摘要
目的：借助网络药理学与分子对接技术探讨黄连温胆汤“异病同治”胆囊胆固醇结石（CG）和冠心病（CHD）的作用机制。方法：利用传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中医药整合药理学研究平台数据库（TCMIP）获取黄连温胆汤的潜在活性成分及其作用靶点，使用GeneCards、OMIM数据库筛选两种疾病靶点，借助Venny 2.1将上述筛选的药物活性成分作用靶点与疾病相关靶点取交集，使用Cytoscape 3.10.2软件构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络。通过STRING数据库对交集靶点进行蛋白质互作分析，使用DAVID数据库对共有靶点进行基因本体（GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，利用AutoDock Vina对关键靶点进行分子对接并验证结合活性。结果：共筛选出135个黄连温胆汤有效成分及947个潜在作用靶点，与两种疾病的交集靶点207个；PPI网络拓扑分析筛选出肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt1）、白蛋白（ALB）、肿瘤蛋白53（TP53）等核心靶点；GO功能富集分析涉及生物过程854项，细胞组成92项，分子功能206项，KEGG主要富集在脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、TNF信号通路、IL-17信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）等相关通路；分子对接结果表明，黄连温胆汤主要活性成分与疾病核心靶点具有较好的构象。结论：黄连温胆汤可能作用于TNF、IL-6、Akt1、ALB、TP53等关键靶点，调控PI3K/Akt、AMPK、TNF和IL-17信号通路发挥“胆心同治”的作用。
Abstract
Objective To explore the mechanism of Huanglian Wendan decoction in treatment of cholesterol gallstones and coronary heart disease based on network pharmacology and molecular docking. Methods The potential active components and their action targets of Huanglian Wendan decoction were obtained from the TCMSP and TCMIP databases. The disease targets of two disease were screened from the GeneCards and OMIM databases. The intersection of the drug active component action targets and disease-related targets was obtained by using Venny 2.1. The “Chinese medicine-active component-target-disease” network was constructed by using Cytoscape 3.10.2 software. The protein-protein interaction analysis of the intersection targets was conducted through the STRING database. The gene ontology (GO) functional analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of the common targets were performed by using the DAVID database. The molecular docking of the core component key targets was verified by using AutoDockVina to confirm the binding activity. Results A total of 135 active components and 947 potential targets of Huanglian Wendan decoction were identified, with 207 overlapping targets associated with thetwo diseases. The PPI network topology analysis revealed key targets including TNF, IL-6, Akt1, ALB and TP53. GO enrichment analysis covered 854 biological processes, 92 cellular components and 206 molecular functions. KEGG pathway analysis highlighted significant enrichment in pathways related to lipid metabolism and atherosclerosis, fluid shear stress and atherosclerosis, PI3K/Akt signaling, TNF signaling, IL-17 signaling and AMPK signaling. Molecular docking studies demonstrated that the primary active components of Huanglian Wendan decoction exhibited favorable binding conformations with these core disease targets. Conclusion Huanglian Wendan decoction may act on key targets such as TNF, IL-6, Akt1, ALB, TP53 and regulate PI3K/Akt, AMPK, TNF and IL-17 signaling pathways to play a role of “Treating gallbladder and heart together”.
胆囊胆固醇结石（cholesterol gallstones，CS）是胆囊结石的最常见类型，患病率呈逐年上升态势[1]，主要表现为反复性右上腹或剑突下疼痛，伴有恶心、呕吐、嗳气、腹胀等不适，急性发作时甚至可诱发胆源性胰腺炎、胆囊穿孔[2]，其发病机制涉及胆囊收缩功能障碍、胆汁排空延迟或受阻、胆汁胆固醇过饱和等多个方面[3]。目前药物与手术治疗均取得一定进展，但仍存在术后胆石再生、胆汁反流等风险，严重影响患者生活质量。冠心病（coronary heart disease，CHD）是由于冠状动脉粥样硬化致使管腔狭窄、阻塞，继而导致心肌缺血缺氧而诱发的慢性血管炎症性疾病，其发病率、死亡率及致残率均维持在较高水平，患者常有发作性心胸憋闷、疼痛症状[4-5]，治疗主要包括药物和侵入性手术等，但仍存在一定局限性。CS与CHD发病关系密切，临床上常同时兼见，一项大型前瞻性队列分析表明，既往有CS病史的患者罹患冠心病的风险会增加23％[6]，脂代谢紊乱则是两种疾病发生的共同致病基础[7]。
中医经典方剂具有多成分、多靶点、多通路的干预优势，在各类急慢性疾病治疗中发挥着不可或缺的作用。黄连温胆汤出自陆廷珍所著的《六因条辨》，由陈皮、茯苓、枳实、黄连、半夏、炙甘草、生姜、竹茹、大枣等9味中药组成，具有理气化痰、和胃利胆之功，广泛运用于心血管和代谢性疾病中[8-9]。药理学研究表明，黄连温胆汤具有保护血管内皮功能，改善动脉斑块，调节血脂和维持胆固醇代谢稳态等多种药理作用[10-11]，对CS和CHD有“异病同治”的作用。目前黄连温胆汤治疗CS和CHD的共同作用机制尚不明确，故本研究借助网络药理学和分子对接技术探索药效物质基础、初步验证潜在靶点，旨在为后续深入研究奠定基础。
1 资料与方法
1.1 黄连温胆汤活性成分及靶点筛选
运用传统中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/）对黄连温胆汤中的9种中药成分进行筛选，筛选标准设定为生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18；由于TCMSP数据库中未收录竹茹成分，以druglikness weight＞0.6作为筛选条件，从中医药整合药理学研究平台数据库（TCMIP，http://www.tcmip.cn/）查询竹茹的有效成分；通过Pubchem数据库获取上述有效活性成分Smiles编号，并将其导入Swiss Target Prediction数据库（http://www. swisstargetprediction.ch/）进行预测，将possibility＞0的成分靶点进行去重、汇总，建立黄连温胆汤活性成分库及靶点。
1.2 疾病相关靶点及交集靶点获取
以“cholesterol gallstones”“coronary heart disease”为检索词，分别在OMIM数据库（https://www.omim. org/）和GeneCards数据库（https://www.genecards. org/）中进行靶点检索，汇总2个数据库中所得靶点，删除重复项后建立疾病靶点库；使用Venny2.1软件绘制韦恩图，获得黄连温胆汤有效成分-疾病交集靶点。
1.3 构建“中药-活性成分-靶点-疾病”网络
分别将黄连温胆汤中所含中药、活性成分、共有靶点及疾病导入Cytoscape3.10.2软件，形成相互作用网络，并运用CytoNCA插件进行拓扑学分析，筛选出治疗CS和CHD的关键成分。
1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络与核心靶点预测
将共有靶点导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/）中进行蛋白互作分析，限定物种来源为人，最小互相作用阈值设定为0.4，选择“multiple proteins”分析模式并隐藏游离靶点，构建PPI网络。将PPI网络关系导入Cytoscape3.10.2软件，利用Analyze Network插件对网络图进行分析，通过Centiscape2.2插件对交集靶点进行筛选，以连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closeness）三个阈值筛选出核心靶点。
1.5 基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
通过DAVID数据库（http://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对共有交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析；以P＜0.05为条件，获取GO生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）分析结果及KEGG通路分析结果，随后将其导入微生信在线平台（http://www. bioinformatics.com.cn）进行可视化处理。
1.6 分子对接验证
分别从“中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络和PPI网络中筛选出核心成分、关键靶点进行分子对接验证。从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取所选蛋白和小分子结构，运用Pymol2.6.0软件对其进行去水、删除无关晶体处理；预处理后使用AutoDock Vina1.1.2进行分子半柔性对接，并在Pymol2.6.0软件中进行可视化处理。
2 结果
2.1 黄连温胆汤有效成分及靶点
经检索、去除重复项后获得黄连温胆汤有效成分135种，其中黄连13种，法半夏5种，竹茹3种，枳实9种，陈皮5种，茯苓11种，炙甘草81种，生姜4种，大枣14种；将从Pubchem、Swiss Target Prediction检索获取的有效成分对应靶点进行汇总、去重，获得947个靶点。
2.2 疾病靶点筛选及交集靶点获取
利用GeneCards、OMIM数据库获取两种疾病相关靶点信息，经筛重整理后，CS、CHD分别获得1609、10214个相关疾病靶点；将黄连温胆汤成分靶点与两种疾病靶点导入Venny2.1软件，绘制中药与疾病的交集靶点韦恩图，获得207个共同靶点，见图1。
图1黄连温胆汤与CS、CHD交集靶点韦恩图
2.3 “中药-活性成分-靶点-疾病”网络构建
将中药、有效成分和交集靶点导入Cytoscape3.10.2软件中绘制“中药-活性成分-靶点-疾病”网络关系图，见图2。正六边形代表9种中药，圆形代表有效成分，V形代表药物-疾病的交集靶点。通过CytoNCA插件分析节点的Degree值，取Degree值排名前10的活性成分。
图2“中药-成活性分-靶点-疾病”网络关系图
2.4 PPI网络构建与核心靶点筛选
将2.2中获得的交集靶点导入STRING数据库中，获取交集靶点PPI网络关系图，随后将其导入Cytoscape3.10.2软件中进行整理、优化，见图3；其中网络图中节点大小与Degree值呈正比，节点越大、颜色越深则表明Degree值越大，基因可能发挥的作用则越大。通过Centiscape2.2插件对靶点进行筛选并绘制Degree排名前10的核心靶点网络图，见图4。结果表明，黄连温胆汤“异病同治”CS和CHD的核心靶点主要包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt1）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、白蛋白（ALB）、肿瘤蛋白53（TP53）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）等，见表1。
图3交集靶点PPI网络关系图
图4核心靶点PPI网络关系图
表1基于PPI拓扑分析的核心靶点排序
2.5 GO功能分析和KEGG信号通路富集分析
GO通路富集分析得到BP854项，CC92项，MF206项，其中BP主要包括炎症反应、胞浆钙离子浓度的正调控、基因表达的正向调控等，CC主要包括受体复合物、质膜外侧、细胞外间隙等；MF主要包括核受体活性、酶结合、同型蛋白结合等。分别筛选出排名前10的BP、CC和MF绘制柱状图，见图5。KEGG通路富集分析显示获得177条通路，主要包括脂质与动脉粥样硬化、流体剪切应力与动脉粥样硬化以及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路等，见表2。以P＜0.05为筛选条件，将富集程度排名前20的通路绘制KEGG通路富集气泡图，见图6。
2.6 分子对接结果
将槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、猪苓酸C等度值排名前5位的主要活性成分作为配体，选择TNF、IL6、AKT1、ALB、TP53等5个核心靶点蛋白作为受体，并将其导入Autodock Vina1.1.2软件进行分子对接验证，计算其结合能并进行热图绘制，见图7。其中，选择亲和力最好的6对构象作为最终的对接构象，用Pymol2.6.0软件进行可视化处理，见图8。
图5GO功能富集分析柱状图
表2前20条KEGG通路富集分析
图6KEGG富集分析气泡图
图7关键活性成分与靶点蛋白的分子对接结合能热图
图8关键活性成分与靶点蛋白的分子对接可视化
3 讨论
CS主要由胆汁中胆固醇过饱和所致，CHD的发生则与血浆中高水平低密度脂蛋白胆固醇升高相关。CS在祖国医学中属“胆石症”“胆胀”范畴，病位在肝胆，与脾胃密切相关；CHD根据其临床表现应属“胸痹”“心痛”范畴，病位主要在心，涉及肝、脾、肾等脏腑，“土壅木郁、母（肝）病及子（心）”是两者疾病的共同病机，二者疾病发病有着明显的关联性，理气化痰、利胆和胃的黄连温胆汤可充分发挥“异病同治”优势。本研究通过网络药理学方法筛选出黄连温胆汤135种有效成分和947个药物作用靶点，其中槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、猪苓酸C是其主要活性成分。槲皮素属于黄酮类化合物，具有抗炎、抑菌、改善血管内皮和抗氧化应激等药理作用。研究发现，槲皮素不仅可上调CYP27A1表达，增加LXRα-ABCA1/G1信号通路介导的胆固醇输出，有效降低巨噬细胞泡沫化水平从而发挥对CHD保护作用[12]；槲皮素还可通过抑制由CD36介导的胆固醇摄取，促进胆固醇向胆汁酸转化和胆固醇流出，调节胆固醇代谢以治疗胆石症[13]。豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇均属于甾体类化合物，具有抗炎、降低胆固醇、抗动脉粥样硬化等生物活性[14-15]。实验研究表明，其能通过调节肠道菌群抑制三甲胺产生，减轻胆固醇代谢和炎症反应等方式多途径改善载脂蛋白E基因缺失小鼠的动脉粥样硬化[16]，同时有研究发现β-谷甾醇可与胆固醇竞争结合位点，恢复高胆固醇状态下1型胆囊收缩素受体的异常构象以促进胆囊收缩和调节胃排空[17]。猪苓酸C则属于三萜类化合物，具有较强的抗炎、抗氧化、免疫调节和调节脂质稳态作用[18]。综上推测，以上5种活性成分槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、猪苓酸C是黄连温胆汤治疗CS和CHD的重要物质基础。
本研究通过对PPI网络进行拓扑分析，共筛选得到TNF、IL-6、Akt1、ALB、TP53等核心靶点，各靶点之间通过发挥协同作用治疗CS和CHD。TNF和IL-6是斑块内炎性反应的重要炎症介质，可进一步放大炎症反应和影响斑块稳定。既往研究证实，TNF可促进神经毒性物质释放和缩血管物质生成，加重冠脉缺血性损伤和促使血栓形成[19]，同时IL-6还可诱导肝脏产生急性期蛋白和增强白细胞和心肌细胞黏附作用，致使血栓形成和心肌细胞损伤[20]；免疫组化研究指出，IL-6、TNF-α在胆石症患者胆囊黏膜中高表达[21]，这提示TNF、IL-6可导致CS和CHD发生与发展。Akt1是PI3K/Akt通路中重要的靶基因，在细胞生存、增殖和代谢等过程中发挥重要作用。研究显示，Akt1激活可缓解内皮细胞损伤，减轻心肌组织损伤和促进心肌细胞存活，而Akt1失活则可能导致心肌细胞凋亡[22]；Akt1同样在调节胆汁酸代谢和胆固醇稳态中发挥了重要作用，PI3K/AKT/mTOR通路异常可导致胆固醇过饱和从而增加胆石症的风险[23]。ALB是最常见的血浆蛋白，参与机体凝血、炎症反应和结合运输物质过程，ALB的降低可刺激脂质和凝血因子合成增加，致使斑块逐渐增大和加速血栓形成[24]；此外，ALB含量降低可导致其结合运输游离胆红素和胆汁酸盐的减少，间接促进胆固醇过饱和胆汁成分异常。TP53是一种关键的肿瘤抑制基因，参与细胞增殖、分化及凋亡。TP53突变可导致细胞凋亡功能受损，造成血管内皮细胞功能障碍和IL-6、TNF-α等炎症细胞过度积累，加剧动脉粥样硬化[25]；同时有研究发现，TP53突变不仅在癌症中作用复杂，其可抑制胆固醇逆向转运相关蛋白表达，影响胆汁酸代谢和胆固醇稳态，从而促进胆石形成[26]。
GO分析发现，黄连温胆汤治疗CS与CHD的靶基因涉及炎症反应、胞浆钙离子浓度的正调控和基因表达的正向调控等生物过程，受体复合物、质膜外侧及细胞外间隙等分子功能。KEGG富集显示关键靶点聚焦在PI3K/Akt、AMPK、TNF和IL-17通路。PI3K/Akt是广泛存在于真核细胞内的信号转导途径，参与调控细胞周期、炎症反应和脂质代谢等多种生物学行为。有研究发现，PI3K/Akt通路参与肝内胆固醇的调节作用[27]。蒲俊等[28]也发现，汉黄芩素可通过干预PI3K/Akt通路调控NLRP3炎性小体活化，抑制心肌细胞凋亡、心肌纤维化和炎性反应，从而改善CHD大鼠心肌损伤。AMPK是细胞内重要的能量代谢通路，在能量平衡中扮演“开关”角色。研究发现，花黄色素可通过调控AMPK/SIRT1/NF-κB通路，提高冠心病大鼠心肌抗氧化水平，减轻其炎症反应，从而改善心肌损伤[29]。此外，实验研究发现可通过靶向调控Hippo/AMPK/AKT通路，实现肝脏胆固醇代谢稳态和降低胆固醇累积，从而抑制CS生成[30]。TNF和IL-17通路是CS与CHD发生发展的重要途径，二者均为炎症相关通路，可加重和放大炎症反应。研究表现，上述两条通路可导致血管内皮功能障碍和炎症反应发生，促进冠心病和胆石症发展[31-32]。分子对接结果显示，黄连温胆汤的5种核心活性成分与5个核心靶点蛋白之间具有较强的亲和力，其中ALB与各活性成分的结合能均较高，提示其可能为黄连温胆汤“异病同治”CS和CHD的关键靶点。
综上所述，黄连温胆汤可能通过槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、猪苓酸C等有效活性成分作用于PI3K/Akt、AMPK、TNF、IL-17通路以及TNF、IL-6、Akt1、ALB、TP53核心靶点发挥“胆心同治”作用。本研究运用网络药理学和分子对接技术，初步探究了黄连温胆汤对CS及CHD“异病同治”机制，为“心病从肝（胆）论治”向“肝（胆）心同调”奠定了基础，同时也为课题组后续研究提供了一定参考，但具体作用机制仍需在细胞和动物水平作进一步验证。