摘要
目的：探讨氟暴露对小鼠精原细胞GC-1 spg的影响及机制。方法：以0.25~4 mmol/L浓度梯度的氟化钠（NaF）处理GC-1 spg细胞24 h，并用CCK-8法检测细胞活力。以1 mmol/L NaF和双蒸水分别处理GC-1 spg细胞24 h，构建氟染毒模型及对照，每组取3个样本进行转录组测序。借助Dr. Tom系统筛选差异表达基因（DEGs），经GO和KEGG进行功能注释与富集分析；通过STRING数据库联合Cytoscape软件构建PPI网络，筛选核心基因，并利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证其表达。结果：高浓度（1、2、4 mmol/L）NaF显著降低GC-1 spg细胞活力，差异有统计学意义（P<0.001），低浓度（0.25 mmol/L和0.5 mmol/L）无统计意义。转录组测序筛选出1393个DEGs，其中926个下调，467个上调。GO功能富集分析表明，DEGs富集于MAPK信号通路活性调节、内皮细胞迁移调节、蛋白质磷酸化调节等生物过程，细胞外基质、细胞质等细胞组分，以及蛋白质磷酸酶活性、转移酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析显示，DEGs参与细胞色素P450对药物的代谢、HIF-1、PI3K-Akt等多种生物过程。通过构建PPI网络图筛选出白细胞介素(IL)-6、四肽重复蛋白1（IFIT1）、C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10）、表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）共5个核心基因。经RT-qPCR验证，氟暴露组GC-1 spg细胞中IL-6、IFIT1和CXCL10基因表达显著升高，EGF和FGF2基因表达显著降低。结论：氟暴露可导致小鼠精原细胞GC-1 spg的活力损伤及大量基因的差异表达，这些基因参与多种生物学进程和信号通路调节，影响细胞的存活、增殖、凋亡、应激反应和炎症反应等过程，可能是氟暴露所致男性生殖损伤潜在的治疗靶点。
Abstract
Objective To investigate the effects of fluoride exposure on mouse spermatogonia GC-1 spg and its mechanism. Methods GC-1 spg cells were treated with sodium fluoride (NaF) at a concentration gradient of 0.25-4 mmol/L for 24 hours, and the cell viability was detected by the CCK-8 method. GC-1 spg cells were treated with 1 mmol/L NaF and double-distilled water respectively for 24 hours to construct the fluoride exposure model and the control group. Three samples were taken from each group for transcriptome sequencing. The Dr. Tom system was used to screen the differentially expressed genes (DEGs), and functional annotation and enrichment analysis were carried out through GO and KEGG. The PPI network was constructed by combining the STRING database and the Cytoscape software to screen the core genes, and RT-qPCR was used to verify their expression. Results High concentrations (1, 2, 4 mmol/L) of NaF significantly reduced the viability of GC-1 spg cells (P<0.001), while low concentrations (0.25 mmol/L and 0.5 mmol/L) had no significant effect. A total of 1,393 differentially expressed genes (DEGs) were screened out by transcriptome sequencing, among which 926 were downregulated and 467 were upregulated. GO functional enrichment analysis showed that DEGs were enriched in biological processes such as the regulation of MAPK signaling pathway activity, the regulation of endothelial cell migration, and the regulation of protein phosphorylation, in cellular components such as the extracellular matrix and cytoplasm, and in molecular functions such as protein phosphatase activity and transferase activity. KEGG pathway enrichment analysis showed that DEGs were involved in various biological processes such as the metabolism of drugs by cytochrome P450, HIF-1, PI3K-Akt, etc. Five core genes, namely IL-6, IFIT1, CXCL10, EGF, and FGF2, were screened out by constructing the PPI network diagram. Verified by RT-qPCR, the expressions of IL-6, IFIT1, and CXCL10 genes in GC-1 spg cells of the fluoride exposure group were significantly increased, while the expressions of EGF and FGF2 genes were significantly decreased. Conclusion Fluoride exposure can cause damage to the viability of mouse spermatogonial GC-1 spg cells and the differential expression of a large number of genes. These genes are involved in the regulation of various biological processes and signaling pathways, influencing processes such as cell survival, proliferation, apoptosis, stress response, and inflammatory response. They may serve as potential therapeutic targets for male reproductive damage caused by fluoride exposure.
氟化物作为常见环境污染物，其对男性生殖功能的影响备受关注。流行病学研究证实，高水平氟化物暴露与男性生育能力下降显著相关，长期接触氟化物会导致男性精子浓度和活力降低[1]。实验研究也发现，氟化物暴露可造成实验动物睾丸组织损伤、生精细胞数量减少及精子活力下降[2]。有研究显示，氟暴露可能通过氧化应激、炎症反应、激素调节等信号通路引发生殖损伤，但具体分子机制仍不明确[3]。小鼠精原细胞GC-1 spg可模拟生精细胞生长分化过程，是评估生殖毒性和探究分子机制的理想模型。同时，转录组学分析作为毒理学研究的重要手段，能有效识别有害物质暴露后细胞内信号通路变化及潜在生物标志物。本研究拟建立氟暴露的小鼠精原细胞模型，运用转录组学结合生物信息学分析与实验验证，旨在揭示氟暴露致男性生殖损伤的生物学机制。
1 材料与方法
1.1 细胞和主要试剂
小鼠精原细胞GC-1 spg购自武汉普诺赛生命科技有限公司，DMEM培养基和青霉素-链霉素双抗购自美国Cytiva公司，胎牛血清购自以色列Biological Industries公司，总RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司，NaF购自上海麦克林生化科技股份有限公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo Molecular Technologies公司，TransScript第一链cDNA Synthesis SuperMix试剂盒和TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 细胞培养
小鼠精原细胞GC-1 spg培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM高糖培养基，置于37℃、5% CO2湿润培养箱中，待细胞密度达90%时进行传代。
1.3 CCK-8法检测细胞活力
将GC-1 spg细胞以5000个/孔密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，分别用0、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L的NaF处理24 h。然后添加CCK-8试剂孵育1 h，使用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度，据此计算细胞活力。
1.4 转录组测序分析氟中毒相关基因表达变化
将GC-1 spg细胞分为对照组和NaF处理组，每组作3个重复孔，对照组和NaF处理组分别用双蒸水和1 mmol/L的NaF处理24 h。提取总RNA并检测其完整性和总量，确保RNA的质量符合测序要求。质控合格后，进行测序文库构建。文库构建及转录组测序由华大基因公司利用Illumina测序平台完成。
1.5 转录组测序分析氟中毒相关差异表达基因（differential gene expression，DEGs）及核心基因
使用SOAPnuke对测序得到的原始数据进行过滤，并采用Dr. Tom多组学数据挖掘系统（https://biosys.bgi.com）进行后续的数据分析和绘图。在差异基因检测中，使用DESeq2，设定阈值为Q值≤0.05且|log2（fold change）|>1，以识别显著DEGs。KEGG及GO富集分析方面，基于超几何检验，通过Phyper对差异基因进行GO及KEGG富集分析，设定Q值≤0.05为显著富集的标准。将DEGs导入STRING数据库，设定最低交互分数为0.7，建立蛋白质互作（PPI）网络。使用Cytoscape软件进行可视化处理，利用CytoHubba插件的Degree算法、BottleNeck算法、MCC算法及MCODE插件分析PPI网络中的子网络，四个结果的交集作为核心基因。
1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析
使用TRIzol提取总RNA，并按照说明使用试剂盒进行反转录。RT-qPCR采用qTOWER3 touch PCR仪和TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒进行。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，引物序列见表1。
表1RT-qPCR基因引物序列
1.7 统计学处理
使用GraphPad Prism 8软件对实验数据进行统计分析和绘图。所有数据以均值±标准差表示，多组数据比较时，采用单因素方差分析（ANOVA），多重比较用Dunnett检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 氟暴露对GC-1 spg细胞活力的影响
CCK-8结果显示，与对照组（0 mmol/L NaF组）相比，1、2、4 mmol/L NaF组GC-1 spg细胞活力降低，差异有统计学意义（P<0.001），0.25和0.5 mmol/L NaF组差异无统计学意义（P>0.05，见图1）。
图1CCK-8检测不同浓度NaF对GC-1 spg细胞活力的影响
2.2 样本相关性和主成分分析
样本相关性分析结果显示，对照组与氟暴露组的组内样本相关性显著高于组间，差异有统计学意义（2A）；主成分分析（PCA）表明，对照组与氟处理组间存在明显区分（图2B）。表明氟暴露可显著改变GC-1 spg细胞的基因表达谱，且两组内样本聚类紧密，重复性良好，提示组内变异处于可接受范围。
图2对照组与NaF处理组的样本相关性热图（A）和PCA评分图（B）
2.3 氟暴露相关DEGs筛选
对氟暴露组和对照组的转录组测序结果进行差异对比分析，共筛选出1393个DEGs，其中下调基因926个，上调基因467个（图3）。
2.4 氟暴露相关DEGs的GO富集分析
GO功能富集分析分别从生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三大类中挑选了富集最显著的20个GO功能，结果显示，DEGs主要富集在MAPK信号通路活性调节、内皮细胞迁移调节和蛋白质磷酸化调节等生物过程（图4A），细胞外基质、细胞质和细胞外区域等细胞组分（图4B），以及蛋白质磷酸酶活性、转移酶活性和生长因子活性等分子功能（图4C）。
图3对照组与NaF处理组DEGs的热图和火山图
图4氟暴露相关DEGs的GO功能富集分析气泡图
2.5 氟暴露相关DEGs的KEGG富集分析
KEGG富集分析显示，这些DEGs参与多种生物过程，主要包括：细胞色素P450对药物的代谢通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞色素P450对外源物质的代谢通路、谷胱甘肽代谢通路、FoxO信号通路、肿瘤通路和JAK-STAT信号通路等，取KEGG前20个条目绘制气泡图见图5。
图5氟暴露相关 DEGs的 KEGG通路富集分析气泡图
2.6 蛋白相互作用网络和核心基因的筛选
在PPI网络图中共有624个节点和968条边（图6），筛选出5个核心基因，氟暴露组上调的核心基因分别为白细胞介素6（IL-6）、干扰素诱导的四肽重复蛋白1（IFIT1）和C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10），下调的核心基因为表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）（图7）。
图6氟暴露相关DEGs的网络互作图
2.7 核心基因的表达验证
RT-qPCR结果显示，与对照组相比，氟暴露组GC-1 spg细胞的IL-6、IFIT1和CXCL10基因表达水平显著升高，EGF和FGF2基因表达水平显著降低（P<0.05），见图8。
3 讨论
本研究发现氟化物可显著降低GC-1 spg细胞的活力。参考前期研究发现1、2、4 mmol/L NaF处理小鼠睾丸间质细胞TM3 24 h后细胞活力降低的结果，本研究设置0.25、0.5、1、2和4 mmol/L NaF浓度梯度处理GC-1 spg细胞24 h[4]。CCK-8检测结果显示，0.25和0.5 mmol/L NaF对细胞无显著毒性；1、2和4 mmol/L NaF可使细胞增殖率降至70%以下，且呈剂量依赖关系，与TM3细胞研究结果一致。鉴于建立细胞模型时，通常选择产生35%±5%细胞毒性的毒物暴露浓度，过高毒性易引发遗传物质损伤并干扰毒性效应评估[5]。因此，本研究选取1 mmol/L NaF构建GC-1 spg氟暴露细胞模型，用于后续转录组学样本制备及生物信息学分析，以解析氟暴露致生殖细胞毒性的分子机制。
图7氟暴露相关核心基因的筛选与分析
图8RT-qPCR检测GC-1 spg细胞中氟暴露相关核心基因的表达
本研究以遗传背景清晰、生物学重复性高的小鼠精原细胞GC-1 spg为模型，每组设置3个生物学重复。通过样本相关性分析与PCA分析评估组内重复性，结果显示对照组和氟处理组的组内样本相关性均＞0.99，且组内相关系数高于组间；PCA分析表明组内样本聚类紧密，验证了良好的组内重复性。参考同类研究设计，如探究番茄红素对邻苯二甲酸酯诱导生精障碍作用的研究，以小鼠睾丸组织和TM4细胞为样本，每组设置3个生物学重复，明确了Cx43作为男性生育潜在靶点的作用[6]。另一项以GC-1 spg细胞为模型，研究硫酸铜对小鼠精原细胞代谢通路影响的实验，同样采用每组3个生物学重复的设计，成功揭示铜暴露相关生物标志物[7]。综合实验数据与文献依据，本研究中每组3个生物学重复的设置合理可行，能够有效支撑氟暴露致生殖细胞毒性的分子机制探究。
本研究运用转录组学技术，系统分析氟暴露对生精细胞基因表达及信号通路的影响。研究共鉴定出1393个DEGs，其中926个基因表达下调，467个基因表达上调。KEGG富集分析显示，这些DEGs主要富集于PI3K-Akt和HIF-1信号通路，该通路与细胞增殖、凋亡、自噬、铁死亡、糖酵解及氧化应激等过程密切相关，揭示了氟影响生殖功能的潜在机制。已有研究表明，氟化物可通过降低mTOR和4EBP1磷酸化水平抑制PI3K-Akt通路，促进睾丸和原代间质细胞自噬[8]。在ICR小鼠中，氟暴露引发的生殖毒性存在性别差异，PI3K-Akt-mTOR通路参与其中[9]。此外，PI3K-Akt信号通路还与氟化物所致的骨损伤、心脏毒性和神经毒性相关[10-12]。HIF-1作为应对缺氧的关键转录因子，在精子发生过程中起重要作用。研究显示，HIF-1敲除的雄性小鼠抗氧化能力下降，精子发生受损[13]；HIF-1可调控支持细胞有氧糖酵解，并通过调节羟基-δ-5-类固醇脱氢酶、3β-和类固醇δ-异构酶1（Hsd3b1）转录影响雄性生殖功能[14-16]。此外，NaF可通过下调HIF-1α诱导软骨细胞凋亡，HIF-1信号通路与氟斑牙形成相关[17-18]。本研究发现，氟化物诱导的生精细胞损伤同样与HIF-1信号通路密切相关。本研究结果为深入理解氟暴露的生物学效应提供了新见解，也为氟相关疾病治疗策略的开发提供了理论依据。
本研究采用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化分析，联合CytoHubba插件的Degree、BottleNeck、MCC算法筛选节点中心度前50位基因，并通过MCODE插件获取PPI网络中得分最高的13个子网络基因。经四组结果取交集，最终确定5个核心基因，并通过RT-qPCR实验验证其表达变化。结果显示，上调基因包括IL-6、IFIT1和CXCL10，下调基因包括EGF和FGF2，这些基因广泛参与HIF-1、PI3K-Akt、FoxO、肿瘤及JAK-STAT等关键信号通路。在雄性生殖系统中，IL-6作为多功能细胞因子，其水平升高可通过抑制睾酮合成的负反馈机制、诱发炎症反应，进而干扰生殖细胞发育并降低生育能力[19-20]。IFIT1作为干扰素诱导基因，其过表达与细胞程序性死亡和炎症反应相关，可促进精子发育过程中的细胞凋亡，影响精子成熟与活力[21]。CXCL10作为重要趋化因子，其上调可破坏生殖系统微环境稳态，通过加剧炎症反应损害精细胞功能[22]。此外，EGF和FGF2的下调同样对雄性生殖产生负面影响：前者作为细胞增殖与分化的关键调控因子，其表达降低可导致生殖细胞发育异常[23]。后者在精子发生多阶段发挥重要作用，其表达缺失将削弱生殖系统功能，进一步加剧生育能力下降[24-26]。本研究证实，氟暴露通过上调炎症相关基因、下调生殖发育关键基因，对雄性生殖健康产生显著不良影响。后续研究需进一步明确这些核心基因在生殖系统中的具体调控机制，为改善雄性生殖健康提供潜在干预靶点。值得注意的是，本研究筛选的核心基因数量有限，未能全面覆盖氟暴露影响的所有信号通路，可能存在其他潜在关键基因的遗漏，此为本研究的局限性所在。
综上所述，氟暴露可导致小鼠精原细胞GC-1 spg的活力损伤及大量基因的差异表达，这些基因参与多种生物学进程和信号通路调节，影响细胞的存活、增殖、凋亡、应激反应和炎症反应等过程。IL-6、IFIT1、CXCL10、EGF和FGF2为氟暴露所致生殖损伤的核心基因。