摘要
目的：探究叉头框蛋白A3（FOXA3）在食管鳞癌中对Hippo/YAP信号通路的影响及其机制。方法：选择食管癌细胞系ECA109进行培养，通过转染慢病毒构建稳定的FOXA3上调细胞系及FOXA3下调细胞系，ECA109细胞系均分为FOXA3上调组、FOXA3下调组及各自对照组。通过CCK法及平板克隆实验检测各组细胞增殖能力，采用实时荧光定量PCR(qPCR)及Western-blotting检测各组细胞Hippo信号通路中LATS2、YAP1的表达水平。此外，将FOXA3上调、FOXA3下调的ECA109细胞分别注射于裸鼠背部皮下，制备FOXA3上调组及下调组食管鳞癌，接种6周后，剥离肿瘤测量其体积和质量，采用qPCR、Western-blotting及免疫组织化学染色检测FOXA3上调组、FOXA3下调组及对照组肿瘤组织中Hippo信号通路中LATS2、YAP1的表达。结果：在体外实验中，FOXA3上调后的ECA109食管鳞癌细胞较对照组细胞增值缓慢（P<0.05），FOXA3下调后的细胞较对照组细胞增殖速度快（P<0.05）；qPCR及Western-blotting结果均提示，LATS2在FOXA3高表达细胞系中，表达升高（P<0.05），相反在FOXA3低表达细胞系中，表达降低（P<0.05），YAP1在FOXA3高表达细胞系中，表达降低（P<0.05），而在FOXA3低表达细胞系中，表达升高（P<0.05）。在体内实验中，FOXA3上调组肿瘤生长速度、体积以及重量明显小于对照组（P<0.05），相反FOXA3下调后肿瘤生长速度、体积以及重量明显大于对照组（P<0.05）；qPCR、Western-blotting及免疫组织化学结果均提示，LATS2在FOXA3上调组肿瘤组织中，表达显著升高，在FOXA3下调组肿瘤组织中，表达显著降低，而YAP1在FOXA3上调组肿瘤组织中，表达显著降低，在FOXA3下调组肿瘤组织中，表达显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：体内外实验均表明，FOXA3能够抑制食管鳞癌的增殖生长，且这一作用机制可能是通过Hippo/YAP信号通路进行调控。
Abstract
Objective To elucidate the impact and underlying mechanisms of FOXA3 on the Hippo/YAP signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma. Methods The esophageal cancer cell line ECA109 was selected for culture. Stable up-regulated FOXA3 and downregulated FOXA3 groups cell lines were constructed through lentiviral transfection. The ECA109 cell lines were divided into four groups: the up-regulated FOXA3 group, down-regulated FOXA3 group, and their respective control group. Cell growth capability was assessed using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay and colony formation assays. The expression levels of LATS2 and YAP1 in Hippo signaling pathway were evaluated via real-time PCR and Western blotting analysis in each group. Additionally, to establish xenograft models of esophageal squamous cell carcinoma, ECA109 cells with either up-regulated or down-regulated FOXA3 expression were respectively subcutaneously injected into the dorsal region of nude mice. After a 6-week inoculation period, tumors were excised and evaluated for volume and weight. Real-time PCR, Western blotting, and immunohistochemistry were employed to evaluate the expression levels of LATS2 and YAP1 in Hippo signaling pathway in tumor tissues from the FOXA3 up-regulated group, FOXA3 down-regulated group, and control group. Additionally, the expression levels of Hippo signaling pathway-related proteins LATS2 and YAP1 in tumor tissues from the up-regulated FOXA3 group, down-regulated FOXA3 group, and control group were assessed using real-time PCR, Western blotting analysis, and Immunohistochemical staining. Results In vitro experiments demonstrated that the proliferation rate of ECA109 cells with FOXA3 up-regulation was significantly slower compared to that of the control cells (P<0.05). Conversely, the proliferation rate of ECA109 cells with FOXA3 down-regulation was markedly faster than that of the control cells (P<0.05). The results of real-time PCR and Western blotting analysis demonstrated that LATS2 expression was significantly upregulated in cell lines with high FOXA3 expression (P<0.05), whereas it was markedly downregulated in cell lines with low FOXA3 expression (P<0.05). Additionally, YAP1 expression was reduced in cell lines with high FOXA3 expression (P<0.05), while it was increased in cell lines with low FOXA3 expression (P<0.05). In vivo experiments demonstrated that the tumor growth rate, volume, and weight in the FOXA3 up-regulation group were significantly reduced compared to the control group (P<0.05). Conversely, the tumor growth rate, volume, and weight in the FOXA3 down-regulation group were markedly increased relative to the control group (P<0.05). Real-time PCR, Western blotting, and Immunohistochemistry revealed that LATS2 expression was significantly increased in tumor tissues of the FOXA3 up-regulated group and significantly decreased in the FOXA3 down-regulated group. In contrast, YAP1 expression was significantly decreased in the FOXA3 up-regulated group and significantly increased in the FOXA3 down-regulated group. All differences were statistically significant(P<0.05). Additionally, cells in the FOXA3 up-regulated group exhibited a significantly faster proliferation rate compared to the control group and the FOXA3 down-regulated group(P<0.05). Conclusion Both in vivo and in vitro studies have demonstrated that FOXA3 exerts an inhibitory effect on the proliferation and growth of esophageal squamous cell carcinoma, potentially through modulation of the Hippo/YAP signaling pathway.
食管癌是发生于食管上皮黏膜组织的恶性肿瘤，其发病早期的隐匿性、进展期的高度侵袭性、晚期病变的不可逆转性是食管癌高死亡率的主要原因。据2022年发布的中国恶性肿瘤流行病情况分析，食管癌是我国第六大常见肿瘤，同时也是我国第五大致死性肿瘤[1]。食管癌分为食管鳞癌（esophageal squamous carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在我国，大约90%的食管癌为ESCC，多数食管癌被确诊时多已进展至中晚期，丧失了手术机会，因此通过分子水平研究食管癌的发病及转移机制，对预防早期食管癌的发生发展、延长患者的生存期具有重要意义。
FOX家族被称之为叉头框（fork-head box）蛋白，包括FOXA1、FOXA2、FOXA3三个成员，其通过调控能量代谢从而参与许多疾病的发生、发展[2]。多项研究表明，FOXA不同分型通过Hippo-YAP信号通路、EMT途径、调节分泌甲胎蛋白、m6A甲基化修饰等多种途径参与食管癌、胃癌、结肠癌的发生、发展及转移[3-5]。Hippo信号通路是维持组织内稳态、器官大小和再生的重要信号调节通路[6]。其核心组件主要有MST1/MST2激酶、LATS1/LATS2激酶、转录共激活因子YAP/TAZ[7]，作用于下游核心效应因子Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）。Hippo信号通路的失调会导致细胞过度增殖和恶化[8]。目前研究已经证实，Hippo/YAP信号通路与食管癌、胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤发生发展密切相关[9]。本实验通过研究FOXA3对食管鳞癌Hippo信号通路中LATS2及YAP1表达的影响，以期探讨FOXA3影响食管鳞癌发生发展的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
食管癌细胞系ECA109和293T细胞均购自美国ATCC公司，20只雄性裸鼠（BALB/cNude）购自北京维通利华实验动物有限公司，饲养于天津市南开医院SPF级动物房，细胞培养基RPMI-1640、无血清培养基Opti-MEM均购自美国GIBCO公司，实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（RR820A）和逆转录试剂盒（RR037A）均购自日本TaKaRa公司，Trizol试剂、Lipo 3000试剂、Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒均购自Thermo Fisher Scientific公司，兔二步法检测试剂盒（兔增强聚合物法检测系统）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CCK-8试剂盒购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，EasySee® Western Blot Kit购自北京全式金生物技术有限公司，兔抗LATS2多克隆抗体（Ab-DF7516）购自江苏亲科生物有限公司提供，YAP1兔单抗（A19134）由爱博泰克生物有限公司提供。本研究通过我院医学伦理委员会审查（批号：NKYY-DWLL-2023-036）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
用含10%胎牛血清和1%青/链霉素的RPMI-1640培养基培养ECA109细胞，送至37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞密度达到80%~90%时，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶消化，镜下观察所有细胞完全皱缩变圆后，终止胰酶消化，离心，弃上清液，吸取10 μL进行计数，按照2×106/皿接种，继续在5%CO2、37℃培养箱培养。取对数生长期细胞进行下一步实验。
1.2.2 慢病毒转染、细胞干扰
转染前1天，将贴壁的293T细胞以1.5×106/孔铺到6孔板中，分别配制试剂A（Opti-MEM+Lipo 3000）、试剂B（FOXA3质粒+载体+Opti-MEM+P3000），将A+B试剂轻轻混匀，滴加至293T细胞培养基液面上，64 h后收集病毒上清液，向贴壁ECA109中加入含有8 μg/mL聚凝胺、1 mL慢病毒，培养64 h后，加入嘌呤霉素进行筛选，并逐渐提高筛选浓度。最终形成MCS、FOXA3+、NC、FOXA3-sh1、FOXA3-sh2、FOXA3-sh3共6种稳定细胞系，经PCR鉴定，ECA109细胞稳定高表达与低表达FOXA3细胞系建立成功。
1.2.3 CCK-8检测FOXA3对食管鳞癌细胞增殖的影响
取对数生长期的ECA109-FOXA3+、ECA109-FOXA3-sh2细胞系及相应对照组细胞系铺板，于37℃、5%CO2的孵育箱中培养，在细胞接种的0、24、48、72和96 h，向每个孔中加入CCK-8液10 μL，使用微板分光光度计在450 nm波长下测定其光密度（A450）值，采用GraphPad Prism 8.0软件计算ECA109的相对增殖能力，并制作细胞增殖曲线。
1.2.4 平板克隆实验检测食管鳞癌细胞克隆形成情况
培养好的ECA109细胞铺板，培养2周，PBS洗涤，多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗涤后结晶紫染色。显微镜下观察ECA109细胞克隆形成集落量，并拍照记录。
1.2.5 裸鼠食管鳞癌皮下成瘤
健康雄性BALB/c Nude裸鼠20只，体质量19~22g适应性喂养1周后，随机分为FOXA3高表达组（FOXA3+），对照组（MCS），FOXA3低表达组（FOXA3-），对照组（NC），每组5只，每组以每只裸鼠1×107个/mL密度分别皮下注射ECA109-FOXA3+、ECA109-MCS、ECA109-FOXA3sh2、ECA109-NC稳定细胞系，定期观察各组裸鼠的精神、饮食等一般情况，隔天测量裸鼠重量及其肿瘤大小，根据公式肿瘤体积=长径×短径2/2，待肿瘤大小约为1000 mm3，采用拉颈法统一处死小鼠，按分组排列好动物，取材、拍照，肿瘤组织-80℃保存，进行后续实验检测。
1.2.6 实时荧光定量PCR（qPCR）检测mRNA表达水平
提取培养好的食管癌ECA109细胞系（MCS、FOXA3+、NC、FOXA3-sh2）及各组小鼠新鲜组织的总RNA，逆转录为cDNA，采用qPCR测定LATS2、YAP1的mRNA相对表达量，转录及检测过程严格按照逆转录试剂盒和qPCR试剂盒说明书操作。主要引物序列：LATS2上游：5’-GTTCTTCATGGAGCAGCACGTG-3’，LATS2下游：5’-CTGGTAGAGGATCTTCCGCATC-3’，YAP1上游：5’-TGTCCCAGATGA ACGTCACAGC-3’，YAP1下游：5’-TGGTGGCTGTTTCACTGGAGCA-3’，FOXA3上游：5’-CTCGCTGTCTTTCAACGACTGC-3’，FOXA3下游：5’-CGCAGGTAGCAGCCATTCTCAA-3’，以GAPDH为内参基因，按2-ΔΔCt法计算上述细胞系及小鼠肿瘤组织中LATS2、YAP1的mRNA相对表达量。
1.2.7 Western-blotting检测蛋白表达水平
取各组培养好的食管癌细胞系及各组小鼠新鲜组织，加入裂解液，提取蛋白，严格按照BCA定量试剂盒说明书进行操作测定蛋白含量，在570 nm处比色检测吸光值，使用Excel按照说明书要求进行标准曲线拟合，按照公式计算各样品孔蛋白浓度C样品，使用十烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，110 V转膜1 h后封闭30 min，将封闭好的PVDF膜使用标记好目的蛋白的抗体盒进行LATS2一抗、YAP1一抗孵育，2~8℃孵育过夜，Tris缓冲液冲洗，加入LATS2一抗、YAP1一抗对应的二抗反应物种进行室温摇床孵育1.5 h，TBST冲洗4次，按照ECL发光试剂盒要求配制足量曝光液，曝光仪曝光拍摄图片并记录相应蛋白条带灰度值。
1.2.8 免疫组织化学染色
取各组小鼠新鲜组织，多聚甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，处理组织切片（5 μm），石蜡切片脱蜡至水，放入加热至沸腾的柠檬酸钠抗原修复液（pH=6.4）中进行抗原修复，PBS清洗浸泡3次，阻断内源性过氧化物酶后，用PBS配制的5%山羊血清封闭组织1 h，在组织表面滴加稀释好的抗YAP1、抗LATS2（一抗）至完全覆盖组织表面，4℃冰箱孵育过夜，加辣根酶标记的山羊抗兔IgG（二抗），室温孵育30 min，加HRP-生物素偶联的三抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木复染，脱水，中性树胶封片。使用Image J软件分析每组肿瘤组织中表达LATS2、YAP1的平均光密度值。
1.2.9 统计学方法
应用SPSS 26.0软件、GraphPad Prism 8.0.2进行统计分析。实验数据结果以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验和非参数检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 FOXA3 mRNA在食管癌细胞系ECA109中的表达
在FOXA3高表达的食管癌细胞系中，FOXA3+组的FOXA3 mRNA相对表达量显著高于对照组（P<0.001）；在FOXA3低表达的细胞系中，FOXA3-sh2 mRNA的相对表达量相较于FOXA3-sh1及FOXA3-sh3显著低于对照组（P<0.01），因此FOXA3下调组选用FOXA3-sh2组细胞系进行后续的细胞和动物实验，见图1。
图1FOXA3 mRNA在FOXA3上调组与下调组细胞系的表达情况
2.2 FOXA3对食管鳞癌细胞增殖的影响
CCK-8结果显示，转染24 h，FOXA3+组和FOXA3-组与对照组A450值比较，差异无统计学意义（P>0.05），转染48 h、72 h、96 h，FOXA3+组的A450值低于对照组，FOXA3-组的A450值高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。细胞克隆实验形成实验结果显示，FOXA3+组克隆增殖速度较对照组缓慢，FOXA3-组克隆增殖速度较对照组增快，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。
图2FOXA3上调组与下调组的细胞增殖情况
图3FOXA3上调组与下调组细胞克隆形成实验结果
2.3 FOXA3低表达和FOXA3高表达对食管癌细胞Hippo/YAP信号通路的影响
在FOXA3+细胞系中，LATS2 mRNA表达高于对照组，YAP1 mRNA表达低于对照组（P<0.05）；在FOXA3-细胞系中，LATS2 mRNA表达低于对照组，YAP1 mRNA表达高于对照组（P<0.05），见图4。Western-blotting结果显示，LATS2相关蛋白在FOXA3+细胞系中较对照组表达升高，在FOXA3-细胞系中较对照组表达降低（P<0.05），YAP1在FOXA3+细胞系中较对照组表达降低，在FOXA3-细胞系中较对照组表达升高（P<0.05），见图5。同时对裸鼠肿瘤组织进行qPCR和Western-blotting检测结果显示，LATS2在FOXA3+组肿瘤组织中表达升高，在FOXA3-组肿瘤组织中表达降低（P<0.05）；YAP1在FOXA3+组肿瘤组织中表达降低，在FOXA3-组肿瘤组织中表达升高（P<0.05），见图6、7。
2.4 免疫组织化学方法检测裸鼠肿瘤组织中LATS、YAP1的表达水平
肿瘤组织显色清晰，在FOXA3+组中，LATS2的表达水平显著高于对照组，YAP1的表达水平显著低于对照组（P<0.05）；在FOXA3-组中，LATS2的表达水平明显低于对照组，YAP1的表达水平明显高于对照组（P<0.05），见图8。
图4qPCR检测食管癌细胞系中Hippo信号通路LATS2 mRNA和YAP1 mRNA的表达情况
图5Western-blotting检测食管癌细胞系中Hippo信号通路相关蛋白LATS2、YAP1的表达
图6qPCR检测裸鼠肿瘤组织中Hippo信号通路LATS2 mRNA和YAP1 mRNA的表达
图7Western-blotting检测裸鼠肿瘤组织中LATS2、YAP1相关蛋白的表达水平
图8LATS2、YAP1在裸鼠肿瘤组织中的免疫组化结果
2.5 FOXA对裸鼠食管肿瘤生长的影响
四组裸鼠在喂养过程中，精神、饮食及一般情况正常，体质量均无统计学差异（P>0.05），见图9；FOXA3+组较对照组肿瘤生长缓慢，FOXA3-组较对照组肿瘤生长较快（P<0.05），见图10；FOXA3+组肿瘤体积明显小于对照组，FOXA3-组肿瘤体积明显大于对照组（P<0.05），见图11；FOXA3+组肿瘤重量明显大于对照组（P<0.05），FOXA3-组肿瘤重量较对照组小（P<0.05），见图12。
图9FOXA3各组裸鼠体质量变化
图10FOXA3各组裸鼠肿瘤生长速度变化
图11FOXA3各组裸鼠肿瘤体积变化
图12FOXA3各组裸鼠肿瘤质量比较
3 讨论
近年来，恶性肿瘤分子靶向和免疫治疗研究因其迅猛发展取得了良好效果，但食管鳞癌的分子靶向及免疫治疗相对于其他恶性肿瘤仍是十分有限的，因此深入研究食管癌的分子层面的发病机制、寻找与之临床进展相关的生物学标志并作为食管癌的治疗靶点的意义尤为重要。
FOXA3在恶性肿瘤中作用的研究越来越受到重视。FOXA3在肝癌、食管癌、结肠癌等消化道恶性癌症的发生、发展中均起到一定作用[10-11]。研究表明FOXA3在食管鳞癌中低表达，且FOXA3低表达与淋巴结转移密切相关，FOXA3越低患者的生存时间越短[12]。本实验结果显示，FOXA3上调后，食管鳞癌细胞的增殖速度较对照组显著减低，食管鳞癌肿瘤组织的生长速度及肿瘤重量体积明显低于对照组；而FOXA3下调后的食管鳞癌细胞较对照组增殖速度明显增快，食管鳞癌肿瘤组织的生长速度及肿瘤重量体积也明显低于对照组。以上均显示通过上调FOXA3可以有效抑制食管鳞癌细胞的增殖，抑制肿瘤组织发生发展，而FOXA3表达被抑制后可促进食管鳞癌的发生和转移，提示预后不良。但另有研究显示，FOXA3在食管癌和Barrett食管组织中都升高，其上调与肿瘤侵袭和晚期TNM分期显著相关，FOXA3下调能显著抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力[6]。提示FOXA3可能通过不同机制在食管癌的发生、发展中起促癌和抑癌的双重作用。由此可见，FOXA3参与了食管癌的发生、发展，并对食管癌患者的预后有一定影响。
本研究还发现，无论从分子水平还是组织学上，上调FOXA3后，LATS2的mRNA及蛋白表达水平均较对照组显著升高，YAP的mRNA及蛋白表达水平较对照组显著减低；下调FOXA3后，LATS2的mRNA及蛋白表达受抑制，YAP的mRNA及蛋白过表达。目前已被证实，Lats及YAP是Hippo信号通路的核心组成成分，而Hippo信号通路在哺乳动物中对于保持组织器官的大小和肿瘤发生发展有重要意义[13]。病理状态下Hippo/YAP信号通路被抑制，Lats表达下调，导致YAP过度表达，破坏细胞增殖与凋亡平衡，造成组织器官过度生长及肿瘤发生发展。与正常组织相比，YAP在恶性肿瘤组织中的表达增高，并且其高表达与肿瘤的发生、发展、低分化及不良预后有一定的相关性[14]。因此，Lats为抑癌基因，而YAP则是一个癌基因。有研究表明，在食管鳞癌组织中Lats表达下调，YAP在食管不典型增生及鳞癌组织中的阳性表达率逐渐升高且均显著高于正常食管黏膜组织，且YAP高表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、pTNM分期明显相关。提示食管黏膜反复慢性炎症引起Hippo信号通路失调，导致肿瘤发生发展及转移[15-16]，这与本研究结果一致。下调FOXA3后，Hippo信号通路中LATS2表达受阻，解除了对YAP的抑制作用，YAP 过表达，打破食管鳞癌细胞增殖与凋亡平衡，造成肿瘤细胞过度增殖及肿瘤的发生发展。
综上所述，FOXA3能够显著抑制食管鳞癌的增殖生长，且这一作用机制可能是通过Hippo/YAP信号通路调控肿瘤细胞的增生与凋亡，从而参与食管鳞癌的发生发展。FOXA3对于预测食管鳞癌预后的意义可进行深入探究，这或许将成为食管鳞癌早期预防和治疗的新靶点。
