摘要
目的：探讨干扰素基因刺激因子（STING）抑制剂调节脂多糖（LPS）诱导的人肝细胞线粒体凋亡的作用机制。方法：分别采用未处理、LPS处理和LPS联合STING抑制剂处理将人肝细胞（L02）分为对照组、LPS组和LPS+STING抑制剂组。采用蛋白质印迹法分别检测干扰素基因刺激因子（STING）通路信号相关蛋白STING、TANK结合激酶1（TBK1）、干扰素调节因子3（IRF3）的表达；线粒体凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（Bax）和半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达；纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原蛋白（Collagen I）的表达。采用流式细胞术检测细胞凋亡率，酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒检测白细胞介素（IL）-1β和IL-18水平。结果：与对照组比较，LPS处理后L02细胞凋亡率上升，细胞上清中IL-1β和IL-18水平升高；而给予STING抑制剂处理后，细胞凋亡率下降，IL-1β和IL-18水平降低。此外，LPS处理后STING、TBK1、IRF3、Bax和Caspase-3蛋白表达均上调，Bcl-2蛋白表达下调；而给予STING抑制剂处理后，STING、TBK1、IRF3、Bax和Caspase-3蛋白表达下调，Bcl-2蛋白表达上调。结论：抑制STING信号通路能减轻LPS诱导的炎症反应和线粒体凋亡，进而缓解LPS诱导的肝损伤。
Abstract
Objective To explore the mechanism by which stimulator of interferon genes (STING) inhibitors regulate mitochondrial apoptosis induced by lipopolysaccharide in human hepatocytes. Methods Human hepatocytes (L02) were selected as the study object, and L02 cells were divided into control group, LPS group and LPS+STING inhibitor group by untreated treatment, LPS treatment and LPS combined with STING inhibitor treatment. Western blot was performed to detect the expression of STING signaling related proteins STING, TBK1, IRF3, the expression of mitochondrial apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax and Caspase-3. The apoptosis rate was determined by flow cytometry and IL-1β and IL-18 levels were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with the control group, the levels of IL-1β and IL-18 in the supernatant and the apoptosis rate of L02 cells were increased in L02 cells after LPS treatment. However, after treatment with STING inhibitors, the cell apoptosis rate decreased, as well as the levels of IL-1β and IL-18 levels. In addition, the expression of STING, TBK1, IRF3, Bax and Caspase-3 were increased after LPS treatment, while the expression of Bcl-2 was decreased. Nevertheless, after treatment with STING inhibitors, the expression of STING, TBK1, IRF3, Bax and Caspase-3 were decreased, and the expression of Bcl-2 was increased. Conclusion Deactivating the STING signaling pathway can reduce the inflammatory response and mitochondrial apoptosis induced by LPS, thereby alleviating LPS-induced liver injury.
脓毒症被定义为宿主对感染反应失调，使器官稳态丧失，进而引发多器官功能衰竭，最终导致患者死亡。脓毒症的病理过程伴随着氧化应激反应和线粒体功能改变等，从而引发肝损伤。脓毒症患者的预后差，其死亡率、致残率、长期住院率和器官严重的功能障碍率高居不下[1]。脓毒症导致死亡的发病机制和重要器官损伤（尤其是肝损伤）尚不完全清楚，并且临床上缺乏治疗脓毒症的有效策略，因此迫切需要探索新的有效治疗方法来减轻脓毒症引起的肝损伤。研究发现，早期感染性休克导致急性肝损伤的机制包括线粒体功能障碍和炎症反应等，这些机制在脓毒症引起的急性肝损伤的研究中具有重要研究价值[2-3]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）与线粒体生物发生和炎症反应有关，导致线粒体功能障碍，并在脓毒性条件下诱导肝损伤，因此，将肝细胞暴露于LPS中可用于体外模拟脓毒症诱导的的肝损伤。在LPS处理后模拟脓毒症的细胞模型中观测到炎症因子表达上调和线粒体凋亡，其代表性特征就是半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）表达的上调并伴随着Bax信号通路的激活[4]。此外在LPS诱导的脓毒症细胞模型中，炎症因子白细胞介素（IL）-1β和IL-18显著上调[5]。近期研究发现，环鸟嘌呤-腺嘌呤核苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）是细胞质双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的先天免疫感受器，是感染和组织损伤环境中炎症的关键介质[6]。cGAS-干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）信号通路通过诱导细胞因子，主要是I型干扰素，在微生物和肿瘤免疫学中发挥重要的调节作用[7]。H151（分子式C17H17N3O）是STING的特异性抑制剂，可以通过抑制STING的棕榈酰化，阻断STING的激活，进而抑制炎症反应。但STING信号通路对于脓毒症引发的肝损伤作用机制暂不明确。本研究通过建立体外细胞模型，从炎症反应和线粒体凋亡两方面探究STING抑制剂对于LPS诱导的肝损伤体外模型的保护机制。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
细胞系：L02细胞系[通派（上海）科技有限公司]。试剂：DMEM培养基（赛默飞世尔科技有限公司），CCK-8试剂盒及IL-18、IL-11β 酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司），LPS（默克Sigma-Aldrich试剂公司），STING抑制剂H151（美国MedChemExpress生物科技公司），FITC AnnexinV/PI双染试剂盒、RIPA裂解缓冲液（上海碧云天生物技术股份有限公司），GAPDH、STING、磷酸化干扰素基因刺激因子（p-TBK1）、磷酸化干扰素基因刺激因子3（p-IRF3）、线粒体凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白（Bax）、Caspase-3、纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋白（Collagen I）抗体和山羊抗兔IgG H&L（HRP）（英国Abcam公司），SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（上海沪震生物科技有限公司），PVDF膜（Millipore公司），RNA提取试剂Trizol（TaKaRa），反转录试剂盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR和荧光染料AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。仪器：酶标仪、小型和中型垂直电泳系统和化学发光成像仪（赛默飞世尔科技有限公司），荧光定量PCR仪器（Bio-rad）。
1.2 细胞培养和处理
将L02细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。取对数生长期的L02细胞，以每孔6×103个细胞的密度接种于96孔板。接种12 h后，去掉原培养基，分别加入含有0、10、25、50、100 μg/mL LPS的培养基，每个浓度设置3个复孔，置于培养箱中培养24 h和36 h。
1.3 CCK-8细胞活力检测
于培养后的细胞中每孔加入10 μL CCK-8溶液后继续培养1～2 h，使用酶标仪检测450 nm波长下各孔光密度（OD）值，通过如下公式计算细胞存活率（%）=[（实验孔OD值—空白孔OD值）/（对照孔OD值—空白孔OD值）]×100%。
1.4 细胞分组
确定好LPS最佳干预浓度和最佳干预时间后，将细胞分为以下3组：1）对照组；2）LPS组：L02细胞采用25 μg/mL LPS处理36 h；3）LPS+STING抑制剂组：L02细胞采用25 μg/mL LPS和50 mg/L STING抑制剂1 μmol/L H151共同处理36 h[8]。
1.5 炎症因子水平检测
各组细胞处理后，离心后取上清，采用IL-1β和IL-18试剂盒检测细胞上清中IL-1β和IL-18水平。
1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况
取对数生长期的L02细胞接种于6孔板，按照1.4中的分组处理。胰酶消化收集各组细胞，根据FITC AnnexinV/PI双染试剂盒说明书加入相应试剂孵育后，用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡水平。
1.7 蛋白质印迹（Western blot）检测相关蛋白表达
收集各组细胞，采用RIPA裂解液提取总蛋白。取等量蛋白，采用SDS-PAGE分离，转至PVDF膜上。封闭后，分别采用抗GAPDH、STING、p-TBK1、p-IRF3、Bcl-2、Bax和Caspase-3一抗孵育过夜，再用相应的二抗孵育1 h。最后，用ECL化学发光试剂盒显影并扫描PVDF膜，ImageJ 软件分析蛋白条带灰度值。
1.8 统计学方法
采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析，数据以表示，两组差异比较采用独立t检验，多组差异比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LPS对L02细胞存活率的影响
与对照组（0 μg/mL LPS）比较，作用24 h后100、50 μg/mL LPS能显著降低L02细胞存活率（P＜0.01），作用36 h后细胞存活率更低，且存活率均低于50%，提示以上浓度的LPS对细胞毒性较强。25 μg/mL LPS作用24 h后对细胞存活率无明显影响（P＞0.05），作用36 h后能够显著抑制细胞存活率（P＜0.01）。当LPS浓度低于25 μg/mL时，干预24 h及36 h对细胞存活率均无明显影响（P＞0.05），见表1。提示宜选择25 μg/mL LPS诱导36 h建立LPS诱导的L02细胞模型。
表1LPS对L02细胞存活率的影响
注：a与0 μg/mL LPS组比较，P<0.001
2.2 STING抑制剂对LPS处理L02细胞内STING、TBK1、IRF3表达的影响
与对照组比较，LPS组细胞STING、p-TBK1、p-IRF3表达水平均上升（P<0.001）；与LPS组细胞比较，LPS+STING抑制剂组细胞的STING、p-TBK1、p-IRF3表达均降低（P<0.01），见图1。
图1STING抑制剂对LPS处理后L02细胞内STING、TBK1、IRF3表达的影响
2.3 STING抑制剂对LPS处理后L02细胞上清内炎症因子水平的影响
与对照组比较，LPS组细胞上清内IL-1β和IL-18水平显著上升（P<0.01）；与LPS组细胞比较，LPS+STING抑制剂组细胞上清内IL-1β和IL-18水平显著降低（P<0.01），见图2。
图2STING抑制剂对LPS处理后L02细胞上清内炎症因子水平的影响
2.4 STING抑制剂对LPS处理后L02细胞线粒体凋亡的影响
与对照组比较，LPS组细胞的线粒体凋亡率明显增高（P<0.001）；与LPS组细胞比较，LPS+STING抑制剂组细胞的线粒体凋亡率显著降低（P<0.01），见图3。
图3STING抑制剂对LPS处理后L02细胞线粒体凋亡的影响
2.5 STING抑制剂对LPS处理后L02细胞线粒体凋亡相关蛋白的影响
与对照组比较，LPS组细胞内Bcl-2表达显著下降，Bax和Caspase-3蛋白表达显著上调（P<0.001）；与LPS组细胞比较，LPS+STING抑制剂组细胞内Bcl-2表达显著上调，Bax和Caspase-3蛋白表达显著下调（P<0.01），见图4。
图4STING抑制剂对LPS处理后L02细胞线粒体凋亡相关蛋白的影响
3 讨论
脓毒症是一种由病原微生物引发的免疫过度激活和氧化应激失调引起的全身性炎症综合征，最终发展为多器官功能障碍综合征[9]。脓毒发生过程是由于当脂多糖入侵生物体时，活跃的IL-1β和IL-18释放到细胞外空间，放大炎症反应，同时伴随着大量的细胞凋亡和细胞焦亡[10]。炎症反应进一步激活随后的线粒体凋亡，从而加速器官衰竭。近期有相关研究表明，右美托咪定能够减少炎症因子IL-1β和IL-18的释放，进而缓解LPS引发的肝损伤[11]。因此，炎症因子的释放减少可以作为肝损伤保护机制的观测指标之一。同样本研究发现，LPS刺激能诱导炎症因子IL-1β和IL-18的释放，表明LPS诱导炎症反应并促进炎症因子的释放；而给予STING抑制剂处理后，IL-1β和IL-18的释放减少，表明STING抑制剂能够通过抑制炎症反应减轻LPS诱导的炎症反应。cGAS-STING信号通路是脓毒症引发的肝损伤环境中炎症的关键介质。在脓毒症小鼠模型中，STING信号通路被细菌等激活后，可加速炎症反应及器官紊乱，甚至导致死亡；而STING基因敲除却对严重脓毒症小鼠具有保护作用[12-13]。相关研究表明，cGAS受到刺激后诱导转化成cGAMP，激活STING进而激活下游信号通路，诱导炎性细胞因子过量表达[14]。因此，STING抑制剂能够抑制STING信号通路的激活，进而抑制炎症反应，最终缓解LPS诱导的肝细胞损伤。
cGAS-STING轴作为微生物感染的重要免疫轴，能够对病原体作出反应。脓毒症引发的氧化应激失调可破坏线粒体稳态，通过cGAS-STING信号轴触发炎症反应，促进线粒体通透性过渡孔打开和线粒体DNA外泄至细胞质[15]。当线粒体稳态失衡，过度的氧化应激和功能受损会激活细胞内部的线粒体凋亡途径并引起细胞凋亡。本研究发现LPS处理后，L02肝细胞的线粒体凋亡显著增强，而在给予STING抑制剂处理后，线粒体凋亡情况得到缓解，说明STING信号通路被抑制能够缓解LPS诱导的L02肝细胞线粒体凋亡。从机制上来说，在cGAS-STING信号通路触发的线粒体凋亡途径中，Bcl-2家族蛋白促进诸多促凋亡蛋白的释放并活化Caspase-3，最终引起细胞凋亡[16]。本研究结果显示，LPS刺激能够降低Bcl-2表达，增强Bax和Caspase-3表达，表明LPS能够通过调节关键蛋白的表达诱导线粒体凋亡促进肝细胞凋亡。而在给予STING抑制剂处理后，L02肝细胞中Bcl-2表达回升，Bax和Caspase-3表达抑制，表明STING抑制剂能够恢复关键蛋白的表达减轻和L02肝细胞线粒体凋亡，进而减轻LPS诱导的肝细胞损伤。因此，LPS刺激肝细胞的初期，STING信号通路触发炎症反应，进而促进线粒体稳态失衡，而后引发细胞线粒体功能受损，最终使得线粒体凋亡。当抑制STING信号通路受到抑制时，则能够缓解线粒体损伤引发的凋亡，进而减轻肝细胞损伤。本研究还存在许多不足，首先缺乏相应的动物实验支持研究结果；其次关于STING抑制剂对于脓毒症引发的肝损伤机制研究尚不全面，这也是本课题组后续研究的主要方向。
综上所述，本研究发现抑制STING信号通路的激活能减轻LPS诱导的炎症反应和线粒体凋亡，进而缓解LPS诱导的肝损伤，有望为LPS诱导的肝细胞损伤机制奠定理论基础。