摘要
目的：研究驱动蛋白家族成员11（KIF11）在人肺腺癌组织中的表达水平，揭示KIF11对肺腺癌进展的影响及机制。方法：采用TCGA数据库评估KIF11在肺腺癌组织中的表达及其与患者预后的相关性，并用免疫组化（IHC）方法检测肺腺癌患者肿瘤组织中KIF11的表达水平，分析其表达水平与临床病理的相关性。通过集落形成和MTT实验来评估KIF11对体外肺腺癌细胞增殖的影响，并建立动物肿瘤生长模型来证实其对体内肺腺癌进展的影响。结果：根据TCGA数据库和IHC结果，KIF11在人肺腺癌组织中的表达增强。KIF11的表达与肺腺癌患者的预后、肿瘤大小（P=0.015）及临床分期（P=0.028）相关。敲低KIF11显著减少了肿瘤细胞克隆数，减缓了肿瘤生长速度（P<0.05）。结论：KIF11在人肺腺癌组织中高表达，敲低KIF11能抑制肺腺癌细胞的增殖。
关键词
Abstract
Objective To evaluate the expression level of kinesin family member 11 (KIF11) in human lung adenocarcinoma tissues, and reveal the impact of KIF11 on the progression of lung adenocarcinoma and the possible mechanism. Methods The TCGA database was utilized to assess the expression of KIF11 in lung adenocarcinoma tissues and its correlation with patient prognosis. Immunohistochemical (IHC) staining was employed to detect the expression level of KIF11 in tumor tissues from lung adenocarcinoma patients, followed by clinicopathological analysis. Colony formation and MTT assays were conducted to evaluate the impact of KIF11 on the proliferation of lung adenocarcinoma cells in vitro. Additionally, animal tumor growth models were established to confirm its effect on the progression of lung adenocarcinoma in vivo. Results Based on the TCGA database and IHC results, the expression of KIF11 is enhanced in human lung adenocarcinoma tissues. The expression of KIF11 correlates with clinicopathological features such as the prognosis of lung adenocarcinoma patients, tumor size (P=0.015), and clinical stage (P=0.028). In vitro studies on A549 and H1975 cells showed that knockdown of KIF11 significantly reduced the number of tumor cell clones, indicating that the growth of tumor cells was inhibited after KIF11 knockdown (P<0.05). Mouse studies also demonstrated that knockdown of KIF11 significantly slowed down the growth rate of tumor cells (P<0.05). KIF11 promotes the proliferation of lung adenocarcinoma cells both in vitro and in vivo. Conclusion We found that KIF11 is significantly overexpressed in human lung adenocarcinoma tissues, confirming its impact on the proliferation and progression of lung adenocarcinoma.
Keywords
肺腺癌是一种常见的恶性肿瘤，早期无明显表现，晚期常发生血液和淋巴转移[1-2]。患者预后差，病死率高，目前仍缺乏有效的干预措施[3]。驱动蛋白家族成员11（kinesin family member 11，KIF11）是细胞运动、细胞分裂、精子发生和调解的重要调节因子[4-5]。KIF11可以与TRIM家族蛋白8（tripartite motif-containing protein 8，TRIM8）、KIFC1等蛋白结合，调节双极纺锤体的形成，从而维持染色体的稳定性[6]。
近年研究表明，驱动蛋白家族成员在多种肿瘤中发挥重要作用，但其机制尚不清楚。KIF23在食管癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌等组织中高表达[7-9]。KIF11参与胶质瘤细胞的侵袭、增殖和自我更新[10]。还有研究发现，下调KIF11表达可能导致血管生成受到抑制[11]。然而，KIF11是否参与肺腺癌的发生发展尚未明确。本研究首先采用TCGA数据库评估KIF11在肺腺癌组织中的表达及其与患者预后的相关性，并用免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）方法检测肺腺癌患者肿瘤组织中KIF11的表达水平，分析其表达水平与临床病理的相关性，最后在体外和体内研究其对肺腺癌进展的影响，旨在揭示KIF11对肺腺癌的影响并揭示其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
Trizol（15596026）购自美国Invitrogen公司；SYBR Ex Taq试剂盒（638319）购自日本Takara公司；M-MLV逆转录酶（M1701）购自美国Promega公司；RIPA（9800）购自美国Cell Signaling公司；KIF11（用于IHC检测，1∶5000稀释；用于免疫印迹检测，1∶1000稀释；ab61199），Ki67（用于IHC检测，1∶5000稀释；用于免疫印迹检测，1∶1000稀释；ab16667），PCNA（1∶1000稀释，ab92552），β-actin（1∶2000稀释，ab8226）均购自英国Abcam公司。人肺腺癌A549和H1975细胞系购自美国标准菌种培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。KIF11定量PCR引物序列为：正向5’-GCCCCAAATGTGAAAGCAT-3’，反向5’-CTAAAGTGGGCTTTTTGTGAACTCT-3’；GAPDH定量PCR引物序列为：正向5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’，反向5’-GGTTGAGCACAGGGTACTTTAT-3’。KIF11 shRNA质粒购自美国Addgene公司。
1.2 临床组织样本收集
收集2022年1月—2024年6月在我院接受手术治疗的70例肺腺癌患者的癌组织及配对癌旁组织标本。所有患者或其法定监护人均已签署书面知情同意书。
1.3 免疫组化检测KIF11表达情况
组织使用4%多聚甲醛在室温下固定25 min，然后用2% BSA封闭20 min，以减少非特异性结合。接着，用KIF11抗体在室温下孵育2 h，确保抗体能够充分结合目标蛋白。随后，使用适当的二抗孵育1 h，二抗为与KIF11抗体相匹配的HRP标记抗体。孵育完成后，通过3，3'二氨基联苯胺（3，3'diaminobenzidine，DAB）显色反应进行染色，随后用流水冲洗，并用苏木精进行对比染色。最后使用显微镜观察并拍摄图像，评估各组染色的强度和分布情况。根据染色强度，对KIF11在组织中的表达水平进行半定量分析。根据染色强度和分布情况，采用0~3分半定量评分标准对KIF11的表达进行评估，其中0分：无染色；1分：弱染色；2分：中等染色；3分：强染色。
1.4 细胞培养及转染
将A549和H1975细胞置于Dulbecco改性基础培养基（DMEM）中，加入10%胎牛血清，在5% CO2培养箱中培养。将含KIF11的shRNA质粒（shKIF11组）或阴性对照的shRNA质粒（shNC组），通过Lipofectamine3000（美国Invitrogen公司）分别转染到A549和H1975细胞中。
1.5 实时定量PCR测定KIF11 mRNA表达水平
用Trizol提取人肺腺癌细胞的总RNA，M-MLV逆转录酶对RNA进行反转录，使用SYBR Ex Taq试剂盒进行定量PCR，以GAPDH为内参定量KIF11 mRNA表达水平。
1.6 免疫印迹测定KIF11蛋白表达水平
将肺腺癌细胞或组织用RIPA裂解，随后进行SDS-PAGE检测转PVDF膜后，用5%脱脂乳阻断膜，随后用KIF11和β-肌动蛋白一抗在室温下孵育1.5 h。最后将PVDF膜与酶标二抗孵育45 min，使用ECL试剂盒检测信号。
1.7 集落形成实验检测细胞数量
肺腺癌细胞在体外6孔培养系统中培养，进行KIF11沉默实验，每2天更换1次新培养基。培养2周后，用PFA固定25 min，室温下染色0.1%结晶紫20 min，PBS洗涤2次。计算集落数量。
1.8 MTT检测细胞增殖情况
将肺腺癌细胞以每孔1000个的浓度接种于96孔板，与对照组和KIF11 shRNA转染组细胞共培养24 h，每孔加入150 μL的MTT染色，随后二甲基亚砜（DMSO）重新溶解细胞，用多功能酶标仪在490 nm处测量吸光度。
1.9 肿瘤生长情况测定
以接种转染shKIF11质粒A549细胞的裸鼠为敲低组，以接种转染shRNA质粒A549细胞的裸鼠为对照组，分别观察KIF11沉默对肿瘤生长的影响。将约1×106个A549细胞皮下移植到裸鼠体内，14 d后，肿瘤形成，并每3 d测量1次肿瘤体积。术后第29天，取各组小鼠瘤体进行拍照，分析肿瘤生长曲线。定期测量小鼠皮下肿瘤体积（V）=（长×宽2）/2，其中长和宽分别为肿瘤的最大和最小直径，并以时间为横轴、肿瘤体积为纵轴绘制生长曲线，比较不同实验组间的生长差异。
1.10 统计学方法
采用GraphPad 5.0软件进行统计学分析。所有结果均以均数±标准差表示，两组比较采用t检验。采用χ2检验分析肺腺癌患者临床病理特征与KIF11表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 KIF11在肺腺癌组织中的表达情况
分析TCGA数据库的483个肺腺癌组织（tumor，T）和347个癌旁正常组织（normal，N）中的KIF11 mRNA水平，结果表明KIF11 mRNA在癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织（P<0.05，图1A）。此外，基于TCGA数据库，KIF11表达水平与肺腺癌患者的总生存率和无病生存率显著负相关（P<0.05，图1B）。
图1KIF11 mRNA在肺腺癌组织中表达上调且与患者的预后相关
2.2 KIF11的表达与肺腺癌患者的临床及病理特征的相关性
免疫组织化学结果表明，KIF11在肺腺癌组织中的表达水平较癌旁组织显著提高（图2）。进一步根据KIF11在肺腺癌组织中的表达情况将70例患者分为高、低两组，其中KIF11低表达26例（37.1%），KIF11高表达44例（62.9%），见表1。KIF11高表达与肺腺癌的临床特征（性别、吸烟、淋巴转移等）无相关性，而与肿瘤直径、临床分期呈正相关，见表1。
图2KIF11在人肺腺癌组织及癌旁组织中的表达（免疫组化，×100）
表170例肺腺癌患者KIF11表达与临床特征的关系
注：a与KIF11低表达组比较，P<0.05
2.3 KIF11下调抑制体外肺腺癌细胞增殖的影响
shKIF11质粒转染48 h，A549和H1975细胞的KIF11 mRNA和蛋白表达水平显著下降（图3）。集落形成实验结果可见下调KIF11可显著减少A549和H1975的克隆数量（图4A）。MTT实验表明下调KIF11后，A549和H1975细胞生长受到抑制（图4B）。
图3转染shRNA质粒的A549和H1975细胞中KIF11 mRNA和蛋白表达水平
图4在A549和H1975细胞中下调KIF11表达抑制肺腺癌细胞的增殖
2.4 下调KIF11表达在体内抑制肺腺癌生长
与shNC组比较，敲低组裸鼠肿瘤组织KIF11蛋白表达下调，肿瘤体积减小、生长减慢（P<0.05，图5）。
图5下调KIF11表达抑制肺腺小鼠肿瘤生长
3 讨论
肺腺癌的高转移率使得传统的放化、化学和手术方法难以达到理想的效果，因此迫切需要发现治疗的关键靶点。本研究发现KIF11在肺腺癌中高表达，并与其恶性表型和预后密切相关，可能是影响肺腺癌发生发展的新靶点。
KIF11是一种重要的动态调节因子，在有丝分裂等生命活动中发挥重要作用[12]。KIF11可以调节有丝分裂过程中双极纺锤体的产生和稳定性，其功能丧失会导致细胞周期停滞，最终导致细胞凋亡[13]。KIF11和KIFC3四聚体相互调控，可以调控有丝分裂的起始，进而调控有丝分裂过程[14]。KIF11作为有丝分裂过程中的关键调节因子，其功能丧失可能会导致细胞分裂异常，从而影响细胞生长和存活。在肺腺癌的发生发展过程中，KIF11的调控作用可能通过调节细胞周期、促进细胞凋亡或增强细胞迁移和侵袭性，进一步加剧肿瘤进展。因此，深入探讨KIF11在肺腺癌中的具体作用机制，可能为靶向治疗提供新的策略。
近年来，KIF11在多种肿瘤中的作用已被证实[13-15]。有报道称KIF11是一种潜在的致癌因子，其表达水平与乳腺癌患者的预后密切相关[16]。前期研究发现KIF11在肝癌中高表达，与肝癌患者的预后密切相关[17]。以上结果提示KIF23可能参与了肿瘤的发生发展。本研究结果表明KIF11在肺腺癌的发生发展中发挥重要作用，并且其可能成为一个潜在的治疗靶点。
尽管通过MTT和集落形成实验证明KIF11促进细胞增殖，但对于KIF11在肺腺癌细胞迁移、侵袭及肿瘤微环境中的具体作用机制尚未深入探讨。此外，目前本研究所使用的KIF11抑制剂效果仍未完全明确，未来需要进一步验证这些抑制剂在临床中的应用潜力以及可能的副作用。最后，KIF11在肺腺癌中的作用可能受到其他分子通路的调控，因此，需要进一步探索KIF11与其他关键分子或信号通路的相互作用，才能更全面地理解其在肺腺癌中的功能和潜在治疗价值。
综上所述，本研究发现KIF11在人肺腺癌组织中高表达，且KIF11的表达与肺腺癌患者的预后及临床病理特征相关。本研究进一步证实KIF11在体外和小鼠体内促进肺腺癌的增殖，因此KIF11可能成为一个有希望的肺腺癌治疗靶点。