摘要
目的：利用生物信息学分析Erb-B2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）转导因子2（TOB2）在肾透明细胞癌（ccRCC）中的抑癌机制并预测潜在中药靶点。方法：通过检索公共数据库获取ccRCC中TOB2基因表达数据和临床信息，进行预后分析并筛选差异表达基因。对差异基因进行功能富集分析，解析TOB2基因的功能通路。分析免疫细胞浸润情况，探讨免疫细胞与TOB2基因的相关性。通过中药数据库检索与TOB2相关的潜在中药靶点。结果：生物信息学分析显示，TOB2在ccRCC中低表达，且为患者总生存、疾病特异性生存、无进展生存的独立预后因素，其低表达与肿瘤高侵袭性和不良预后相关。TOB2参与的预后模型可有效预测患者生存率。功能富集分析发现，TOB2高、低表达组的差异表达基因可能通过调节免疫微环境和脂蛋白代谢影响ccRCC发病机制。TOB2低表达显著富集脂滴积累相关过程及MAPK通路，促进肿瘤增殖和侵袭。免疫浸润分析显示，TOB2高、低表达组间16种免疫细胞浸润水平差异显著，且TOB2表达与多种免疫细胞浸润水平相关，两组间免疫检查点相关蛋白基因表达水平也存在显著差异。此外，预测常春藤、毛剪秋罗、牡荆子、云南割舌树等中药可能通过靶向TOB2发挥抗肿瘤作用。结论：TOB2是ccRCC的独立预后因素，其表达水平与免疫细胞浸润和脂质代谢密切相关，可能是潜在的治疗靶点。常春藤、毛剪秋罗等中药可能通过调节TOB2相关通路发挥抗肿瘤作用，为ccRCC的中西医结合治疗提供了理论依据。
关键词
Abstract
Objective To explore the tumor suppressor mechanism of TOB2 gene in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) and predict potential traditional Chinese medicine (TCM) targets by bioinformatics analysis. Methods Gene expression data and clinical information of ccRCC were obtained from public databases. Prognostic analysis was conducted and differentially expressed genes (DEGs) were screened. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses were performed using R software packages to analyze the functional pathways of TOB2 gene. The CIBERSORT algorithm was used to analyze immune cell infiltration and explore the correlation between immune cells and TOB2 gene. Potential TCM targets related to TOB2 were retrieved from TCM databases (such as TCMSP and ETCM). Results Bioinformatics analysis revealed that TOB2 gene was lowly expressed in ccRCC and was an independent prognostic factor for overall survival, disease-specific survival, and progression-free survival in ccRCC patients. Its low expression was associated with high tumor invasiveness and poor prognosis. The prognostic model constructed by TOB2 gene could effectively predict patient survival rate. Through functional enrichment analysis, it was found that DEGs between the high and low expression groups of TOB2 might play a role in the pathogenesis of ccRCC through the regulation of the immune microenvironment and lipoproteins. Moreover, low expression of TOB2 significantly enriched biological processes related to lipid droplet accumulation and the MAPK pathway, thereby promoting tumor proliferation and invasion. Immune infiltration analysis showed that there were significant differences in the infiltration levels of 16 types of immune cells between the high and low expression groups of TOB2, and TOB2 expression was correlated with the infiltration levels of multiple immune cells. Additionally, there were significant differences in the expression levels of immune checkpoint-related protein genes between the two groups. Prediction indicated that TCMs such as Hedera helix, Sedum lineare, Vitex negundo, and Saururus chinensis might exert anti-tumor effects by targeting TOB2. Conclusion TOB2 gene is an independent prognostic factor in ccRCC, and its expression level may be closely related to immune cell infiltration and lipid metabolism, suggesting that it may serve as a potential therapeutic target. TCMs such as Hedera helix and Sedum lineare may provide new ideas and potential targets for the treatment of ccRCC by regulating TOB2-related pathways, providing a theoretical basis for the combination of traditional Chinese and Western medicine in the treatment of ccRCC.
肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾细胞癌（RCC）中最常见的亚型，占所有RCC病例的70%~80%。在全球范围内，RCC发病人数约占成人恶性肿瘤的2%~3%，且发达国家发病率高于发展中国家[1]。在中国，RCC是第二大常见的泌尿生殖系统癌症，发病率约为3.3%，且近年来呈上升趋势。尽管体检筛查普及后早期肾癌发现率升高，但仍约30%的患者首次诊断时已发生局部进展或转移[2]。ccRCC表现出显著的异质性，约25%的局限性患者在接受局部治疗后复发[3]。ccRCC的主要治疗手段包括手术切除、靶向治疗和免疫治疗等，但由于肿瘤的异质性和耐药性，患者的长期生存率仍不理想[4-5]。
脂滴积累和脂质代谢重编程是ccRCC的显著特征[6]。ccRCC细胞中脂滴的大量积累不仅为肿瘤细胞提供了丰富的能量来源，还通过代谢重编程支持其快速增殖和存活。Erb-B2受体酪氨酸激酶2（Erb-B2 receptor tyrosine kinase2，ERBB2）转导因子2（transducer of ERBB2 2，TOB2）是ERBB2信号通路相关基因。作为B细胞迁移基因/Erb-B2转录因子（BTG/TOB）抗增殖蛋白家族的重要成员，TOB2参与细胞周期调控、免疫反应调控、转录组重塑等多种细胞功能调控[7]。有研究表明，在ccRCC细胞中上调TOB2表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，并促进脂质积累的消除[8-10]。之前有限的临床研究发现TOB2在ccRCC中低表达并与不良预后相关，但其具体参数的生物学机制和临床意义尚缺乏详细研究。
近年来，研究者通过基因检测筛选出与ccRCC相关的特征基因，并在早期诊断、预后评估和靶向治疗方面取得进展[11]。然而，西医单一治疗仍面临耐药性和不良反应等挑战。因此，结合中医药的整体调节优势，探索中西医结合治疗模式成为重要发展方向。中医肿瘤学以扶正祛邪、软坚散结、清热解毒为基本方法，通过调节免疫功能、改善症状、减轻放化疗及靶向治疗的不良反应，提升患者生活质量和生存率。本研究通过生物信息学技术探讨TOB2基因在ccRCC中的抑癌机制并预测潜在中药靶点，为ccRCC的诊断和治疗提供新思路。
1 资料与方法
1.1 泛癌及ccRCC中TOB2基因表达
选择TIMER 2.0数据库（https://timer.cistrome.org/）分析TOB2 mRNA在各种癌症和癌旁正常组织之间的表达差异。使用UCSC XENA数据库（https://xenabrowser.net/datapages/）下载TCGA的TPM格式RNAseq数据，使用R软件对数据进行分析，对比ccRCC与癌旁正常组织之间TOB2 mRNA表达的差异。使用UALCAN数据库（https://ualcan.path.uab.edu/）对ccRCC中TOB2 mRNA的表达水平及TOB2启动子甲基化水平进行分析，并对不同性别、年龄、分期、分级患者的TOB2表达进行分析。使用人类蛋白质图谱（human protein atlas，HPA）数据库（https://www.proteinatlas.org/）对TOB2蛋白表达情况进行免疫组织化学染色验证。
1.2 TOB2表达水平与ccRCC患者临床特征的相关性分析
应用秩和检验结合Logistic回归分析临床病理特征与TOB2基因表达之间的关系。
1.3 ccRCC患者生存分析、预后模型建立及评估
应用TCGA数据库数据，将541例ccRCC患者根据TOB2表达情况分为高表达组（271例）与低表达组（270例），分析两组的生存情况。采用多变量Cox回归模型探讨TOB2基因表达及其他临床变量对患者生存时间的影响。筛选出独立预后变量并构建生存预测模型。使用校准曲线评估预测模型的准确性，校准曲线接近45°线表示预测值与实际值高度一致，具有较高准确性。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用分析
使用STRING数据库（https://string-db.org/）构建TOB2蛋白的蛋白质相互作用网络，并进行功能富集分析。
1.5 TOB2表达与免疫浸润细胞的相关性分析
联合TCGA-KIRC数据及24种免疫细胞标记物，使用ssGSEA算法计算TOB2表达在ccRCC中的免疫浸润情况[12]。提取TOB2和免疫检查点相关蛋白基因的表达谱，使用Spearman相关分析两者的相关性。
1.6 TOB2高、低表达组的差异分析及功能富集分析
基于TOB2基因表达水平的中位数，将样本分为低表达组和高表达组。随后，对两组样本进行差异表达分析，筛选出差异表达基因（DEGs）。为探究这些DEGs的生物学功能，使用R软件对DEGs进行功能富集分析，包括基因本体（GO）分析与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。为了进一步评估基因集的表达变化，还进行了基因集富集分析（GSEA）。在GSEA分析中，利用归一化富集分数（NES）和调整后的P值来定义富集结果。富集分析的筛选条件设置为校正后的P<0.05和错误发现率（FDR）<0.25。
1.8 中药预测
通过Coremine数据库（https://coremine.com/medical/#search）和herb数据库（http://herb.ac.cn/）搜集TOB2基因对应的中药。
2 结果
2.1 TOB2基因在泛癌及ccRCC中的表达情况
在TCGA数据库中，TOB2基因在乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、食管癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、膀胱癌、肾透明细胞癌等肿瘤组织中表达下调，而在胆管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌的肿瘤组织中表达上调（图1）。TCGA数据库中，TOB2在ccRCC组织中显著下降（P<0.001，图2A）。UALCAN数据库中，ccRCC中TOB2 mRNA表达下调（P<0.001，图2B），TOB2启动子甲基化水平升高（P<0.001，图2C），在高分期、高分级、淋巴结转移、男性亚组患者中TOB2 mRNA表达下调（P<0.001，图3）。HPA数据库中，免疫组化染色发现ccRCC中TOB2蛋白水平显著降低（图4）。
图1TOB2基因在TCGA多种肿瘤组织中的基因表达情况（*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001）
图2TOB2基因在ccRCC组织中的表达情况
图3TOB2基因在ccRCC患者亚组中的表达情况
图4TOB2蛋白在正常肾组织和ccRCC组织中的表达情况
2.2 TOB2在ccRCC组织中的表达与患者临床病理特征的关系
TOB2高、低表达组患者的TOB2表达水平比较显示：不同肿瘤T分期、N分期、M分期、临床分期、病理分级、性别的TOB2表达水平差异有统计学意义（P<0.05），见表1。逻辑回归分析发现：TOB2高表达与ccRCC患者低肿瘤T分期（HR=0.543，P=0.003）、低M分期（HR=0.381，P<0.001）、低临床分期（HR=0.459，P<0.001）、低病理分级（HR=0.448，P<0.001）等临床特征相关，提示TOB2高表达与肿瘤低侵袭性相关（表2）。
表1不同临床亚组ccRCC患者的TOB2表达水平比较
表2TOB2表达与在ccRCC患者临床特征的逻辑回归分析表
2.3 ccRCC患者TOB2的表达与生存预后的关系
KM生存曲线分析显示，TOB2高表达组患者总体生存期（overall survival，OS）[危险比（HR）=0.42，P<0.001]、疾病特异性生存期（disease specific survival，DSS）（HR=0.32，P<0.001）、疾病无进展生存期（progression free survival，PFS）（HR=0.52，P<0.001）显著高于低表达组，提示TOB2低表达组患者预后较差（图5）。单因素及多因素回归分析显示，TOB2是预测患者OS（HR=0.475，P=0.005）、DSS（HR=0.376，P=0.006）、PFS（HR=0.573，P=0.046）的独立危险因素（表3~5）。提示TOB2是ccRCC潜在的预后生物标志物。除此之外，淋巴结转移也是OS（HR=5.064，P<0.001）、DSS（HR=6.130，P<0.001）、PFS（HR=13.072，P<0.001）的独立预测因素，年龄（HR=1.859，P=0.015）是OS的独立预测因素。基于多因素回归分析将独立危险因素纳入预测因子，得到ccRCC患者OS的nomogram列线图（图6A）。经校正曲线校验，提示模型预测概率与实际发生概率吻合度良好，可能具有良好的临床实际应用价值（图6B）。
2.4 与TOB2蛋白相互作用的蛋白质分析
通过STRING数据库构建TOB2蛋白的蛋白质相互作用网络（protein-protein interactions，PPI）（图7A，表6）。对这些蛋白进行功能富集分析，发现主要涉及“mRNA分解代谢过程的正向调节、mRNA稳定性的调节、由RNA引起的基因沉默、翻译的负向调节、核转录mRNA多聚腺苷酸尾缩短、核转录mRNA分解代谢过程的正向调节、依赖于去腺苷酸化衰变”等生物学过程（图7B）。
2.5 TOB2表达与ccRCC免疫微环境的相关性
对24种免疫细胞的浸润水平进行组间比较，TOB2高表达组与低表达组之间共有16种免疫细胞具有显著差异（图8）。对TOB2表达与免疫细胞浸润水平的相关性进行分析，结果表明TOB2的表达与ccRCC的中性粒细胞、Th17细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、记忆性T细胞、γδT细胞、辅助性T细胞、B细胞、T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞、CD56高表达性自然杀伤细胞的浸润水平均具有相关性（P<0.001，图9A）。TOB2高表达组与低表达组之间免疫检查点相关蛋白基因的表达水平比较结果显示，多个基因表达水平有明显差异（P<0.01，图9B）。
2.6 ccRCC中TOB2相关差异表达基因的功能富集分析
对TOB2高、低表达组的DEGs进行功能富集分析。GO、KEGG分析结果提示主要涉及“免疫球蛋白复合物、体液免疫反应、由循环免疫球蛋白介导的体液免疫反应、补体激活经典途径、免疫球蛋白受体结合、循环免疫球蛋白复合物、血浆脂蛋白颗粒、高密度脂蛋白颗粒”等生物学过程（图10A）。提示两组间DEGs可能通过免疫调节和脂蛋白调节在ccRCC的发病机制中发挥作用。GSEA分析结果显示，疾病组基因低表达显著富集的生物学过程和通路分别为：LDL、HDL和甘油三酯的代谢途径及相关疾病（Metabolic pathway of LDL，HDL and TG，including diseases）、家族性高脂血症类型5（Familial Hyperlipidemia Type5）、家族性高脂血症类型4（Familial Hyperlipidemia Type4）、FcεRI介导的MAPK激活（FcεRI-mediated MAPK activation）、FcεRI介导的钙离子动员（FcεRI-mediated Ca2+ mobilization），这些通路与ccRCC细胞中脂滴积累、脂肪代谢及激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路相关（图10B）。
图5TOB2高表达组与低表达组的ccRCC患者之间OS（A）、DSS（B）、PFS（C）存在显著差异
表3ccRCC患者的TOB2表达和临床特征的单因素及多因素回归分析表（OS）
表4ccRCC患者的TOB2表达和临床特征的单因素及多因素回归分析表（DSS）
表5ccRCC患者的TOB2表达和临床特征的单因素及多因素回归分析表（PFS）
图6ccRCC患者总生存率的预测模型
图7与TOB2蛋白相互作用的蛋白质分析
表6与TOB2相互作用蛋白的共表达评分
图8ccRCC组织中TOB2基因高表达组和低表达组中24种免疫细胞亚群的富集程度差异（***P<0.001）
图9TOB2基因表达与在ccRCC中免疫微环境的关系
2.7 中药预测
针对TOB2，通过Coremine数据库预测出的中药主要有：常春藤；通过HERB数据库预测出的中药主要有：菠菜、毛剪秋罗、草莓车轴草、牡荆子、云南割舌树。
3 讨论
ccRCC是一种具有显著脂质代谢异常和脂滴积累的恶性肿瘤，这些代谢特征在肿瘤的发生、发展和耐药性形成中起着重要作用[6]。脂质代谢重编程不仅为肿瘤细胞提供了丰富的能量和物质基础，还促进了肿瘤侵袭和耐药。有研究表明，MIER2锚定HDAC1并通过P53的去乙酰化抑制PGC1A表达诱导ccRCC脂质积累，富含脂质的RCC细胞补偿能量产生并以不依赖糖酵解方式维持自身生长，逃避舒尼替尼的细胞毒作用并导致耐药[13]。而N6-甲基腺苷修饰的DBT通过ANXA2/YAP轴调节的Hippo通路减轻ccRCC脂质积累并抑制肿瘤进展[14]。
图10TOB2基因高表达组与低表达组间差异表达基因功能富集分析
TOB2基因位于人类染色体22q13.2，编码TOB2蛋白。作为BTG/TOB抗增殖蛋白家族的重要成员，TOB2参与细胞周期调控、免疫反应调控、转录组重塑等多种细胞功能调控[7，15]。在ccRCC细胞研究中发现，TOB2基因表达与肿瘤细胞的生物学行为密切相关。miR-378a-3p通过靶向TOB2促进肾细胞癌的增殖和迁移，而抑制TOB2则可逆转其对RCC进展的抑制作用[9]。另外有研究发现hsa_circ_0086414通过与miR-661结合上调TOB2的表达，可发挥抗癌作用并抑制ccRCC细胞中的脂质代谢调节因子围脂滴蛋白3，促进脂质沉积的消除[8]。
本研究通过生物信息学分析发现，TOB2基因是ccRCC患者OS、DSS、PFS的独立预后因素，其低表达与肿瘤高侵袭性和不良预后相关。TOB2参与构建的预后模型能够有效的预测患者生存率，提示其可能作为潜在的治疗靶点。通过功能富集分析发现，TOB2高表达组与低表达组间的DEGs可能通过免疫微环境和脂蛋白的调节在ccRCC的发病机制中发挥作用，而TOB2低表达显著富集了与脂滴积累相关的生物学过程及MAPK通路，从而促进了肿瘤的增殖和侵袭[16]。脂滴积累和脂质代谢异常在肾透明细胞癌的发生、发展中起着关键作用，TOB2基因可能通过影响mRNA稳定性，间接参与调节脂质代谢通路，影响脂质合成、储存和分解途径，进而调节脂滴的积累和肿瘤细胞的代谢，从而影响肿瘤的生物学行为。
中医治疗ccRCC的总原则是“扶正祛邪”。从中医理论来看，异常脂质代谢相当于“浊邪”（痰、湿、瘀等邪气聚集），既是致病因素，又是病理产物，其贯穿于恶性肿瘤的发生、发展始终[17]。“扶正祛邪”法，既有效调节异常脂质代谢，又增强机体正气、提高免疫力来抵抗肿瘤，同时运用清热解毒、活血化瘀、软坚散结等法祛除病邪、抑制肿瘤生长。本研究分析发现的TOB2相关中药常春藤、菠菜、毛剪秋罗、草莓车轴草、牡荆子、云南割舌树，具有清热解毒、活血化瘀等功效，符合中医治疗ccRCC的总原则。有研究发现黄芪通过调控PI3K-AKT、MAPK、AGE-RAGE、TNF等信号通路抑制ccRCC细胞增殖[18]。八角莲可能通过影响ROS水平发挥MAPK信号通路抑制作用，促进ccRCC细胞凋亡并抑制增殖[19]。这种结合生物信息学和中药研究的思路，为从中药中寻找潜在治疗靶点提供了新方向。
综上所述，本研究将生物信息学分析和中药研究相结合，探寻TOB2在ccRCC发挥作用可能涉及的生物学过程及通路，为将来深入挖掘中医经典中可能存在的微观机制提供参考依据。然而本研究仍存在一些局限。虽然本研究为评估TOB2基因作为ccRCC预后有利因子及其抑癌作用提供了一定的依据，但仅对开源数据库样本进行了研究，所得结果仍处于分析和推测阶段，尚需要细胞实验、动物实验、多中心临床标本进行研究和验证，以进一步揭示TOB2在ccRCC脂质代谢中的具体分子机制，为ccRCC精准治疗提供新视角。