摘要
目的：基于16S rRNA测序及非靶向代谢组学技术，分析肠道菌群的变化及肠道代谢物的富集通路，探讨新金汁（粪菌移植）对热秘型便秘大鼠的治疗机制。方法：将32只雌性Wistar大鼠适应性喂养1周后，随机均分为模型组、粪菌移植组、乳果糖组和空白组，粪菌移植组先通过抗生素鸡尾酒法（杆菌肽、新霉素和链霉素混合）处理为假无菌大鼠，之后粪菌移植组、乳果糖组与模型组同时给予热性中药（黑附片、干姜、吴茱萸、肉桂、胡椒，生药浓度为20 g/kg）联合盐酸洛哌丁胺（2 mg/kg，）连续给药2周，建立热秘型便秘大鼠模型后进行干预，乳果糖组作为阳性对照组，灌胃10 mL/kg乳果糖，粪菌移植组灌胃10 mL/kg粪菌液，均干预2周。计算并比较四组大鼠的粪便含水率和肠道炭末推进率，采用16S rDNA测序检测模型组、粪菌移植组和空白组粪便标本肠道菌群特征及肠道代谢物的富集通路分析。结果：与空白组相比，模型组大鼠的粪便含水率和肠道炭末推进率降低；与模型组相比，粪菌移植组和乳果糖组粪便含水率和肠道炭末推进率明显升高，差异有统计学意义。与空白组相比，模型组的拟杆菌门（Bacteroidota）丰度降低，条件致病菌变形菌目（Proteobacteria）异常增殖。粪菌移植干预后菌群均匀度指数与厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidota）比例趋近空白组水平。线性判别分析（LEfSe）和LDA评分显示粪菌移植组优势菌群主要是普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和理肯氏菌科（Rikenellaceae）。代谢组学揭示粪菌移植能显著富集脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢等核心代谢通路。结论：新金汁通过重塑肠道菌群多样性，平衡肠道菌群结构，激活菌群代谢功能，重构肠道微生物稳态，从而有效缓解热秘型便秘。
Abstract
Objective To elucidate the therapeutic mechanisms of new Jinzhi (fecal microbiota transplantation, FMT) in heat-constipation type constipation rats by integrating 16S rRNA sequencing and untargeted metabolomics to analyze gut microbiota and metabolic alterations and the enriched pathwaysof gut metabolites. Methods Thirty-two female Wistar rats were acclimatized for one week and then randomly allocated into four equal groups: Model group, FMT group, Lactulose group, and Blank control group. Rats in the FMT group were first rendered pseudo-germ-free using an antibiotic cocktail protocol (a mixture of bacitracin, neomycin, and streptomycin). Subsequently, the FMT group, Lactulose group, and Model group received a combination of heat-inducing Chinese herbs (Aconitum carmichaelii, Zingiber officinale, Evodia rutaecarpa, Cinnamomum cassia, Piper nigrum; crude drug concentration 20 g/kg) and loperamide hydrochloride (2 mg/kg) via gavage for two consecutive weeks to establish the heat syndrome constipation model. Following model establishment, interventions were administered for two weeks: the Lactulose group (positive control) received lactulose (10 mL/kg), and the FMT group received fecal microbiota suspension (10 mL/kg). Fecal water content and intestinal charcoal propulsion rate were calculated and compared among all four groups. Fecal samples from the Model group, FMT group, and Blank control group were subjected to 16S rDNA sequencing to characterize the gut microbiota and untargeted metabolomics to analyze enriched metabolic pathways. Results Compared to the blank group, the model group exhibited reduced fecal water content, decreased carbon propulsion rate, diminished Bacteroidota abundance, and abnormal proliferation of Proteobacteria (a conditional pathogen). FMT intervention significantly improved fecal water content and propulsion rate, restored microbial evenness (Shannon index) and Firmicutes/Bacteroidota ratio to near-baseline levels. LEfSe analysis identified Prevotellaceae and Rikenellaceae as signature taxa in the FMT group. Metabolomic profiling revealed significant enrichment of core metabolic pathways, including lipid metabolism, energy metabolism, and amino acid metabolism. Conclusion New Jinzhi alleviates heat-constipation by remodeling gut microbiota diversity, balancing microbial structure, activating metabolic functions, and reconstructing intestinal microecological homeostasis.
便秘是一种以结肠动力减弱和传输延迟为特征的顽固性消化道疾病，其临床表现通常以排便时间长和排便困难为特征[1]，发病率逐年上升且多发于女性[2]，严重影响患者生活质量[3]。热秘型便秘是中医便秘证候分型之一，多因胃肠积热、津液耗伤导致肠道传导失司[4]。尽管乳果糖等渗透性泻剂可暂时缓解症状，但长期使用易引发腹胀[5]。近年研究表明，肠道菌群紊乱与便秘的发生发展密切相关，菌群结构失调可通过影响肠神经递质代谢、短链脂肪酸生成及肠道屏障功能等途径加剧结肠动力障碍[6]。
新金汁作为中医特色粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）制剂，具有“以浊化浊”的理论特色，目前针对新金汁改善便秘的研究多聚焦于临床症状观察[7]，而对菌群动态重塑的解析与机制研究仍存在局限[8]，对热秘证模型肠道菌群-宿主互作的动态调节规律仍有待阐明。本研究通过建立热秘型便秘大鼠模型，结合16S测序技术探究FMT对肠道菌群结构的调控作用，并筛选与结肠动力改善密切相关的核心功能菌群，旨在为粪菌移植治疗慢性传输型便秘的机制研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
32 只雌性Wistar大鼠（210～230 g，8周龄）购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2021-0006。饲养于SPF级动物房，温度23~26℃，相对湿度50%~70%，动物自由摄食、饮水，房间设置独立通风系统。本实验已经通过我院医学伦理委员会审批（批准号：ZXHK-DWLL-2025-0036）。
1.2 动物分组、造模
大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白组、模型组、粪菌移植组、乳果糖治疗组，每组8只。粪菌移植组通过抗生素鸡尾酒法（杆菌肽、新霉素和链霉素混合）[9]制备伪无菌大鼠后，与模型组和乳果糖组采取同样造模方法：给予热性中药（黑附片、干姜、吴茱萸、肉桂、胡椒，生药浓度为20 g/kg）联合肠道蠕动抑制剂盐酸洛哌丁胺（2 mg/kg，西安杨森制药有限公司），每天灌胃1次，连续给药14 d造模[10]。观察造模组大鼠的状态，表现为精神状态差、粪便干结、排便数量减少提示造模成功。乳果糖组设立的主要目的是验证便秘模型造模成功，并作为评价FMT疗效的阳性药物参照，其肠道菌群结构与本研究关注的FMT对菌群的重塑机制无直接可比性，故乳果糖组不纳入后续肠道菌群分析。
1.3 给药方法
空白组正常进食饮水，每日收取新鲜粪便制备粪菌液，模型组灌胃10 mL/kg常温生理盐水，乳果糖组灌胃10 mL/kg乳果糖，粪菌移植组灌胃10 mL/kg粪菌液，每天灌胃1次，连续灌胃14 d。粪菌液的制备方法：每天用无菌烧杯收集空白组大鼠新鲜粪便10 g。将粪便置于50 mL低温无菌生理盐水中，在冰浴条件下，以300～500 r/min低速匀浆3~5 min，直至形成均质悬液。随后逐级过滤。一级过滤：过500 μm无菌尼龙网去除未消化纤维；二级过滤：过200 μm细胞滤网，收集得到的粪菌悬液并记录体积。将悬液置于4℃离心机中，以500 r/min离心5 min，弃去上清液，保留沉淀物，补充生理盐水至离心前体积，再置于4℃离心机中，以5000 r/min离心5 min，重复上述操作共2次，最终获取沉淀物，再次用生理盐水补充至离心前的体积，即为所得粪菌液。
1.4 大鼠粪便含水率检测
用代谢笼收集四组大鼠的24 h粪便，记录粪便湿重、粪便干重（80℃烘箱烘干24 h），计算粪便含水率=（粪便湿重－粪便干重）/粪便湿重×100%。
1.5 肠道炭末推进率检测
经大鼠口灌入墨汁1.5 mL/只，20 min后处死大鼠，完整剥离并平铺其小肠，记录大鼠幽门括约肌位置到墨汁推进末端距离和小肠的全肠长度，计算四组大鼠的肠道炭末推进率=幽门口至染黑肠管的距离/幽门口至直肠末端距离×100%[11]。
1.6 微生物区系16S rRNA测序分析
在实验结束前收集测模型组、粪菌移植组和空白组大鼠的粪便并及时置于液氮中，以确保微生物群落结构稳定，避免微生物因环境变化发生群落结构改变（注：设置乳果糖组是作为药物阳性对照验证模型的有效性，乳果糖的作用机制与菌群重构无直接关联因此不检测乳果糖组的肠道菌群变化）。对粪便样本中的微生物基因组DNA进行提取，获取高纯度的基因组DNA，确保DNA的浓度、纯度等满足后续实验要求。依据16S rRNA基因的保守区域，设计并合成特异性引物。合成后的引物经高效液相色谱（HPLC）分析检测，保证引物质量。以提取的基因组DNA为模板，利用合成的引物进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行纯化，去除引物二聚体、非特异性扩增产物等杂质，构建测序文库。将质检合格的文库置于Illumina HiSeq平台上进行高通量测序。测序产生的原始数据经过滤获得高质量的有效序列。本实验由北京诺禾致源科技股份有限公司提供技术支持并完成。本实验的ɑ多样性和β多样性等参数分析均基于北京诺禾致源科技股份有限公司开发的诺禾云平台进行。
1.7 统计学处理
研究数据使用GraphPad Prism 8.0绘图，采用表示，使用SPSS 26.0软件对数据进行分析，多组间比较采用Tukey’s t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 粪便含水率结果
与空白组相比，模型组大鼠粪便含水率显著降低；与模型组相比，粪菌移植组和乳果糖组大鼠粪便含水率显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01），见图1。
2.2 大鼠肠道炭末推进率
与空白组相比，模型组大鼠肠道炭末推进率降低；与模型组相比，乳果糖组和粪菌移植组肠道炭末推进率升高，差异均有统计学意义（P<0.01），见图2。
2.3 FMT对大鼠肠道菌群ɑ多样性指数的影响
采用16S rDNA测序技术分析空白组、模型组与粪菌移植组大鼠肠道菌群的α多样性结果显示：模型组表现出较高的物种丰富度和多样性；粪菌移植组丰富度较高，但Shannon指数略低，Simpson指数最高，见图3。
图1各组大鼠粪便含水率比较
图2各组大鼠肠道推进率比较
图3三组大鼠肠道菌群α多样性比较
2.4 FMT对大鼠肠道菌群β多样性的影响
基于加权UniFrac和非加权UniFrac距离矩阵的PCA分析空白组、模型组与粪菌移植组大鼠粪便肠道菌群的β多样性结果显示，三组之间的样本聚类存在明显差异，见图4。
图4各组大鼠肠道菌群β多样性比较
2.5 FMT对大鼠肠道菌群结构的影响
空白组、模型组与粪菌移植组大鼠的肠道菌群在门、纲、目、科、属、种等多个分类层级上存在显著的差异。在纲水平上，空白组肠道菌群以拟杆菌纲（Bacteroidia）和梭菌纲（Clostridia）为主。FMT干预后菌群的比例趋近空白组水平，见图5A。在科水平上，空白组的优势菌群以穆里杆菌科（Muribaculaceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）为主。与之相比，模型组穆里杆菌科（Muribaculaceae）菌群相对丰度显著降低，普雷沃菌科（Prevotellaceae）和振荡杆菌科（Oscillospiraceae）等菌群丰度明显上升。FMT后，群落结构与空白组仍存在部分差异，如Lachnospiraceae未完全恢复至正常水平，见图5B。在属水平上，模型组特定致病相关菌属埃希氏菌属—志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）丰度显著升高，粪菌移植组阿克曼菌属（Akkermansia）丰度较模型组下降，见图5C。在目水平上，模型组拟杆菌目（Bacteroidales）丰度降低，梭菌目（Clostridiales）和变形菌目（Proteobacteria）丰度显著增加；FMT后，Proteobacteria异常增殖明显抑制，见图5D。在门水平上，空白组肠道菌群以厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主，表现出健康肠道菌群的典型特征；粪菌移植组二者比例接近正常水平，见图5E。在种水平上，模型组嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）作为主要优势菌种出现（相较空白组丰度升高约3倍）；粪菌移植组此特征性致病菌显著减少，但多样性尚未完全恢复，见图5F。为了进一步研究属水平物种的系统进化关系，菌群变化趋势进一步证实见疾病模型大鼠肠道菌群显著紊乱，且FMT能显著改善慢传输型便秘大鼠的肠道菌群结构，见图5G。
图5大鼠肠道菌群物种分类学注释及组成分析结果图
2.6 肠道菌群组成差异分析
2.6.1 Anosim检验
对空白组、模型组和粪菌移植组进行Anosim分析并绘制箱线图，结果表明三组之间的肠道菌群整体结构差异显著，且组间差异大于组内差异，三组肠道菌群结构存在区分效果，见图6。
图6各组见Anosim分析结果
2.6.2 线性判别分析（LefSe）分析
空白组高度集中的细菌包括肠乳杆菌（Lactobacillus-intestinalis）和普雷沃氏菌属（Prevotella），模型组为罗姆布茨菌属（Romboutsia）、消化链球菌目-蒂西埃氏菌目（Peptostreptococcales-Tissierellales），粪菌移植组以有益菌群布劳特氏菌属（Blautia）、异普雷沃氏菌属（Alloprevotella）为主。进化分支图看到空白组优势菌为Prevotellaceae、糖单胞菌目（Saccharimonadales）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae），模型组为消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）、消化链球菌目-蒂西埃氏菌目（Peptostreptococcales-Tissierellales）、微球菌科（Micrococcaceae）、微球菌目（Micrococcales）和阴性杆菌纲（Negativicutes），粪菌移植组的优势菌为理肯氏菌科（Rikenellaceae）和单球杆菌科（Monoglobaceae），见图7、8。
2.7 代谢通路分析
分析空白组、模型组与粪菌移植组的正负离子代谢物在不同KEGG通路中分布的总体情况，结果显示代谢相关模块（Metabolism）是代谢物注释最多的功能模块，包含多种核心代谢通路，尤其是全局代谢映射和氨基酸代谢通路中代谢物数量最高，见图9。
3 讨论
本研究通过16SrRNA测序技术系统分析了FMT对热秘型便秘大鼠肠道菌群的调控作用，揭示了FMT通过恢复菌群多样性与结构稳态改善肠道功能[12]。研究发现便秘模型组虽然表现出较高的物种丰富度，但这可能反映了菌群紊乱状态下机会性病原体的异常增殖，是一种“病态多样性”，这与健康状态下以功能共生菌为主导的多样性有本质区别[13]。FMT干预后，模型组中促炎的埃希氏菌属-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）异常富集现象被显著抑制，同时短链脂肪酸（SCFA）产生菌如布劳特氏菌属（Blautia）和另枝菌属（Alistipes）的丰度升高[14]。这提示FMT的核心作用机制在于重建菌群平衡，通过抑制致病菌的过度增长，同时有效富集功能共生菌实现菌群再平衡[15]。这种“抑害扬益”的双向调节作用，是实现肠道功能（推进率、含水率）改善的关键基础。这提示在评估FMT疗效时，菌群组成的质量（功能菌丰度及比例）比单纯的物种数量（α多样性）更具意义。一个值得注意的发现是，尽管粪菌移植组厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidota）比例趋近空白组水平，但部分关键菌属如Lachnospiraceae和阿克曼菌属（Akkermansia）未完全恢复，这一现象提示：便秘诱导的菌群失衡可能造成了特定功能菌群生态位的深度损伤或丧失；宿主因素（如长期的黏膜环境改变、免疫状态）可能影响了这些特定菌群的定植与恢复；当前使用的FMT供体或移植方案可能对这些特定菌群的重建效率不足。这揭示了肠道菌群生态系统恢复的复杂性，并非所有失调都能被标准FMT完全逆转，可能存在一定程度的“不可逆性”，需要通过后续进一步实验（如菌株特异性移植、宿主因素干预）来验证这一假说[16]。
图7各组LDA值柱状分布图
图8LEfSe差异物种进化分支图
图9KEGG通路分析图
本研究确认了模型组中弯曲杆菌门（Campylobacterota）和螺杆菌科（Helicobacteraceae）等特定菌群标志物与肠道低度炎症密切相关。这些菌群可能通过激活TLR4/NF-κB等经典炎症通路，促进炎性因子释放，进而抑制肠神经系统活性，加剧便秘症状。FMT干预后观察到的炎症缓解，部分归因于其能有效富集具有潜在抗炎作用的菌属另枝菌属（Alistipes）降低促炎菌丰度，间接缓解炎症反应[17-18]，然而，菌群-免疫互作的具体分子靶点仍需深入解析。未来的研究需整合转录组学和蛋白组学，以更精准地阐明FMT调控肠道免疫微环境的机制。
本研究发现，FMT干预显著提升了大鼠的肠道推进率和粪便含水率，能有效恢复肠道功能，并有效缓解便秘症状。有研究发现FMT对疣微菌目（Verrucomicrobiales）等菌群的调节效应有限，尤其是嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）的丰度仍显著高于正常水平[19]。阿克曼菌具有“双面性”：一方面，它是重要的黏膜屏障保护者；另一方面，其过度增殖可能导致黏液层过度降解，长期看可能削弱屏障功能或影响黏液动力学，其“双面性”可能影响长期疗效[20]。因此，本研究中观察到的阿克曼菌持续高丰度，可能是影响FMT长期疗效稳定性的潜在因素，需要监测其对肠道稳态的长期效应。未来可探索标准化粪菌液制备流程（如去除特定菌群组分）或联合代谢产物（如丁酸盐灌肠）以增强干预特异性。通过代谢通路分析结果指导机制研究，代谢相关研究将是今后深入研究的重点。
综上所述，本研究证实FMT通过调控菌群多样性、抑制致病菌增殖及恢复SCFA代谢平衡，有效改善了热秘型便秘大鼠的肠道动力和粪便性状，并缓解了相关的肠道低度炎症。然而，研究也揭示了菌群重建过程的复杂性，表现为部分关键功能菌属恢复不完全及对特定菌群（如阿克曼菌）调节的局限性，提示可能存在生态位损伤或宿主特异性障碍。这些发现不仅深化了对FMT作用机制的理解，更重要的是为未来开发更精准、高效的个性化菌群干预策略（如改良FMT、联合代谢产物）和深入的功能机制研究（聚焦代谢通路、多组学整合）指明了方向，为FMT治疗便秘的临床转化奠定了重要的理论基础。