摘要
目的：基于肠道菌群和代谢组学探讨丹酚酸A治疗2型糖尿病（T2DM）的可能作用机制。方法：从30只SD大鼠随机选取8只为对照组，其余采用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素（35 mg/kg）建立T2DM大鼠模型。随机选取造模成功的16只大鼠均分为模型组、丹酚酸A组，丹酚酸A组采用丹酚酸A(0.2 mg/mL、5 mL/kg)灌胃8周。进行大鼠葡萄糖耐量试验、胰岛素耐量试验，测定血清总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇；16SrRNA高通量测序和液相色谱-串联质谱方法检测大鼠肠道菌群及肠道代谢物的变化。结果：与对照组比较，模型组在各时间点的血糖及糖耐量实验曲线下面积（AUC）显著升高（P<0.01），总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇量显著升高（P<0.01）；血清Chao1指数、ACE指数、Shannon指数降低，Clostridia、Lachnospirales、Clostridia_UCG-014、Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Oscillospiraceae相对丰度下降，Bacilli相对丰度升高，Oscillospirales，Lactobacillaceae相对丰度升高（P<0.05）；对照组与模型组差异代谢物有18种，模型组与丹酚酸A组有12种，三组之间共同差异代谢物有3种。与对照组相比，模型组甘氨脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸下调，丹酚酸A组的甘氨脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸水平高于模型组。结论：丹酚酸A对T2DM大鼠具有改善作用，其机制可能与调节肠道菌群、改变血清代谢物有关。
Abstract
Objective To explore the possible mechanism of salvianolic acid A in treating type 2 diabetes based on intestinal flora and metabolomics. Methods Eight out of thirty SD rats were randomly selected to serve as the normal control group, while the remaining rats were subjected to a high-fat diet in conjunction with intraperitoneal injections of streptozotocin (STZ, 35mg/kg) to establish a type 2 diabetes mellitus (T2DM) rat model. The sixteen rats that successfully developed the model were then randomly divided into two groups: the model group and the salvianolic acid A group. The salvianolic acid A group received intragastric administration of salvianolic acid A (0.2 mg/mL, 5 mL/kg) for a duration of eight weeks. Subsequently, OGTT and ITT were performed on the rats, and serum levels of TC, TG, LDL-C and HDL-C were measured. Additionally, 16S rRNA high-throughput sequencing and liquid chromatography-tandem mass spectrometry methods were employed to assess changes in bacterial flora and intestinal metabolites in the rat intestines. Results Compared to the control group, the blood glucose levels and area under the curve (AUC) of the model group were significantly elevated at each time point (P<0.01). Additionally, serum levels of TC, TG and LDL-C were also significantly increased (P<0.01). Conversely, the serum Chao1 index, ACE index, and Shannon index were found to be decreased. The relative abundances of Clostridia, Lachnospirales, Clostridia_UCG-014, Lachnospiraceae, Muribaculaceae, and Oscillospiraceae were reduced, while the relative abundance of Bacilli, Oscillospirales, and Lactobacilaceae increased (P<0.05). A total of 18 distinct metabolites were identified between the control and model groups, with significant differences noted for salvianolic acid A. Among the groups, there were 12 types of metabolites identified, with 3 types classified as common differential metabolites across all three groups. In comparison to the control group, glycodeoxycholic acid and glycoursodeoxycholic acid were down-regulated in the model group, while the opposite trend was observed in the salvianolic acid A group. Conclusion Salvianolic acid A has an improving effect on T2DM rats, and its mechanism may be related to regulating intestinal flora and changing serum metabolites.
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌或利用缺陷引起[1]。据统计，2021年20~79岁人群的全球糖尿病患病率约为10.5%，到2045年将上升至12.2%，其中超过90%的糖尿病为2型糖尿病（T2DM）[2]。T2DM以胰岛素抵抗、初始高胰岛素血症、胰腺β细胞产生胰岛素的能力下降为病理生理特征，表现为肥胖、糖脂代谢紊乱[3-4]。研究表明T2DM发病可能与肠道微生物群的生态失调、炎症、免疫失调和胰淀素沉积等多种因素有关[3]。西医药物治疗往往需要终身服药，且常伴许多副作用[5-6]。中医药防治疾病具有疗效好、副作用小、多靶点调控等优势。丹酚酸A是中药丹参中含量最高的有效水溶性成分之一，具有广泛的药理活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节肠道菌群等[7-9]。研究表明丹酚酸A对糖尿病有显著的改善作用[9-10]，但其作用机制不详。肠道菌群失调影响血清代谢组，加重胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良[11]。本研究基于肠道菌群及代谢组学探讨丹酚酸A治疗糖尿病作用机制，为丹酚酸A治疗糖尿病提供药效及药理学依据。
1 材料与方法
1.1 动物
6~8周龄SPF级雄性SD大鼠30只，体质量（200±20）g，购自湖南斯莱克景达生物技术有限公司，许可证号:SYXK（鄂）2018-0104，饲养于SPF级动物房，温度23~26℃，相对湿度50%~70%，动物自由摄食、饮水，房间设置独立通风系统。本研究方案伦理批准号：HLK-20221223-001。
1.2 药品与试剂
丹酚酸A（批号：P3761，德国Sigma-Merck公司）；戊巴比妥钠（批号：B20260，上海源叶生物科技有限公司）；二甲双胍（批号：S30880，上海源叶生物科技有限公司）；链脲佐菌素（STZ，批号23230307013，北京索莱宝科技有限公司）；磁珠法土壤与粪便DNA提取试剂盒（批号：01724，上海MolPure公司）；16S rRNA测序试剂盒（批号：MS-102-2002，美国illumina公司，MiSeq Reagent Kits v2）；血糖仪及血糖试纸（上海鱼跃医疗设备有限公司）。
1.3 仪器与设备
使用雷杜Chemray 800型全自动生化分析仪检测，检测试剂为雷杜配套生化试剂盒。16s扩增子测序平台为lllumina Miseq；代谢组学数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱（UltraChromatography，UPLC）（ExionLC™AD Performance Liquid https://sciex.com.cn/）和串联质谱（Tandem Mass Spectrometry，MS/MS）（QTRAP® 6500+，https://sciex.com.cn/）。
1.4 动物分组、模型制备、给药方法
将30只大鼠自适应饲养1周后，按随机数表法分为两组，对照组（n=8）：喂饲实验室标准饲料；模型组（n=22）：高脂饲料喂养动物8周后，禁食12 h，腹腔注射35 mg/kg STZ继续高脂饲料喂养1周后，自尾静脉采血检测空腹血糖（FBG），未达标大鼠再次注射相同剂量STZ。注射后1、2周再次自尾静脉采血检测FBG，3次测量FBG≥11.1 mmol/L表明T2DM大鼠模型制备成功。模型组中有18只建模成功，随机选择16只，采用随机数字表分为2个亚组：丹酚酸A组（n=8）和模型组（n=8），再继续喂养高脂饲料8周，同时丹酚酸A组用1 mg/kg丹酚酸A灌胃，模型组用等量生理盐水灌胃，每天1次。
1.5 葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）
给药后第7周，利用血糖仪测量各组大鼠葡萄糖耐量。给药后第8周，测量各组大鼠胰岛素耐量。大鼠在OGTT和ITT试验前分别禁食12 h和4 h。分别在口服50%葡萄糖（2 g/kg）或皮下注射胰岛素（5 U/kg）后0、30、60和120 min测量血糖水平。
1.6 血脂指标的测量
胰岛素耐量实验结束后，自腹主动脉采集血液，离心后-80℃冻存，采用雷杜配套生化试剂盒测定血清总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇水平。
1.7 16S rRNA测序分析
取肠道无菌粪便2～3粒放入冻存管中，提取粪便样本DNA，用Qubit检测DNA浓度，利用引物扩增微生物16S rRNA高变区V3～V4，对PCR扩增产物进行纯化，构建文库并质检，使用Illumina高通量测序平台进行测序。对优质序列进行操作分类单元（OTUs）聚类，与数据库进行比对得到每个OTU对应的物种分类信息，然后进行物种注释与组成分析、α多样性分析、beta多样性分析、物种丰度差异分析、LEfSe分析等。
1.8 靶向代谢组学
取大鼠粪便样品20 mg，加入210 μL提取液提取上清液。液相条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱；流动相：A相为超纯水；B相为乙腈；流速0.35 mL/min、柱温40℃、进样量1 μL；梯度洗脱。质谱条件包括：电喷雾离子源（Electrospray Ionization，ESI）温度550℃，质谱电压-4500 V，气帘气（Curtain Gas，CUR）35 psi。液基于标准品构建MWDB（Metware Database）数据库进行定性分析。
1.9 统计学方法
采用SPSS 25.0软件进行统计分析。结果以均数±标准差表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，进一步多重比较采用Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 丹酚酸A对T2DM大鼠OGTT和ITT的影响
OGTT结果显示，与对照相比，模型组在0、30、60和120 min的血糖及糖耐量实验曲线下面积（AUC）显著升高（P<0.01）；与模型组相比，丹酚酸A组在0、30、60和120 min的血糖及AUC明显降低（P<0.05）（图1）。ITT结果显示，与对照相比，模型组在0、30、60和120 min的血糖及AUC显著升高（P<0.01）；与模型组相比，丹酚酸A组在各时间点（除120 min外）血糖及AUC明显降低（P<0.05）（图2）。
图1丹酚酸A对T2DM大鼠OGTT的影响
图2丹酚酸A对T2DM大鼠ITT的影响
2.2 丹酚酸A对T2DM大鼠血脂指标的影响
与对照组相比，模型组大鼠的血清TC、TG和LDL-C含量显著升高（P<0.01），与模型组比较，而丹酚酸A组TC、TG和LDL-C含量显著降低（P<0.01）；模型组和丹酚酸A组的HDL-C含量低于对照组（P<0.01），但模型组与丹酚酸A组的HDL-C含量差异无统计学意义（图3）。
图3丹酚酸A对T2DM大鼠血脂指标的影响
2.3 丹酚酸A对T2DM大鼠肠道菌群的影响
2.3.1 α-多样性分析
三组大鼠血清Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数差异均无统计学意义（均P＞0.05）（图4）。
图4三组大鼠血清Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数比较
2.3.2 Beta多样性分析
三组之间均有较明显的分离，这就说明对照组和丹酚酸A组大鼠的样本点分布更近（图5）。
图5丹酚酸A对T2DM大鼠肠道菌群Beta多样性的影响
2.3.3 肠道菌群结构与组成分析
选取各样品在门、纲、目、科上最大丰度排名前10的物种，绘制成物种相对丰度柱形累加图。
在目水平上来看，主要由Lachnospirales、Bacteroidales、Oscillospirales、Lactobacillales、Clostridia_UCG-014组成。与对照组对比，模型组Lachnospirales、Clostridia_UCG-014相对丰度下降、Oscillospirales相对丰度升高（P<0.05）；与模型组对比，丹酚酸A组Lachnospirales、Clostridia_UCG-014相对丰度升高、Oscillospirales相对丰度下降（P<0.05）。
在科水平上来看，主要由Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Prevotellaceae、Lactobacillaceae、Oscillospiraceae组成。与对照组对比，模型组Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Oscillospiraceae相对丰度下降、Lactobacillaceae相对丰度升高（P<0.05）；与模型组对比，丹酚酸A组Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Oscillospiraceae相对丰度升高、Lactobacillaceae相对丰度下降（P<0.05）（图6）。
图6丹酚酸 A对 T2DM大鼠肠道菌群目、科水平上的影响
2.3.4 物种差异判别分析
采用线性判别分析（Lefse）确定组间存在差异的特定菌群，LDA评分为2.0。结果见图7。其中对照组中差异菌有22个，具有明显差异的优势物种为厚壁菌门中的Ruminococcaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group；模型组中差异菌有22个，具有明显差异的优势物种为厚壁菌门中的Bacilli、Lactobacillales、Lactobacillaceae、Lactobacillus、Anaerostipes，拟杆菌门中的Prevotellaceae_Ga6A1_group、Proteobacteria；丹酚酸A组中差异菌有51个，具有明显差异的优势物种为Verrucomicrobiota、Verrucomicrobiae、Verrucomicrobiales、Akkermansiaceae、Akkermansia，厚壁菌门中的Christensenellales、Christensenellaceae、Christensenellaceae_R-7_group、Gammaproteobacteria。
图7丹酚酸A对T2DM大鼠肠道菌群微生物差异显著物种LDA值分布的影响
2.3.5 有益菌、有害菌、产丁酸菌分析
与对照组相比，模型组的Bifidobacterium、Lactobacillus johnsonii益生菌的丰度升高；丹酚酸A组的Bifidobacterium、Blautia益生菌的丰度升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；模型组与丹酚酸A组的Bifidobacterium、Blautia、Lactobacillus johnsonii益生菌的丰度差异无统计学意义（图8）。
图8各组大鼠有益菌箱式散点图
2.4 代谢组学分析
2.4.1 分组主成分分析（PCA）
对照组组与模型组、模型组与丹酚酸A组组间差异较大，样本分散，都有分离趋势（图9）。
2.4.2 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）
对照组与模型组、模型组与丹酚酸A组代谢物轮廓明显分开，组间差异变大，组内差异减小（图10）。OPLS-DA S-plot结果显示，模型组与对照组比较，最显著的差异代谢物为23-脱甲脱氧胆酸（Nor-Deoxycholic Acid）、猪脱氧胆酸（Hyodeoxycholic acid）；丹酚酸A组与模型组比较，最显著的差异代谢物为ω-鼠胆酸（ω-muricholic acid）、3β-甘胆酸（3β-Glycocholic Acid）（图11）。
图9主成分分析三维图
图10OPLS-DA 得分图
图11OPLS-DAS-plot图
2.4.3 差异代谢物筛选
基于OPLS-DA模型，以VIP＞1.0、FC＜0.5或＞2为条件筛选差异代谢物，筛选对照组与模型组差异代谢物有18种，三组共同差异代谢物有3种，为β-鼠胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸。与对照组相比，模型组甘氨脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸下调，丹酚酸A可以缩小下调趋势，但差异无统计学意义（图12）。
图12差异代谢物的筛选
3 讨论
当前社会糖尿病及其并发症的发病率逐年上升[12]。丹酚酸A因其药理作用被广泛用于糖尿病及其并发症的研究。本研究通过高脂饮食加STZ建立T2DM大鼠模型[13]，为T2DM药理学研究中最常用的模型。OGTT、ITT实验结果显示T2DM大鼠模型诱导成功，与既往报道一致[14-15]；给予丹酚酸A干预后，T2DM大鼠胰岛素抵抗、胰岛素分泌和调节血糖能力得到改善，血脂指标较前明显下降，这些研究结果表明丹酚酸A具有改善T2DM大鼠糖脂代谢紊乱的作用。
肠道菌群有增强宿主免疫力、调节肠道内分泌功能、调节神经信号、改变代谢和消除毒素等作用[16]。研究表明，肠道微生物失调与T2MD的发生密切相关[17-18]。本研究α-多样性、Beta多样性分析结果及菌群结构组成分析皆与其一致。在T2DM患者中，Clostridiales等产丁酸盐的细菌丰度下降，Bacteroidetes、Bacilli和部分Proteobacteria等机会致病菌丰度增加[19]。Yang等[20]研究发现T2DM组大鼠Lachnospiraceae、Oscillospiraceae的肠道菌群丰度下调。Lachnospiraceae是一种严格厌氧细菌，不仅与肥胖呈负相关，还可能与维持肠道氧化还原状态存在正相关[21]，这些与本研究中结果一致。本研究中对照组中差异物种为Ruminococcaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group等有益菌群；模型组差异物种为Bacilli和Lactobacillales，有研究表明Lactobacillales能抑制病原体及其内毒素的产生，维持肠道中微生态平衡，并认为T2DM大鼠肠道中Lactobacillales丰度升高可能与其抵抗机体内炎症状态有关[22]；Gurung等[23]发现Lactobacillus johnsonii可以改善脂质代谢和全身葡萄糖代谢，Bifidobacterium是糖尿病研究中最常见的有益菌属，在糖尿病患者体内Bifidobacterium比例显著减少。日本一项横断面研究发现Blautia具有抗炎特性和改变宿主肠道环境和脂质代谢的能力，为与肥胖和T2DM呈负相关的细菌[24]。本研究证明丹酚酸A可以增加T2DM大鼠Bifidobacterium、Blautia、Lactobacillus johnsonii等益生菌丰度。综上所述，丹酚酸A可能通过提高调节肠道微生物群落物种类型，增加有益菌、降低有害菌的丰度从而改善T2DM大鼠肠道微生态紊乱，起到调节T2DM大鼠糖脂代谢的作用。
粪便代谢物是是宿主和肠道微生物相互作用的桥梁[25]。有研究表明肠道菌群的代谢物已被证实可作用于胰岛素受体，降低胰岛素敏感性，调节代谢和免疫稳态[26]。当肠道菌群结构失衡时可导致肠道代谢物的变化，影响T2DM相关的信号通路导致T2DM的发生[27]。丹酚酸A对T2DM大鼠粪便代谢物的调节作用主要集中于胆汁酸代谢。猪脱胆酸可以促进肠道GLP-1的合成和分泌，从而发挥强大的脂质代谢、血糖调控能力[28]，本研究中其水平下调说明模型组大鼠糖脂代谢能力有下降的趋势。Chen等[29]发现甘氨熊脱氧胆酸可以上调肠道有益细菌的丰度，进而调节TLCA-B.vulgatus-脂肪TGR5信号通路，增加脂质产热来改善糖脂代谢。血清甘氨脱氧胆酸水平上升与肥胖相关表型呈负相关，与胰岛素敏感性、ANGPTL4水平及B. adolescentis等4个菌株呈正相关。本研究证明丹酚酸A可逆转模型组甘氨脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸下调。
综上所述，本研究基于16s测序联合代谢组学发现丹酚酸A能通过调节肠道菌群及粪便代谢物发挥对T2DM大鼠的保护作用，为丹酚酸A在T2DM治疗的临床应用提供科学依据。