摘要
目的：基于Keap1-Nrf2-ARE通路探讨点按足三里穴对脾气虚大鼠Cajal间质细胞（ICC）影响及分子学机制。方法：将40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、点穴组、抑制剂组，每组10只，后两组点按足三里穴干预，模型组和空白组只给予相同的方式固定，共治疗2周，观察各组大鼠胃窦组织HE染色、免疫荧光染色，并检测胞浆蛋白（Keap1）、核因子E2相关因子（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）、跨膜蛋白16A（ANO1）、Nrf2蛋白和mRNA表达量，小腿肌肉组织中机械生长因子（MGF）蛋白和mRNA表达量，以及电镜ICC超微结构。结果：空白组比较，模型组HE染色损伤水肿明显，ANO1蛋白和mRNA表达升高，Keap1、Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达降低（P<0.01），MGF蛋白和mRNA表达无统计学差异（P>0.05），ICC细胞数量减少，形态出现破坏；与模型组比较，点穴组HE染色炎症水肿较轻，ANO1蛋白和mRNA表达降低（P<0.01），Keap1、Nrf2、HO-1、MGF蛋白和mRNA表达上调，电镜ICC数量较多，形态破坏较轻；与点穴组比较，抑制剂组HE染色组织损伤水肿显著，ANO1蛋白和mRNA表达较高，Keap1、Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达较低，MGF蛋白表达无变化（P>0.05），电镜下ICC细胞较少，形态破坏严重。结论：点按足三里穴可在一定程度上改善脾气虚大鼠胃窦组织病理形态，恢复其受损的ICC细胞超微结构；通过激活MGF及上调Nrf2通路诱导ICC细胞增殖修复可能是点按足三里穴调整脾气虚大鼠消化功能的机制。
关键词
Abstract
Objective To explore the effects of acupressure at the Zusanli point (ST36) on interstitial cells of Cajal (ICC) in spleen-deficient rats and its molecular mechanisms via the Keap1-Nrf2-ARE pathway. Methods 40 SD rats were randomly divided into control group, model group, acupoint group and inhibitor group, with 10 rats in each group. The latter two groups received acupoint intervention for a total of two weeks, while the model and control group were merely fixated in the same way without any treatment. Gastric antrum tissues were analyzed by HE staining and immunofluorescence. The levels of cytoplasmic proteins (Keap1), HO-1, ANO1, and Nrf2 protein and mRNA expression were measured. The expression of mechano growth factor (MGF) in the lower legs muscle tissues was also assessed. Finally, ICC ultrastructure was observed using electron microscopy. Results Compared with the control group, the model group exhibited significant damage and edema in HE staining, with ANO1 protein and mRNA increased expression (P<0.01) and decreased expression of Keap1, Nrf2, and HO-1 proteins and mRNA. MGF protein and mRNA showed no significant differences (P > 0.05). The number of ICC cells decreased, and their morphology was damaged. In comparison with the model group, the acupoint group showed milder inflammation and edema in HE staining and lower ANO1 protein and mRNA expression (P < 0.01), and upregulated Keap1, Nrf2, HO-1, and MGF protein and mRNA levels. Electron microscopy revealed more ICC cells with less morphological damage. Compared to the acupoint group, the inhibitor group exhibited revealed severe tissue damage and edema in HE staining, higher ANO1 protein and mRNA expression, and lower Keap1, Nrf2, and HO-1 protein and mRNA levels. MGF protein remained stable (P > 0.05). Electron microscopy showed fewer ICC cells with more severe morphological damage. Conclusion Acupressure at ST36 can improve the gastric antrum tissue pathology and restore the damaged ICC cell ultrastructure in spleen-deficient rats. Activating MGF and upregulating the Nrf2 pathway to induce ICC cell proliferation and repair may be one of the mechanisms through which acupressure on Zusanli adjusts digestive function in spleen-deficient rats.
Keywords
脾气虚证是临床常见证型，日常饮食失调、劳累过度等因素，积累日久可致脾虚气弱。中医认为，脾主消化和四肢肌肉，脾气虚则消化失能，大便异常，四肢乏力。现代医学研究证实，脾与肌肉组织能量代谢有紧密联系，脾气虚模型大鼠的胃平滑肌存在结构的损伤及能量代谢障碍[1-2]。而作为胃肠道活动的起搏者，Cajal间质细胞（interstitial cell of Cajal，ICC）的呼吸代谢在调节胃肠代谢功能中发挥着重要作用，既往动物研究已证实穴位针刺可以改善脾气虚大鼠的腹泻状态，且其作用机理是通过调节核因子E2相关因子（Nrf2）通路基因及蛋白的表达起效的[3]。足三里穴是调整胃肠功能的重要穴位，基于此，本研究将进一步分析点按经典足三里穴对脾气虚大鼠胃窦组织损伤、炎症的修复作用，以及对Nrf2通路及靶细胞ICC的影响及机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级雄性SD大鼠40只，质量（210±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证编号：SCXK（京）2019-0002。实验大鼠处置方法符合《关于善待实验动物的指导性意见》，本研究通过我院伦理委员会审批（批号:2023医伦审143）。
1.2 主要试剂及仪器
数字-模拟压力传感系统（香港艾固仪器仪表有限公司），FB自动内校电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），Nikon E100显微镜（日本Nikon公司），HT7800透射电子显微镜（日本日立公司），BX53荧光显微镜（日本奥林巴斯公司），RT-6100酶标仪（美国Rayto科技公司），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），脱水机及包埋机（武汉俊杰电子有限公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。
1.3 大鼠分组和处理
1.3.1 大鼠模型制备
将40只大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为4组：空白组、模型组、点穴组、抑制剂组，每组10例，空白组每日进食饮水自由，后三组大鼠造饮食不节和疲劳过度复合因素脾气虚模型[4]，经过9 d后，脾气虚组大鼠出现足指抓力下降、食量减少、体质量减轻，不喜活动，迟钝乏力，大便不调，毛色不荣、嗜睡扎堆等症状，符合《中医实验动物模型方法学》[5]中对于脾气虚证的评定标准，提示造模成功。
1.3.2 干预方式
造模结束后，每日固定时间对大鼠进行干预，空白组只作同步捆绑固定，不做其他处理，余三组大鼠俯卧位捆绑固定四肢，应用异氟烷麻醉后[6]，点穴组和抑制剂组采取点穴处理，应用已调制参数的压力传感仪进行操作，轮流点按双侧足三里穴[7]，力度参照已有研究[8]及本人前期实验[9]中点穴压力科学换算，设置压力为0.5 N，维持15 s后撤力，间隔5 s操作1次，每次操作3个周期，1次/d，共治疗2周，抑制剂组在首次点穴前1 d自腹腔注射Nrf2通路抑制剂鸦胆子苦醇（BRU）2 mg/kg。干预结束后，4组大鼠同步取材，麻醉后，取满足实验用的胃窦组织及小腿骨骼肌组织，固定冻存。采集标本后将大鼠脱颈处死，统一存放，收集销毁。
1.4 方法
1.4.1 HE染色
取大鼠胃窦组织，置固定液固定24 h以上，然后脱水浸蜡，包埋，制作切片、封片，切片脱蜡，染色后脱水封片，在显微镜下镜检，采集图像并分析。
1.4.2 免疫荧光染色测量跨膜蛋白16A（ANO1）蛋白表达
胃窦组织切片脱蜡至水，以EDTA缓冲液进行抗原修复，然后于脱色摇床上晃动洗涤，加一抗，湿盒内孵育过夜。滴加二抗，孵育45 min，复染细胞核、孵育、淬灭、冲洗，最后封片，完成制作。镜下观察并拍照，测量荧光强度取平均值。
1.4.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测胃窦组织中胞浆蛋白（Keap1）、核因子E2相关因子（Nrf2）、血红素氧合酶-1（HO-1）、ANO1及骨骼肌组织中机械生长因子（mechano growth factor，MGF）蛋白表达
取实验组织，加入裂解液研磨，采用BCA法测定蛋白含量，然后电泳，蛋白转膜，于室温封闭60 min，加一抗，孵育过夜，洗涤3次，孵育二抗，同法洗涤，后显影成像，以Image J软件分析蛋白条带灰度值，为目的蛋白与内参基因GAPDH蛋白的比值为目的蛋白的相对表达量。
1.4.4 Real-time PCR法检测胃窦组织Keap1、HO-1、ANO1、Nrf2及骨骼肌组织中MGF的mRNA表达量
取实验组织，进行RNA抽提，然后检测RNA浓度及纯度，后进行反转录，采用SYBR Green Ⅰ法进行定量PCR，反复40个循环的扩增，实验中内参选用U6，用ΔΔCT法进行结果处理。
1.4.5 电镜下ICC超微结构
取新鲜胃窦组织切成 1mm3左右小块，经固定、脱水、渗透包埋、切片、并用醋酸铀染色，酒精及超纯水清洗，柠檬酸铅染色，滤纸稍吸干，在透射电子显微镜下观察拍照。
1.5 统计学方法
采用SPSS 24软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差（）表示，计量资料比较应用方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色
与空白组相比，模型组大鼠的胃黏膜上皮损伤严重，出血、水肿、变性、坏死，黏膜下层水肿严重，有炎性细胞浸润，镜下可见黏膜粗糙，明显充血、糜烂，损伤面深浅不一；与模型组相比，点穴组镜下可见黏膜较光滑，偶见斑点状浅表损伤。病理检查黏膜表面细胞完整，轻度充血，水肿；抑制剂组组织损伤较点穴组严重，见图1。
图1各组大鼠胃黏膜组织的HE染色（×200）
2.2 免疫荧光染色
与空白组比较，模型组的ANO1阳性细胞数增多；与模型组比较，点穴组的ANO1阳性细胞数降低；与点穴组比较，抑制剂组的ANO1阳性细胞数升高，差异均有统计学意义（P<0.01），见图2。
2.3 蛋白表达及PCR检测结果
与空白组相比，模型组的Keap1、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达量降低，ANO1表达量升高，差异均有统计学意义（P<0.01），MGF蛋白及mRNA表达无统计学差异（P>0.05）；与模型组相比，点穴组的MGF、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达量均升高，ANO1表达量降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。与点穴组相比，抑制剂组的Keap1、Nrf2、HO-1蛋白及mRNA表达量降低，ANO1蛋白及mRNA表达量升高，差异均有统计学意义（P<0.01），MGF蛋白表达无统计学差异（P>0.05），见图3。
2.4 ICC超微结构检测结果
空白组中未观察到自噬小体，可见完整的线粒体；模型组中可见多个自噬小体，线粒体重度肿胀、嵴断裂以及严重的空泡化；点穴组中能够观察到少量自噬小体，且胞内受损状况较模型组明显减轻；抑制剂组胞内受损状况较点穴组严重，见图4。
图2各组免疫荧光ANO1染色及蛋白表达水平
图3各组蛋白表达及PCR检测结果比较
3 讨论
“肚腹三里留”是中医经典经络治疗理论，足三里穴在调整脾虚气弱，消化功能异常等方面，起着至关重要的作用。研究者应用大数据挖掘技术检索分析，发现该穴已经成为治疗脾气虚消化功能异常最常用穴位之一[10]，故本研究将小腿骨骼肌和胃窦组织同步取材。脾主运化水谷，脾气虚主要表现为能量不足，体现在肢体乏力和胃肠动力不足，而细胞中线粒体参与能量代谢，通过调节细胞呼吸链活动，成为机体提动力源泉。Nrf2是调节线粒体再生和氧化磷酸化的重要转录因子，它与抗氧化反应序列元件ARE和Keap1共同构成Keap1-Nrf2-ARE通路[11-12]。Nrf2通路能够调控氧化酶及多种保护性蛋白的表达，发挥氧化还原平衡的作用，该通路已被认为是抗氧化应激损伤中最重要的通路之一[13]。
图4各组电镜下ICC超微结构（×5000）
脾气虚消化道炎症反应及能量代谢障碍是该通路表达的重要影响因素。ICC作为胃肠起搏细胞，主要分布于胃窦部，负责调控胃肠动力和自主运动节律，它的数量、分布以及结构功能的异常改变会引起胃肠道功能紊乱[14]。既往研究发现Nrf2通路与神经细胞活化并蛋白表达息息相关[15]，ICC作为胃肠道神经细胞，被认为具有神经信号传导和慢波活动起搏的双重功能[16]，而作为ICC特异性调整离子通道的跨膜蛋白之一，ANO1主要存在于ICC胞内，在胃肠电波传导和平滑肌张力的维持方面发挥重要作用[17]，能够较为客观地评价消化功能[18]。其表达水平与ICC结构损伤呈正相关。
本研究中，HE染色、ICC超微结构及相关蛋白ANO1结果可以看出，与空白组相比，模型组胃窦黏膜层和黏膜下层、ICC染色体和相关细胞器可见组织及细胞损伤的异常状态，ANO1阳性细胞数增多，由此可见造模成功；与模型组相比，点穴组相关指标可见胃窦组织炎症水肿吸收，ICC形态和胞内受损状况得以修复，细胞相关损伤性蛋白表达降低，可见点按足三里穴具有恢复消化道正常形态的作用。既往研究表明，而体表穴位刺激可以改善受损ICC超微结构和消化功能[19]。而MGF具有力学敏感性的特点[20]，机械刺激可以助力MGF表达，激活蛋白激酶Cε，进而上调Nrf2通路[21-22]，促进相关细胞增殖和修复[23]，研究结果显示，点穴组的胃窦及骨骼肌组织MGF、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达明显高于模型组，可见点穴推拿治疗手段作为一种特殊的机械力刺激，可以诱导MGF高表达，从而上调Nrf2通路，促进下游应激诱导酶HO-1表达增加[24]，发挥其抗氧化、抗炎和保护ICC细胞的作用[25]；而注射Nrf2通路抑制剂BRU[26]后，Keap1、Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达明显低于点穴组，可知抑制剂组虽然触发了MGF高表达，但并没有上调该通路的蛋白和mRNA表达，其通路下游蛋白的表达也未被激活，自体抗氧化机能启动受阻，胃窦组织炎症和ICC相关细胞器损伤状态恢复困难，标记蛋白ANO1阳性细胞数增多，这与Nrf2通路表达受阻有直接关系。
近年来，越来越多的学者开始重视中医循经点穴疗法[27]，本实验中，点按大鼠足三里穴，激活了MGF，推动了细胞抗氧化进程，增强组织能量代谢能力，改善脾气虚大鼠胃窦组织病理形态，恢复其受损的ICC细胞超微结构，其作用机制可能与MGF活化后，增强了Nrf2核转位和能量代谢，上调Nrf2通路，激活下游保护性蛋白，促进通路介导的靶细胞ICC增殖分化，进而调整消化功能有关。关于Nrf2通路上游激活剂研究较多，本研究中点穴手法上调了MGF蛋白表达，是否直接激活了Nrf2通路，还是间接通过Nrf2激活剂完成了抗氧化应激反应，亟待后期研究进行证实。
