摘要
目的：探究线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）抑制剂对紫杉醇耐药的三阴性乳腺癌细胞衰老的影响。方法：构建对盐酸多柔比星（DOX）耐药的三阴性乳腺癌细胞株（MDA-MB-231/DOX）。通过CCK-8检测不同浓度（0.05、0.1和0.2 μmol/L）和不同时间（24 h、48 h和72 h）OXPHOS抑制剂处理对MDA-MB-231/DOX细胞活力的影响。分别给予0.1 μmol/L OXPHOS抑制剂IACS-010759或者等量的二甲基亚砜（DMSO）处理48 h，分别记作MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组和MDA-MB-231/DOX组。通过线粒体压力测定比较两组细胞的线粒体呼吸能力，通过流式细胞术比较两组细胞周期的变化，通过蛋白质印迹比较两组细胞p53、p21、p16、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（PGC-1α）及线粒体动力相关蛋白1（Drp1）蛋白表达的变化。结果:与MDA-MB-231/DOX细胞相比，MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组细胞的最大呼吸能力、备用呼吸能力及ATP合成能力均显著减弱，质子漏升高（P<0.001）。与MDA-MB-231/DOX细胞相比，细胞周期检测结果发现MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组G0/G1期细胞比例显著升高（P<0.001），S期和G2/M期细胞比例显著降低（P<0.05），并且伴随着p53、p21和p16蛋白表达上调（P<0.001）。并且，与MDA-MB-231/DOX细胞相比，MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组细胞的PGC1-α和Drp1表达显著降低（P<0.001）。结论:OXPHOS抑制剂能够降低MDA-MB-231/DOX细胞对紫杉醇的耐药性，诱导细胞衰老，可能与PGC-1α/Drp1信号通路抑制有关。
关键词
Abstract
Objective To investigate the effect of mitochondrial oxidative phosphorylation inhibitors on senescence of paclitaxel-resistant triple-negative breast cancer cells. Methods The triple-negative breast cancer cells MDA-MB-231 resistant to doxorubicin hydrochloride (DOX) MDA-MB-231/DOX were constructed. Thereafter, different concentrations (0.05, 0.1 and 0.2) of OXPHOS inhibitor) and different treatment time (24 h, 48 h and 72 h) on the viability of MDA-MB-231/DOX cells were detected by CCK-8 μmol/L. Mitochondrial respiration capacity of the two groups was compared by mitochondrial pressure measurement, and cell cycle changes were compared by Flow Cytometry. The expression of p53, p21, p16, peroxisome proliferator-activated receptor γ-coactivation factor 1α (PGC-1α) and mitochondrial dynamic-associated protein-1 (Drp1) in the two groups were compared by western blot. Results Compared with MDA-MB-231/DOX cells, the maximum respiratory capacity, spare respiratory capacity and ATP synthesis capacity of MDA-MB-231/DOX+OXPHOS inhibitor cells were significantly decreased (P<0.01), and proton leakage was increased (P<0.001). Compared with MDA-MB-231/DOX cells, the cell cycle detection results showed that the proportion of G0/G1 phase cells in MDA-MB-231/DOX+OXPHOS inhibitor group was significantly increased (P<0.001), and the proportion of S phase cells and G2/M phase cells was significantly decreased (P<0.05). It was accompanied by up-regulation of p53, p21 and p16 proteins (P<0.001). Furthermore, compared with MDA-MB-231/DOX cells, PGC1-α and Drp1 expressions in MDA-MB-231/DOX+OXPHOS inhibitor groups were significantly decreased (P<0.001). Conclusion OXPHOS inhibitors can reduce paclitaxel resistance in MDA-MB-231/DOX cells and induce cell senescence, which may be related to the inhibition of PGC-1α/Drp1 signaling pathway.
乳腺癌是全球发病率最高的女性肿瘤，三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）占乳腺癌总体的10%~20%，是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，其特征是复发率和死亡率均较高[1]。盐酸多柔比星（doxorubicin hydrochloride，DOX）是临床乳腺癌化疗的一线药物，可在一定程度上降低TNBC的复发风险和死亡率，但长期使用化疗药物可使乳腺癌细胞产生耐药，甚至对不同机制的其他化疗药物不敏感，大大降低了疗效[2]。近期大量研究表明线粒体氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）是肿瘤细胞供能的主要来源，因此OXPHOS成为抗肿瘤治疗的新靶点[3]。但是OXPHOS抑制剂在乳腺癌细胞产生耐药细胞中的作用暂不明确。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（peroxisome proliferators-activated receptors gamma co-activator 1α，PGC-1α）和线粒体动力相关蛋白1（dynamic-related protein 1，Drp1）是调节多种代谢途径的蛋白，参与调控线粒体的合成及功能。但是，其在乳腺癌耐药过程中的表达情况暂不明确。本研究通过建立对DOX耐药的乳腺癌细胞株MDA-MB-231/DOX，探究OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞紫杉醇的耐药性和细胞衰老的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
MDA-MB-231细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。盐酸多柔比星（DOX）及OXPHOS抑制剂IACS-010759（美国MedChemExpress公司）；紫杉醇（规格: 20 mg；上海中药标准化研究中心）；DMEM培养液高糖培养基（美国Thermo Fisher Scientific公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；XF RPMI培养液（美国Agilent Seahorse公司）；CCK-8试剂盒、ECL发光试剂盒、裂解液及核糖核酸酶/碘化丙啶（RNase/PI）染色缓冲液（北京碧云天生物技术公司）；一抗：p53、p21、p16、PGC-1α、Drp1抗体和二抗：HRP标记山羊抗鼠 IgG（H + L）抗体（英国Abcam）；iBright蛋白凝胶成像系统（美国赛默飞世尔公司）；Amnis FlowSight流式细胞仪（美国Merck公司）；Seahorse XF HS Mini 能量代谢分析仪（美国Agilent公司）。
1.2 细胞培养及处理
取人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231，用含有10% 胎牛血清（FBS）的DMEM培养液，于37℃、5%CO2的培养箱进行培养。三阴性乳腺癌采用低浓度加量持续诱导法构建DOX耐药细胞三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231/DOX，具体方法如下：取MDA-MB-231细胞，用含有30 μg/L DOX的DMEM培养液培养，直至MDA-MB-231细胞在含30 μg/L DOX的培养基中能够正常生长、传代后，按照上述方法继续诱导，并逐渐提高培养基中DOX浓度，最终确保MDA-MB-231能在含有320 μg/L DOX的DMEM培养基中能够正常生长[2]。
取对数生长期的MDA-MB-231/DOX细胞，以2×104个/孔接种于细胞培养板中，待其融合度达到70%时，分别给予0.1 μmol/L OXPHOS抑制剂IACS-010759或者等量的二甲基亚砜（DMSO）处理48 h，分别记作MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂和MDA-MB-231/DOX组。
1.3 细胞活力检测
将MDA-MB-231/DOX细胞在含有0.05、0.1和0.2 μmol/L OXPHOS抑制剂IACS-010759的培养基中培养24、48和72 h，以0 μmol/L OXPHOS抑制剂为对照组。加入10 µL CCK-8溶液，用酶标仪测量各组细胞在450 nm处的吸光度。MDA-MB-231/DOX细胞添加OXPHOS抑制剂或等量的DMSO后，添加68 mg/L紫杉醇，48 h后，采用CCK-8试剂盒评估各组细胞活力。
1.4 线粒体压力测定
处理48 h后，各组细胞中加入200 μL XF RPMI培养液，清洗后加入XF RPMI培养液，放于37℃无CO2培养箱中静置1 h，随后上机检测。
1.5 细胞周期检测
处理48 h后，各组细胞加入RNase/PI染色工作液，采用流式细胞仪检测各组细胞在G1、S、G2期的含量。
1.6 蛋白表达检测
处理48 h后，收集各组细胞，用RIPA裂解液提取蛋白。等量的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后加入一抗于4℃孵育过夜，次日再加入二抗，室温孵育2 h，而后加入ECL荧光剂显影，分析条每组细胞蛋白条带的灰度值。
1.7 统计学分析
采用Graphpad 8.0软件进行统计分析，实验数据以均值±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 OXPHOS抑制剂的处理时间和处理浓度对MDA-MB-231/DOX细胞活力的影响
与对照组（0 μmol/L OXPHOS抑制剂）比较，MDA-MB-231/DOX细胞给予不同浓度的OXPHOS抑制剂处理24、48和72 h后，细胞存活率呈剂量和时间相关性地降低。0.1 μmol/L OXPHOS抑制剂处理48 h 后，与处理24 h与72 h相比，细胞存活率无显著性变化，因此选择 0.1 μmol/L处理48 h作为OXPHOS抑制剂的最佳处理浓度和处理时间，见图1。
图1OXPHOS抑制剂的处理时间和处理浓度对MDA-MB-231/DOX细胞活力的影响
2.2 OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞的线粒体氧化磷酸化功能的影响
与MDA-MB-231/DOX组细胞相比，MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组细胞的最大呼吸能力、备用呼吸能力及ATP合成能力均显著减弱，质子漏升高（P<0.001），见图2。
图2OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞的线粒体氧化磷酸化功能的影响
2.3 OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞紫杉醇耐药性的影响
经68 mg/L紫杉醇处理后，与MDA-MB-231/DOX组细胞相比，MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组细胞的活力显著下降（P<0.01）。
图3OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞紫杉醇耐药性的影响
2.4 OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞周期的影响
与MDA-MB-231/DOX组相比，MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组G0/G1期细胞比例显著升高，S期和G2/M期细胞比例显著降低（P<0.05），见图4。
图4OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞周期的影响
2.5 OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞衰老相关蛋白的影响
与MDA-MB-231/DOX组相比，MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组细胞内p53、p21及p16蛋白表达显著升高（P<0.001），见图5。
2.6 OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞PGC1-α/Drp1蛋白表达的影响
与MDA-MB-231/DOX组相比，MDA-MB-231/DOX+OXPHOS抑制剂组细胞内PGC1-α和Drp1蛋白表达显著降低（P<0.001），见图6。
3 讨论
有研究通过分析来自原位患者源异种移植模型和TNBC女性活检的一系列前后肿瘤样本，发现接受DOX一线治疗的残留肿瘤相对于首次治疗的肿瘤具有更高的OXPHOS[4]。OXPHOS代谢途径能够提供生物能量和指导大分子合成，被认为是肿瘤细胞为满足能量需求实现增殖和生存的主要代谢方式[5]。相关研究发现，抑制糖酵解，促进氧化磷酸化，能够有效地抑制肿瘤细胞增殖[6]。本研究发现，在未给予OXPHOS抑制剂刺激时，MDA-MB-231细胞的最大呼吸能力、备用呼吸能力、ATP合成能力和质子漏处于正常水平；而给予OXPHOS抑制剂刺激后，最大呼吸能力、备用呼吸能力、ATP合成能力均显著减弱，而质子漏水平增强，表明OXPHOS抑制剂确实能抑制MDA-MB-231细胞的线粒体氧化磷酸化能力。
图5OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞衰老相关蛋白的影响
图6OXPHOS抑制剂对MDA-MB-231/DOX细胞PGC1-α/Drp1蛋白表达的影响
OXPHOS被认为是维持癌细胞化学抗性和持续增殖的主要方式[7]。有相关研究表明，OXPHOS上调是引起维奈克拉治疗急性髓系白血病耐药的核心，其作用机制是烟酰胺代谢的上调改变提高了整体代谢水平，驱动OXPHOS，克服维奈克拉阿扎胞苷引起的OXPHOS抑制，维持肿瘤细胞生存，导致耐药[8]。本研究发现，在给予等量的紫杉醇共同孵育后，与MDA-MB-231/DOX组细胞相比，MDA-MB-231/DOX组细胞活力显著降低，表明OXPHOS抑制剂能够降低MDA-MB-231/DOX组细胞对紫杉醇的耐药性。究其原因，可能是由于OXPHOS抑制剂能够克服DOX和紫杉醇引发的代谢异常和相关通路调控的OXPHOS激活，抑制肿瘤生存，从而降低其对紫杉醇的耐药性。机制上，相关研究发现OXPHOS能生成细胞能量三磷酸腺苷（ATP）并调控细胞凋亡[9]。本研究发现，OXPHOS抑制剂能够提高MDA-MB-231/DOX细胞中G0/G1期细胞比例，降低S期G2/期细胞比例。并且，OXPHOS抑制剂能上调MDA-MB-231/DOX细胞中p16、p21、p53蛋白表达。由于衰老细胞的特征是细胞周期阻滞，并伴随着p16、p21、p53 蛋白标记增加[10]。基于本研究结果，可以推测OXPHOS抑制剂降低MDA-MB-231/DOX细胞对紫杉醇的耐药性可能是通过促进细胞衰老引发的。
研究发现，OXPHOS损伤可以帮助控制卵巢癌的进展，在卵巢癌小鼠成瘤实验中，PGC1-α高表达促进三羧酸循环，提高细胞呼吸，最终增强OXPHOS；而OXPHOS抑制剂IACS-010759可引起ATP耗损，从而缓解PGC1-α高表达小鼠的恶性进展，延长了其寿命[11]。PGC-1α能够与p53协同激活细胞周期抑制因子的转录，并促进线粒体生物合成相关基因的表达。在PGC-1α敲除的细胞中氧化应激会导致p53诱导的凋亡产生[12]。而是Drp1蛋白参与线粒体分裂调控的关键蛋白，被证实在肝癌中表达显著上调并促进了肿瘤细胞的增殖与转移[13]。本研究发现，OXPHOS抑制剂能够显著降低MDA-MB-231/DOX细胞中PGC1-α和Drp1蛋白的表达。因此，OXPHOS抑制剂诱导MDA-MB-231/DOX细胞衰老可能和PGC-1α/Drp1信号通路抑制相关。尽管如此，本研究依旧存在一定局限性：首先，缺乏动物实验数据的支持；其次，缺乏临床数据对于本研究结果的验证。
综上所述，本研究发现OXPHOS抑制剂能够降低MDA-MB-231/DOX细胞对紫杉醇的耐药性，诱导细胞衰老，可能与PGC-1α/Drp1信号通路抑制有关。