摘要
目的:观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎（UC）大鼠炎性细胞因子和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白的影响。方法:采用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇复合灌肠法建立UC大鼠模型，将其分为模型组、美沙拉嗪组、泄浊解毒方高剂量组、中剂量组和低剂量组。药物组给予相应的药物灌胃14 d，空白组和模型组给予生理盐水灌胃14 d。给药结束后处死大鼠，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清白细胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17的含量。Western blot法检测结肠组织HIF-1α蛋白的表达。结果:泄浊解毒方可改善UC大鼠结肠黏膜的炎症反应，与模型组比较，泄浊解毒各剂量组大鼠结肠黏膜的病理损伤评分显著降低，血清IL-10含量明显升高，IL-6、IL-17含量显著降低（P<0.05）；泄浊解毒方各剂量组HIF-1α蛋白的表达明显低于模型组（P<0.05）。结论:泄浊解毒方可改善UC大鼠结肠黏膜的病理损伤，其作用机制可能与调节血清炎性细胞因子和降低结肠组织中HIF-1α蛋白的表达有关。
Abstract
Objective To observe the effects of Xiezhuo Jiedu Recipe on the expression of inflammatory cytokines and hypoxia inducible factor 1α(HIF-1α) protein of ulcerative colitis (UC) rats. Methods TNBS/ethanol combined enema was used to establish UC rat models, which were divided into model group, mesalazine group, Xiezhuo Jiedu Recipe high-dose group, Xiezhuo Jiedu Recipe medium-dose group and model group were given normal saline intragastric administration for 14 days. After administration, the rats were killed, and the contents of interleukin(IL)-6, IL-10 and IL-17 in serum of the rats were detected by ELISA. The expression of HIF-1α protein in colon tissue was observed by WB. Results Xiezhuo Jiedu Recipe can improve the inflammatory response of the colonic mucosa in UC rats, compared with the model group, the pathological damage score of the rat colon mucosa in each dose group of the Xiezhuo Jiedu Recipe was significantly lower, the content of IL-10 in serum was significantly higher, the content of IL-6 and IL-17 was significantly lower(P<0.05).The expression of HIF-1α protein of UC rats could be decreased in each dose group of Xiezhuo Jiedu Recipe compared with model group (P<0.05). Conclusion Xiezhuo Jiedu Recipe can improve the pathological injury of colon mucosa in UC rats, and its mechanism may be related to regulating serum inflammatory cytokines and decreasing the expression of HIF-1α protein in colon tissue.
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是以慢性炎症反应和肠道黏膜上皮损伤为特征的慢性非特异性炎症性疾病[1]，病变常从直肠黏膜开始向近端发展[2-3]。UC缠绵难愈，易复发，导致患者生活质量下降。此外，由于受长期、慢性的肠道炎症刺激，UC患者发生结直肠癌的风险升高[4]。有研究显示，UC患者病程超过8～10年，其患UC相关结直肠癌的危险每年增加0.5%～1%[5]。
近年来，缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在UC的研究中受到越来越多的关注，它不仅可介导炎症的发生，又可进一步通过调节巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）破坏肠上皮屏障功能，促进炎性细胞浸润和肠道充血水肿，从而加重UC的发展[6]，对HIF-1α的调控可能成为UC治疗的新思路[7]。
国医大师李佃贵教授创立了“浊毒理论”，为UC的治疗开阔了新思路[8]。基于浊毒理论，并根据多年的临床和基础研究，刘建平教授认为“浊毒内蕴”为UC的基本病机，临床应用泄浊解毒方可明显改善UC患者的临床症状和肠镜表现[9]。动物实验也证实泄浊解毒方可明显改善UC大鼠的症状[10]。目前网络药理学已广泛应用于中药配伍及作用机制阐释等方面[11-12]，这为研究中医复方治疗疾病的复杂机制提供了新的视角[13]。本课题组前期研究发现，泄浊解毒方可通过HIF-1信号通路治疗UC[14]。本研究旨在通过实验初步验证泄浊解毒方对UC大鼠HIF-1α蛋白表达的影响，为泄浊解毒方的临床应用和进一步研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
70 只6～8周龄雄性SD大鼠，体质量200～220 g，购自北京维通利华公司（批号：SCXK2021-0006）。动物饲养于SPF级环境中，房间空气流畅，室温（20±2）℃，相对湿度50%～60%。实验得到本院伦理委员会批准（编号：DWLL202212012）。
1.1.2 主要试剂及仪器
泄浊解毒方颗粒（车前子、败酱草、薏苡仁、葛根、鱼腥草、黄连、黄芩、大血藤、木香、清半夏）购于广东一方制药有限公司；美沙拉嗪缓释颗粒（艾迪莎，批号：210401）；5% 2，4，6三硝基苯磺酸（TNBS，批号：P2297-10 mL）；IL-6、IL-10、IL-17定量酶联检测试剂盒（批号分别为SXR032、SXR035、SXR039）购于上海森雄科技实业有限公司；HIF-1α抗体（批号：BS-20399R）购于北京博奥森生物公司；显微镜（日本Nikon公司，型号Eclipse E100型）；离心机（美国Beckman公司，型号J2-HS）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，型号ChemDoc MP）。
1.2 方法
1.2.1 模型建立与分组
抽取10只大鼠设为空白组，剩余60只按照Morris等[15]的方法（即TNBS/乙醇复合灌肠法）建立UC模型。将TNBS/乙醇混合液注入大鼠结肠内（深入肛门约8 cm），倒置大鼠并捏紧肛门，5 min后于头低足高位放置，待其自然苏醒后放回饲养笼中继续饲养3 d，若大鼠出现腹泻、肛周污秽、稀便、便血等症状，观察其结肠病理变化，若有充血、水肿、伴炎细胞浸润、杯状细胞减少、小溃疡形成等症状，提示模型制备成功[16]。将成功建立UC模型的50只大鼠随机分为模型组、美沙拉嗪组、泄浊解毒方高剂量组（XZJD-H）、泄浊解毒方中剂量组（XZJD-M）和泄浊解毒方低剂量组（XZJD-L），每组10只。
1.2.2 给药与取样
各组于建模成功后第1天开始灌胃给药，剂量参照《药理实验方法学》[17]。泄浊解毒方颗粒等效剂量折合成生药量为13.32 g·kg-1，此剂量为XZJD-M组灌胃剂量，2倍等效剂量为XZJD-H（26.64 g·kg-1），0.5倍等效剂量为XZJD-L（6.66 g·kg-1）。XZJD-H、XZJD-M和XZJD-L的配置浓度分别为2.664 g/mL、1.332 g/mL和0.666 g/mL。美沙拉嗪组灌胃剂量为0.36 g·kg-1，美沙拉嗪的配置浓度为0.036 g/mL。各组大鼠持续灌胃14 d，末次给药后，大鼠均禁食、不禁水24 h。麻醉大鼠，股动脉取血7～8 mL，分离上清用于指标检测；剪取距肛门上方6～10 cm肠段，于冰上用冰生理盐水冲洗，然后将结肠组织分段，一部分用于组织病理学检查，剩余结肠组织放入-80℃冰箱保存，用于蛋白免疫印迹法（Western blot）检测。
1.2.3 病理形态学观察和组织病理学评分
将剪取的各组大鼠结肠组织清洗干净后放置于4%多聚甲醛溶液内固定，然后脱水，采用透明剂（二甲苯）透明，恒温浸蜡，包埋后切片、贴片、烘片，HE染色后中性树脂封片，于显微镜下镜检并拍照。在显微镜下阅片，结肠组织病理学评分方法选用Robarts的组织学指数（Robarts histopathology index，RHI）[18]，RHI总分=1×慢性炎症细胞浸润评分+2×固有层中性粒细胞浸润评分+3×上皮中性粒细胞浸润评分+5×糜烂或溃疡评分。
1.2.4 ELISA法检测炎性细胞因子含量
分离血清，遵照试剂盒说明步骤测定IL-6、IL-17和IL-10的含量。
1.2.5 Western blot法检测HIF-1α蛋白表达
称取适量的结肠组织，剪碎、加入RIPA裂解液，充分研磨、裂解，4℃、13 000 r/min离心10 min，收集上清，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，加入上样缓冲液，100℃水浴加热使蛋白变性。根据目的蛋白相对分子大小进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h后进行洗膜处理。加入稀释的一抗，于4℃孵育过夜，洗膜，加入稀释后的二抗，室温下孵育2 h，洗膜利用凝胶成像系统显影，借助Image J软件分析灰度值进行后续统计学分析。
1.3 统计学分析
实验数据使用SPSS 20.0软件处理，其中计量资料采用（）表示，使用GraphPad Prism 8.0软件作图。以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠结肠组织病理情况
空白组结肠黏膜上皮完整，腺体规则整齐；模型组结肠黏膜上皮和固有层部分缺失，见大量炎细胞浸润，并有溃疡形成；美沙拉嗪组结肠黏膜结构多数排列整齐，偶见隐窝炎和上皮糜烂，未见溃疡；泄浊解毒方低剂量组结肠黏膜结构部分排列整齐，可见隐窝炎和隐窝脓肿形成，炎细胞浸润减少；泄浊解毒方中剂量组结肠组织黏膜结构部分排列整齐，偶见隐窝脓肿形成，炎细胞浸润明显减少；泄浊解毒方高剂量组结肠黏膜上皮完整，腺体排列整齐，炎细胞浸润较模型组明显减少，见图1。RHI评分结果显示，与空白组比较，模型组大鼠RHI评分显著升高（P<0.01）；与模型组比较，泄浊解毒方低、中、高剂量组和美沙拉嗪组RHI评分明显降低（P<0.05），见表1。
图1各组大鼠结肠组织病理变化（HE，×100）
表1各组大鼠 RHI评分比较
注：a与空白组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.05
2.2 大鼠IL-6、IL-17、IL-10的含量
模型组大鼠血清IL-6、IL-17含量较空白组明显升高（P<0.01），IL-10含量较空白组明显降低（P<0.01）；与模型组比较，美沙拉嗪组和泄浊解毒方各剂量组IL-6、IL-17含量降低，IL-10的含量升高（P<0.05），且IL-10含量随泄浊解毒方剂量的增加而升高，见表2。
表2各组大鼠IL-6、IL-17、IL-10含量比较
注：a与空白组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.05
2.3 大鼠结肠组织HIF-1α蛋白的表达
与空白组比较，模型组大鼠HIF-1α蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，美沙拉嗪组和泄浊解毒方各剂量组结肠组织中HIF-1α蛋白表达降低（P<0.05），且HIF-1α蛋白表达随泄浊解毒方剂量增加而降低，见图2、3。
图2各组大鼠结肠组织HIF-1α蛋白的表达
图3各组大鼠结肠组织HIF-1α蛋白表达水平比较
3 讨论
国医大师李佃贵教授认为，感受外邪、饮食不节（洁）、情志失调、久病伤正等因素导致脾运不及，水湿泛滥，郁而化浊，浊积成毒，浊毒内蕴肠腑，化腐成脓而致UC。浊毒学说是在中医传统理论的基础上，纳入了现代病因学的内容，逐渐丰富、完善而形成的理论，其内涵深刻、外延广泛，推动了中医病因病机学说的发展。基于“浊毒致病”理论，结合多年治疗UC的临床经验，刘建平教授筛选出具有泄浊升清，解毒祛瘀化湿功效的验方泄浊解毒方，治疗UC疗效确切。
目前普遍认为UC的发生是遗传因素、环境因素、免疫失衡、肠道屏障功能障碍及肠道菌群失调等综合作用的结果[21]。研究表明，UC与促炎及抑炎细胞因子之间的平衡被破坏密切相关[22]。IL-6是促炎细胞因子，具有多种生物学功能，可引发并加重结肠黏膜炎性反应[23]，其含量与UC的炎性反应程度密切相关[24]。IL-17具有强大的促炎活性，可引起炎症反应和明显的组织损伤，介导UC等免疫性疾病的发生发展过程[25-26]。IL-10能抑制炎症因子的合成和释放，具有较强的免疫抑制作用，尤其在肠道黏膜免疫中有重要作用[27]。有研究表明[28]，湿浊致病作用与炎性细胞因子水平相关。湿邪不去，成浊生毒，浊毒胶结与炎性细胞因子对机体内环境的影响相似，而炎性细胞因子引起的炎症反应与宿主的免疫功能密切相关[29]。研究发现，与模型组比较，泄浊解毒方各剂量组IL-6、IL-17的含量均降低，IL-10的含量升高，且IL-10含量随泄浊解毒方剂量增加而升高，这表明泄浊解毒方可调节UC大鼠血清中促炎和抑炎细胞因子的平衡，进而改善UC大鼠的炎症反应。
缺氧现象普遍存在于组织器官中，是导致炎症或加重炎症的重要原因[30]。HIF-1α通常在缺氧状态下稳定表达，与缺血、缺氧性疾病以及肿瘤密切相关，也与肠黏膜屏障功能的修复有关[31]。HIF-1α还可调控活性氧、前列腺素E2等相关靶基因的表达，引起内皮细胞损伤从而加重机体炎症反应。有研究表明，HIF-1α可延长中性粒细胞在低氧环境的存活时间[32]并促进IL-1、环氧合酶-2合成，增强炎症反应[33]。HIF-1α是巨噬细胞的关键调节因子，而IL-6、TNF-α均为巨噬细胞重要的炎症标志物，HIF-1α的高表达会介导IL-6、IL-17、TNF-α等炎症介质的释放，从而加重炎症反应。抑制HIF-1α可减少促炎细胞的募集，增加IL-10，抑制炎症反应。有研究发现，白头翁汤可通过抑制HIF-1α蛋白的激活，进而减轻UC小鼠的炎症反应[34]。本研究表明，模型组HIF-1α蛋白的表达较空白组明显升高，经灌胃给药后，泄浊解毒方各剂量组HIF-1α蛋白表达较模型组明显降低，说明泄浊解毒方可以抑制HIF-1α蛋白的表达，改善UC大鼠肠道黏膜缺氧状态，减轻肠道炎症反应。
综上所述，泄浊解毒方可改善UC大鼠的炎症反应，其作用机制可能与调节血清炎症因子和降低结肠组织中HIF-1α蛋白的表达有关。