摘要
目的：挖掘GEO数据库中膝关节内免疫细胞数据，将洋金花组分与巨噬细胞相关差异基因（DEMRGs）构建组分-靶点网络图及分子对接，以探究洋金花组分能否有效抑制膝关节手术后关节腔内炎症反应。方法：从GEO数据库下载GSE279915数据集以及洋金花各组分靶点的相关数据。利用limma数据包和相关性分析，获得巨噬细胞相关差异表达基因，并进行通路富集分析、洋金花组分-靶点互作网络的构建。采用分子对接验证洋金花组分和获得的差异基因之间的关系。结果：基于膝关节单核/巨噬细胞的转录组分析，共鉴定出1538个具有统计学意义的差异表达基因（DEGs），其中679个基因显著上调，859个基因显著下调。使用韦恩图筛选得到洋金花作用相关靶点及DEMRGs的交集基因。进一步使用STRING11.0数据库对洋金花的DEMRGs靶点进行蛋白互作网络图的构建，前10个关键基因为TNF、IL-6、AKT1、ESR1、PTGS2、INS、IL-1Β、BCL2、CASP3、GSK3B。为验证生物信息学预测的可靠性，使用分子对接验证洋金花组分-靶点结合情况，结果发现洋金花组分芦丁、槲皮素均可以和白细胞介素（IL）-1β、IL-6以及肿瘤坏死因子（TNF）结合，从而发挥抗炎效果。结论：洋金花及其活性成分通过多靶点、多途径发挥抗炎和镇痛作用，在膝关节手术围手术期管理中具有潜在应用价值。
Abstract
Objectives To conduct data mining on immune cell data in knee joint in GEO database, and construct a component-target network map and molecular docking between components and macrophage associated differentially expressed genes (DEMRGs). Methods Downloading the GSE279915 dataset and related data on the components and their targets. limma data package and correlation analysis were used to obtain DEMRGs, and the pathway enrichment analysis and the composition-target interaction network were carried out to obtain the key genes. To detect the relationship between the components and the selected differential genes, we used molecular docking to verify the binding. Results Compared the transcriptomic data of monocytes and macrophages in knee joint, 679 up-regulated and 859 down-regulated differentially expressed genes were obtained. The intersection genes of associated targets and DEMRGs were obtained by using Venn diagram. The composition-target interaction network was constructed using STRING database. The top 10 Degree key genes were TNF, IL-6, AKT1, ESR1, PTGS2, INS, IL-1β, BCL2, CASP3 and GSK3B. Molecular docking results showed that Rutin and quercetin could bind to IL-1β, IL-6 and TNF, and thus exert anti-inflammatory effects. Conclusion Yangjinhua and its active ingredients exert anti-inflammatory and analgesic effects through multiple targets and pathways, and have potential application value in perioperative management of knee joint surgery.
Keywords
膝关节手术，特别是全膝关节置换术（total knee arthroplasty，TKA）会引发显著的术后炎症反应，表现为促炎细胞因子释放、急性期蛋白升高和全身炎症反应综合征[1]。这种炎症反应不仅导致手术部位术后疼痛和肿胀，还与深静脉血栓形成、假体周围骨溶解等并发症相关[2]。
膝关节手术通过机械创伤、骨水泥反应和缺血再灌注损伤等多途径激活炎症级联反应[3-4]。典型表现包括：1）细胞因子风暴：手术创伤促使单核细胞、巨噬细胞等释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6等促炎因子，同时抗炎因子IL-10也相应增加[5]。研究表明，TKA术后6 h血清IL-6水平可升高至术前的10～20倍[6]。2）中性粒细胞激活：中性粒细胞通过浸润手术部位释放活性氧自由基和蛋白水解酶，导致组织损伤[7]。3）补体系统激活：手术过程中补体系统被激活，产生过敏毒素C3a、C5a，进一步放大炎症反应[8]。
洋金花又名曼陀罗花，辛、温，归肺经及肝经，可用于麻醉。在《医宗金鉴》整骨麻药方中记载，洋金花与草乌、川乌、姜黄同为麻醉药剂。近年来，以洋金花为主要活性成分的中药麻醉制剂及其单体衍生物（东莨菪碱）已成功应用于临床外科麻醉领域。洋金花提取物在动物模型中表现出显著的抗关节炎效果。在大鼠胶原诱导性关节炎模型中，洋金花生物碱能减轻关节肿胀和滑膜炎症，其机制可能与抑制Toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）通路有关[9]。这对膝关节置换术后炎症风暴的临床调控具有潜在转化价值。
本研究对GEO数据库中关于膝关节内免疫细胞数据进行分析，通过差异表达分析从巨噬细胞相关差异基因（DEMRGs）中筛选到关键基因，并将洋金花组分与DEMRGs构建组分-靶点网络图及分子对接，为开发新型靶向抗炎药物提供了理论依据，以期改善膝关节患者术后炎症控制及预后。
1 资料与方法
1.1 数据来源
使用TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/load_intro.php id=43）下载洋金花各组分及其靶点的相关数据。以关键词“knee osteoarthritis”和“智人”，从GEO数据库中下载GSE279915数据集，主要关注巨噬细胞及单核细胞的RNA-seq结果。
1.2 获取差异基因
首先，对原始转录组数据进行log2转换处理。采用R语言limma包对数据进行归一化处理和差异表达分析，获得差异表达基因（DEGs）。设定显著性阈值：|log2FC|＞0.5且校正P值＜0.05，然后使用Pearson相关分析得到巨噬细胞高度相关的基因列表。Pearson相关系数＞0.6的差异表达基因被认为是DEMRGs。使用韦恩图分析获得洋金花相关靶点及DEMRGs的交集基因。
1.3 富集分析
为了系统解析DEMRGs的生物学功能，利用R语言中的“ClusterProfiler”包进行GO/KEGG通路富集分析[8-10]。采用超几何检验进行显著性评估，设定校正P值＜0.05为显著性阈值，使用Benjamini-Hochberg方法进行多重假设检验校正，仅保留至少包含5个DEMRGs的通路/功能条目，使用ggplot2绘制富集气泡图。
1.4 蛋白质-蛋白质互作网络的构建
使用STRING数据库（https://string-db.org）构建蛋白质-蛋白质互作网络。使用Cytoscape进行网络拓扑分析，选取degree值排前十名的候选基因，将筛选的关键基金与洋金花活性成分靶点进行网络叠加，使用Merge功能构建整合互作网络。
1.5 分子对接
为了探究洋金花组分和差异基因之间的关系，本研究使用分子对接验证结合情况。蛋白的三维结构下载于pdb数据库，小分子组分的三维结构下载于Pubchem数据库。
2 结果
2.1 DEMRGs的筛选及富集分析
共获得679个上调基因，859个下调基因。这些基因富集于质膜通路，免疫受体激活通路以及细胞因子受体激活通路等（图1，表1）。
图1差异表达基因的GO/KEGG通路富集分析柱状图
2.2 DEMRGs关键基因的获取
使用STRING数据库对差异基因构建蛋白互作网络图（图2），前15个关键基因为FN1、H3C13、FCGR3B、KIT、FCGR3A、GNG7、CX3CR1、CD2、CXCR3、CD1C、SOX9、TLR3、MRC1、CD5、H2BC17。
2.3 洋金花组分-DEMRGs互作网络图的构建
使用韦恩图分析洋金花相关靶点及DEMRGs的交集基因（图3）。使用STRING数据库以及Cytoscape软件对洋金花组分-DEMRGs进行蛋白互作网络图的构建（图4）。
表1DEMRGs的GO/KEGG通路富集分析
图2DEMRGs的蛋白-蛋白互作网络图及其关键基因
图3洋金花相关靶点及DEMRGs的交集基因
图4洋金花组分-DEMRGs靶点互作网络图
使用STRING数据库对洋金花的DEMRGs靶点进行蛋白互作网络图的构建（图5），前10个关键基因为TNF、IL-6、AKT1、ESR1、PTGS2、INS、IL-1Β、BCL2、CASP3、GSK3B。
2.4 洋金花组分-靶点的分子对接
使用分子对接预测洋金花组分-靶点结合情况（图6~8），结果发现洋金花组分中芦丁、槲皮素均可以和IL-1β、IL-6及TNF结合，从而发挥抗炎效果。
图5洋金花组分的DEMRGs靶点的蛋白-蛋白互作网络图及其关键基因
图6洋金花组分与IL-1β的分子对接
图7洋金花组分与TNF的分子对接
图8洋金花组分与IL-6的分子对接
3 讨论
洋金花作为一种传统中药材，在现代医学研究中，特别是在抗炎和镇痛方面显示出多种药理活性的潜力。本文系统探讨了洋金花及其活性成分在膝关节手术围手术期对炎症反应的调节机制。洋金花主要成分包括莨菪碱、东莨菪碱和阿托品等托烷类生物碱[10]。这些成分已被证实具有显著的抗炎作用，主要通过抑制NF-κB信号通路和降低促炎细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的表达来发挥作用[11]。东莨菪碱显示出对炎症反应的调节能力，能减少中性粒细胞浸润和氧化应激反应[12]。
洋金花生物碱通过多种途径调节炎症反应，例如：1）抑制NF-κB活化：洋金花提取物能阻断IκBα降解，减少NF-κB核转位，从而下调炎症因子表达[13]；2）调节MAPK通路：洋金花成分可抑制p38 MAPK和JNK磷酸化，减少炎症介质产生[14]；3）抗氧化作用：洋金花能提高超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）水平，减轻氧化应激引起的炎症[15]；4）调节免疫细胞功能：洋金花生物碱可抑制巨噬细胞过度活化和中性粒细胞浸润[16]。在本研究中，洋金花通过抑制巨噬细胞内TNF、IL-1β及IL-6等炎症因子来减轻巨噬细胞相关炎症，从而在膝关节手术围手术期中起到抗炎作用。
尽管洋金花在抗炎和镇痛方面显示出了潜力，但在膝关节手术围手术期的应用仍需谨慎考虑：1）剂量控制：托烷类生物碱的治疗窗较窄，需精确控制剂量以避免不良反应[17]；2）给药途径：局部应用（如关节腔注射）可能比全身给药更适合术后使用[18]；3）药物相互作用：洋金花可能会增强其他中枢神经系统抑制药物的作用，需注意与麻醉药和镇痛药的协同效应[19]；4）个体差异：由于不同患者对洋金花生物碱的敏感性差异较大，还需个体化用药[20]。因此，可以选用筛选的洋金花组分，如芦丁、槲皮素、山柰酚等代替洋金花，进行抗炎治疗。未来我们将开展洋金花生物碱在膝关节手术后应用的临床随机对照试验研究，开发洋金花新型给药系统（如缓释制剂）以提高其疗效和安全性等方面来改善患者预后。
综上所述，洋金花及其活性成分通过多靶点、多途径发挥抗炎作用，在膝关节手术围手术期管理中具有潜在应用价值。然而，其临床应用，特别是在安全性、有效性和最佳用药方案方面仍需更多高质量研究支持。