组比较，P<0.05
2.7 血清TNF-α、IL-8水平
模型组小鼠血清TNF-α、IL-8含量高于对照组（P<0.05）；与模型组比较，灭幽汤组、发酵液组和西药组TNF-α、IL-8含量均降低（P<0.05）；与灭幽汤组比较，发酵液组和西药组TNF-α、IL-8含量减低（P<0.05），见表4。
表4各组小鼠血清TNF-α、IL-8水平比较
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05；c与灭幽汤组比较，P<0.05
3 讨论
幽门螺杆菌感染相关性胃炎属于中医“胃脘痛”“痞满”等范畴，由菌体入侵人体后引发湿热、气滞、血瘀等一系列变化而致病[9]。灭幽汤由湖南中医药大学第一附属医院王小娟教授所创制，方中黄芩作为君药以清上、中二焦之湿热；陈皮、蒲公英为臣药清热解毒、健脾燥湿，同时可助黄芩清热祛湿之力；另佐以三七、白及、青皮、乌贼骨理气活血；诸药合用，则湿热得以清利、郁滞得以疏散。
植物中药的有效活性成分通常存在于细胞壁内，细胞壁结构致密，阻碍有效成分向外界溶出。发酵是中药传统炮制工艺之一，具有提高中药利用率、无耐药性、改善肠道微生态等优点。经益生菌L.plantarum发酵产生的代谢物可直接水解植物细胞壁中的纤维素、半纤维素等物质，促进有效成分得以溶出，提高药效[10-11]。王晨曦等[12]利用L.plantarum对沙棘进行发酵实验显示，除了改善沙棘汁口感外，还释放出了活性更强的黄酮苷元类物质；党参渣经L.plantarum发酵后可产生更多的黄酮类化合物、木脂素、生物碱等活性物质[13]；薏苡仁经L.plantarum发酵后不仅可以调节小鼠肠道菌群，还能改善其免疫生化指标[14]。本研究采取幽门螺杆菌菌液灌胃制备小鼠胃炎模型，结果表明，经L.plantarum处理的灭幽汤发酵液的治疗效果优于灭幽汤，能提高幽门螺杆菌清除力，有效改善胃组织病理学损伤、减轻炎症。
近年对灭幽汤治疗幽门螺杆菌感染相关性胃炎的作用机理进行研究发现，灭幽汤对凋亡相关信号通路有抑制作用，能减少幽门螺杆菌诱导的胃黏膜细胞凋亡[15-16]；本研究从抑制炎症反应角度探讨了灭幽汤及其发酵液的治疗机制。已有研究证实，TLR4与幽门螺杆菌感染及其引发的慢性炎症肿瘤关系密切[17-19]。MyD88 依赖性途径是TLR4被激活后介导炎性信号的主要通路，通过激活NF-κB诱导炎症因子释放，加重组织炎症反应，在幽门螺杆菌感染的萎缩性胃炎中起关键作用[20-22]。本研究结果也发现TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA及蛋白表达水平、血清TNF-α和IL-8含量在幽门螺杆菌感染相关性胃炎小鼠升高，说明幽门螺杆菌感染能激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，促进其下游的基因TNF-α、IL-8的转录和翻译，引发释放更多的炎症因子，加重胃黏膜组织病理损伤。此外，本研究还发现灭幽汤及其发酵液均能抑制幽门螺杆菌定植及生长，减轻感染，进而抑制胃黏膜TLR4/MyD88/NF-κB信号通路活化，减少炎症因子生成，且灭幽汤发酵液的抑制作用更为明显。
综上所述，灭幽汤及其发酵液均可清除幽门螺杆菌定植，减轻胃黏膜炎症，其治疗机制包括抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路、减少炎症因子释放。与灭幽汤比较，灭幽汤发酵液治疗幽门螺杆菌感染相关性胃炎的疗效更佳，这与L.plantarum本身的抑幽门螺杆菌生长作用有关，还可能与灭幽汤发酵后活性成分溶出增多有关。但发酵液活性成分需进一步定性定量分析，其治疗作用有待开展临床研究证实，以期为临床幽门螺杆菌感染相关性胃炎的治疗提供更多更优选择。