摘要
目的：探讨白藜芦醇（RES）对动脉粥样硬化（AS）大鼠的血脂水平、氧化三甲胺（TMAO）、炎症因子和肠道菌群丰度的调控作用。方法：将24只大鼠随机均分为对照组、AS组和RES组，AS组和RES组大鼠采用腹主动脉球囊损伤法联合高脂饲料喂养2周复制AS模型。造模次日开始灌胃给药，每日1次，连续4周。采用主动脉苏木精-伊红（HE）染色、血脂水平验证RES干预AS的效果，检测各组大鼠TMAO、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的表达水平，使用宏基因组测序分析肠道内容物肠道菌群丰度。结果：与对照组比较，AS组大鼠血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、TNF-α、IL-6和TMAO水平升高；肠道菌群生物多样性减少；在门水平上，厚壁菌门和放线菌门相对丰度下调，拟杆菌门和尾噬菌体门相对丰度上调；在纲水平上，放线菌纲、芽孢杆菌纲和梭菌纲相对丰度下调，拟杆菌纲、丹毒丝菌纲和γ变形菌纲相对丰度上调；在属水平上，拟杆菌属、埃希菌属、鼠肠杆菌属和副拟杆菌属相对丰度上调，双歧杆菌属、乳杆菌属、唾液乳杆菌属、罗伊氏乳杆菌属、甲烷球形菌属和罗氏菌属相对丰度下调。与AS组比较，RES组大鼠血清TC、TNF-α、IL-6和TMAO水平降低；RES上调了AS大鼠肠道菌群生物多样性和厚壁菌门、芽孢杆菌纲、梭菌纲、双歧杆菌属、乳杆菌属、唾液乳杆菌属、罗伊氏乳杆菌属和罗氏菌属的相对丰度，下调了尾噬菌体门、拟杆菌门、拟杆菌纲、丹毒丝菌纲、γ变形菌纲、拟杆菌属、埃希菌属和鼠肠杆菌属的相对丰度，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：RES可调节AS大鼠的血脂水平，降低TNF-α、IL-6和TMAO的表达水平，上调有益菌群的丰度，下调有害菌群的丰度，从而调节肠道菌群的多样性。
Abstract
Objective To investigate the regulatory effects of resveratrol (RES) on trimethylamine N-oxide (TMAO) level and intestinal flora abundance in atherosclerosis (AS) rats. Methods Twenty-four rats were randomly divided into control group, AS group and RES intervention group. Rats in the AS group and RES intervention group were fed with abdominal aortic balloon injury method combined with high-fat chow for 2 weeks to replicate the AS model. The drug was administered by gavage starting on the next day of modeling, once daily for 4 weeks. Aortic hematoxylin-eosin (HE) staining and lipid levels were used to verify the effect of RES intervention in AS, and the abundance of intestinal flora in intestinal contents was analyzed using metagenomics. Results Compared with the control group, serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6) and TMAO level of AS group rats were elevated. The intestinal bacterial biodiversity was reduced. At the level of the phylum, the relative abundance of Firmicutes and the Actinobacteria were down-regulated, and the relative abundance of Bacteroidetes and Uroviricota was up-regulated. At the class level, the relative abundance of Actinomycetia, Bacilli and Clostridia was down-regulated, the relative abundance of Bacteroidia, Erysipelotrichia and Gammaproteobacteria was up-regulated. At the genus level, the relative abundance of Bacteroides, Escherichia, Muribaculum, and Parabacteroides was up-regulated, and the relative abundance of Bifidobacterium, Lactobacillus, Ligilactobacillus, Limosilactobacillus, Methanosphaera and Romboutsia was down-regulated. In comparison to the AS group, the serum TC, TNF-α, IL-6 and TMAO of rats in RES intervention group were decreased. RES up-regulated the biodiversity of intestinal flora and the relative abundance of Firmicutes, Bacilli, Clostridia, Bifidobacterium, Lactobacillus, Ligilactobacillus, Limosilactobacillus, and Romboutsia in AS model rats, and down-regulated the relative abundance of Uroviricota, Bacteroidetes, Bacteroidia, Erysipelotrichia, Gammaproteobacteria and Muribaculum, with all differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion RES can regulate lipid levels in AS rats, reduce the expression of TNF-α, IL-6, and TMAO, upregulate the abundance of beneficial microbiota, downregulate the abundance of harmful microbiota, and modulate the diversity of the gut microbiota.
Keywords
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是慢性炎症性疾病，其病理特征是脂质、胆固醇等病理产物在动脉内膜下沉积，形成斑块，导致动脉壁增厚、管腔变窄，进而影响血流的正常通过，严重者可阻塞管腔，继发血栓形成，诱发心肌梗死、脑卒中或外周动脉疾病等严重后果[1]。既往研究表明，肠道菌群的代谢产物如短链脂肪酸、氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）、脂多糖和吲哚酸盐等，可增加细胞黏附分子、趋化因子的表达水平，诱发炎症反应，参与AS的病理过程[2]。调节肠道菌群丰度及其代谢物水平可能是干预AS的新的途径。白藜芦醇（resveratrol，RES）广泛存在于浆果、花生和葡萄酒中，是一种多酚类植物抗毒素，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用[3]。既往研究标明，RES可通过调节血脂、调控平滑肌细胞增殖迁移和抗氧化等途径干预AS[4-6]，但其内在机制尚未明确。本研究观察RES对AS模型大鼠肠道菌群丰度、TMAO和血脂水平的影响，从肠道菌群的角度探讨RES干预AS的潜在机制，以期为AS的防治提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂药品
Agilent 2100生物分析仪（美国Agilent公司），戊巴比妥钠（上海化学试剂厂，57-33-0），辅酶Q10片（卫材中国药业有限公司，H10930021），RES标准品（美国Sigma公司，R5010），Nova Seq 6000测序仪（美国Illumina公司），大鼠TMAO ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，ml058831），肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA检测试剂盒（联科生物有限公司，EK282/3-01），白细胞介素（IL）-6 ELISA试剂盒（联科生物有限公司，EK210/4-03），7020型全自动生化分析仪（日本日立公司），高脂高胆固醇纯化饲料（中国江苏协同生物工程有限公司，XT109C），磁珠法粪便基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，DP180427）。
1.2 实验动物
SPF级雄性SD大鼠24只，体质量（150±15）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物质量合格证号：3707262411000409267；许可证号：SCXK（鲁）20220006。将大鼠随机分笼饲养，动物房温度控制在20~25℃，自由饮水和摄食，适应性饲养1周。
1.3 方法
1.3.1 动物分组、造模、给药和采样
将24只大鼠随机分为对照组、AS组和RES组。对照组大鼠喂普通饲料。AS组和RES组大鼠给予高脂饲料（主要成分含20%脂肪、1.25%胆固醇、0.5%胆酸钠）喂养2周后予造模处理。参照既往研究[7]，采用高脂饲料喂养联合主动脉球囊损伤法复制AS大鼠模型。大鼠用3%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔麻醉，腹部剃毛，碘伏消毒，沿腹部正中切口，游离并显露腹主动脉下段。Seldinger穿刺法穿刺腹主动脉，置入2 mm×20 mm冠状动脉球囊导管，将球囊头端置于肾动脉水平，注入生理盐水将球囊充盈，维持压力在4~6大气压，牵拉球囊至穿刺点处，释放球囊，再次送入球囊、充盈并牵拉，反复操作3次。操作结束后，以8-0无损伤丝线缝合穿刺点。逐层关腹，洒青霉素钠预防感染，保温待其苏醒后，单独饲养。造模次日，给予对照组和AS组大鼠5 mg/（kg·d）生理盐水灌胃。参照既往研究[8]，给予RES组大鼠5 mg/（kg·d）RES灌胃。给药4周后，大鼠禁食不禁水12 h，自腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉取血，用全自动生化仪测定大鼠血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）水平，ELISA法检测TNF-α、IL-6、TMAO水平。游离整段腹主动脉置入4%多聚甲醛固定液，石蜡包埋、切片，苏木素-伊红染色，镜下观察血管壁及内膜的病理结构。用灭菌冻存管收集结肠内粪便2~3粒，在-80℃条件下保存，送至实验室测序。
1.3.2 宏基因组检测与分析
使用磁珠法提取每个大鼠粪便样本的总DNA。将质量合格的DNA样品进行文库制备。使用Agilent 2100生物分析仪和Q-PCR进行文库检测。库检合格后，上机测序。使用KneadData软件对原始数据进行质控和去宿主，使用Kraken2和自建的微生物核酸数据库（筛选NCBI NT核酸数据库和RefSeq全基因组数据库中属于细菌、真菌、古菌、病毒的序列）来计算样本中所含有物种的序列数，再用Bracken估计样本中物种的实际丰度。
1.4 统计学分析
使用SPSS 26.0对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验，使用R软件（Version 4.1.2）进行Alpha多样性指数和相对丰富组间差异分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 数据质量控制
对原始的测序数据进行质控和去宿主序列等预处理，结果见表1。质量分高于20（Q20）的碱基所占比例不小于98%，质量分高于30（Q30）的碱基所占比例不小于95%，提示测序数据质量好，可用于后续分析。
表1测序数据预处理结果
2.2 各组大鼠血脂水平比较
与对照组比较，AS组大鼠血清TC、TG水平升高，RES组大鼠TG水平升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与AS组比较，RES组大鼠血清中TC水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
表2各组大鼠血脂水平比较
注：a与对照组相比，P<0.05；b与AS组相比，P<0.05
2.3 各组大鼠TNF-α、IL-6和TMAO水平比较
与对照组比较，AS组大鼠TNF-α、IL-6和TMAO水平升高，RES组大鼠TNF-α、TMAO水平升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与AS组比较，RES组大鼠血清TNF-α、IL-6和TMAO水平降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。
表3各组大鼠TNF-α、IL-6和TMAO水平比较
注：a与对照组相比，P<0.05；b与AS组相比，P<0.05
2.4 各组大鼠主动脉病理学变化
对照组大鼠主动脉内皮细胞排列整齐，内弹力板结构规整，平滑肌细胞形态规则；AS组大鼠主动脉存在内膜损伤，内弹力板结构紊乱，部分血管平滑肌细胞存在炎症浸润；与AS组大鼠比较，RES组大鼠主动脉内皮细胞结构相对完整，内弹力板结构相对规则，平滑肌细胞形态相对规整，见图1。
2.5 各组大鼠肠道菌群结构比较
2.5.1 Alpha多样性分析
与对照组大鼠比较，AS组大鼠肠道菌群Shannon指数和Chao1指数降低；与AS组大鼠比较，RES组大鼠肠道菌群Shannon指数和Chao1指数升高，差异均有统计学意义（P<0.05），见图2。
图1各组大鼠主动脉组织病理学变化（HE染色，×100）
图2各组大鼠肠道菌群Alpha多样性指数比较
2.5.2 群落组成分析
在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主要优势菌群，其次为放线菌门（Actinobacteria）（图3A）。各组大鼠厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和尾噬菌体门（Uroviricota）相对丰度存在差异，与对照组大鼠比较，AS组大鼠厚壁菌门和放线菌门相对丰度下调，拟杆菌门和尾噬菌体门相对丰度上调；RES组大鼠厚壁菌门和放线菌门相对丰度下调，拟杆菌门相对丰度上调；与AS组大鼠比较，RES组大鼠厚壁菌门相对丰度上调，尾噬菌体门和拟杆菌门相对丰度下调，差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。
在纲水平上，芽孢杆菌纲（Bacilli）和拟杆菌纲（Bacteroidia）为主要优势菌群，其次为放线菌纲（Actinomycetia）（图3B）。各组大鼠放线菌纲、芽孢杆菌纲、拟杆菌纲、梭菌纲（Clostridia）、丹毒丝菌纲（Erysipelotrichia）和γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）相对丰度存在差异，与对照组大鼠比较，AS组大鼠放线菌纲、芽孢杆菌纲和梭菌纲相对丰度下调，拟杆菌纲、丹毒丝菌纲和γ变形菌纲相对丰度上调；RES组大鼠放线菌纲、芽孢杆菌纲和梭菌纲相对丰度下调，拟杆菌纲相对丰度上调；与AS组大鼠比较，RES组大鼠芽孢杆菌纲和梭菌纲相对丰度上调，拟杆菌纲、丹毒丝菌纲和γ变形菌纲相对丰度下调，差异均有统计学意义（P<0.05），见表5。
在属水平上，拟杆菌属（Bacteroides）和乳杆菌属（Lactobacillus）是主要优势菌属，其次是唾液乳杆菌属（Ligilactobacillus）和甲烷球形菌属（Methanosphaera），见图3C。与对照组大鼠相比，AS组拟杆菌属（Bacteroides）、埃希菌属（Escherichia）、鼠肠杆菌属（Muribaculum）和副拟杆菌属（Parabacteroides）相对丰度上调，双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）、唾液乳杆菌属（Ligilactobacillus）、罗伊氏乳杆菌属（Limosilactobacillus）、甲烷球形菌属（Methanosphaera）和罗氏菌属（Romboutsia）相对丰度下调；RES组大鼠拟杆菌属、埃希菌属相对丰度上调，双歧杆菌属、乳杆菌属、唾液乳杆菌属、罗伊氏乳杆菌属、甲烷球形菌属和罗氏菌属相对丰度下调；与AS组大鼠比较，RES组大鼠拟杆菌属、埃希菌属和鼠肠杆菌属相对丰度下调，双歧杆菌属、乳杆菌属、唾液乳杆菌属、罗伊氏乳杆菌属和罗氏菌属相对丰度上调；差异均有统计学意义（P<0.05），见表6。
图3各组大鼠物种组成结构柱状图
表4各组大鼠门水平肠道菌群差异物种分析
注：a与对照组相比，P<0.05；b与AS组相比，P<0.05
表5各组大鼠纲水平肠道菌群差异物种分析
注：a与对照组相比，P<0.05；b与AS组相比，P<0.05
表6各组大鼠属水平肠道菌群差异物种分析
注：a与对照组相比，P<0.05；b与AS组相比，P<0.05
3 讨论
AS发生和发展涉及脂质浸润、氧化应激和慢性炎症反应等多个病理过程。脂质代谢异常是AS早期的主要病理特点，巨噬细胞吞噬脂蛋白后转化为泡沫细胞，可促进AS进展[9]。RES可通过调节脂质代谢发挥抗AS的作用。Cao等[10]进行荟萃分析发现，RES可以显着降低TC（均数差=-10.28，95%CI:-13.79~-6.76，P<0.001）、TG（均数差=-856，95%CI：-12.37~-4.75，P<0.001）和低密度脂蛋白胆固醇（均数差=-5.69，95%CI：-11.07~-0.31，P=0.038）水平。本研究结果显示，RES可下调AS大鼠血清TC水平，但对TG水平无显著影响，可能与本研究中样本量较小有关。RES还可通过抑制炎症反应干预AS。研究发现，RES可缩小AS病灶面积，下调病灶组织中基质金属蛋白酶-9和CD40配体的表达水平，降低TNF-α和C反应蛋白的表达水平，并抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的调节活性发挥抗AS作用[11]。本研究结果显示，RES可降低AS大鼠血清TNF-α和IL-6的表达水平，与上述研究结果一致，提示RES可通过调节血脂代谢、抑制炎症反应等多途径干预AS。
近年来，随着对肠道菌群机制研究的深入，肠道菌群丰度及其代谢产物与AS的相关性逐步得到证实。研究表明，肠道菌群紊乱及其代谢产物短链脂肪酸的减少可激活肠道免疫炎症过程，调节全身炎症反应，参与AS发病[12]。本研究结果显示，在门水平上，AS模型大鼠厚壁菌门和放线菌门相对丰度下调，拟杆菌门和尾噬菌体门相对丰度上调；RES可上调AS模型大鼠厚壁菌门相对丰度，下调尾噬菌体门和拟杆菌门相对丰度。在纲水平上，AS模型大鼠放线菌纲、芽孢杆菌纲和梭菌纲相对丰度下调，拟杆菌纲、丹毒丝菌纲和γ变形菌纲相对丰度上调；RES可上调AS模型大鼠芽孢杆菌纲和梭菌纲相对丰度，下调拟杆菌纲、丹毒丝菌纲和γ变形菌纲相对丰度。在属水平上，AS模型大鼠拟杆菌属、埃希菌属、鼠肠杆菌属和副拟杆菌属相对丰度上调，双歧杆菌属、乳杆菌属、唾液乳杆菌属、罗伊氏乳杆菌属、甲烷球形菌属和罗氏菌属相对丰度下调；RES可下调AS模型大鼠拟杆菌属、埃希菌属和鼠肠杆菌属相对丰度，上调双歧杆菌属、乳杆菌属、唾液乳杆菌属、罗伊氏乳杆菌属和罗氏菌属相对丰度。
乳杆菌属是有益菌，研究证实，乳杆菌属可通过影响调节性T细胞、辅助性T细胞和巨噬细胞亚群比例，发挥免疫调节作用，抑制炎症反应从而抵抗AS[13]。乳杆菌属为芽孢杆菌纲的属种，罗氏菌属为梭菌纲的属种，梭菌纲和芽孢杆菌纲均属于厚壁菌门。厚壁菌门是人肠道菌群的优势菌种，可分解从食物中获取的纤维素，形成短链脂肪酸，抑制炎症因子的表达水平从而对抗AS[14]。双歧杆菌是有益菌，目前已被证实可调节血糖、血脂，干预AS进展[15-17]。
拟杆菌属为拟杆菌纲的属种，隶属于拟杆菌门。既往研究显示，芪山无糖颗粒可以下调拟杆菌属的相对丰度，发挥降糖、调节血脂代谢等作用，治疗高脂血症[18]。但也有研究证实，AS模型小鼠拟杆菌门丰度显著降低[19]。拟杆菌门与AS的具体相关性仍有待进一步明确。埃希菌属、鼠肠杆菌属为γ变形菌纲的属种，隶属于变形菌门。研究发现，变形菌门的细菌存在于哺乳动物的肠道中，少量的变形菌门细菌不会对哺乳动物的健康产生影响，但当其丰度增加时，会影响肠道菌群的结构，诱发炎症反应[20]。另有研究证实，五指山小型猪AS模型肠道菌群中变形菌门丰度显著增加，影响脂质代谢，诱发炎症反应，导致AS发病[21]。丹毒丝菌纲为厚壁菌门的纲种，与AS的相关性研究较少。Teng等[22]通过孟德尔随机化分析发现，丹毒丝菌纲、丹毒丝菌科和丹毒丝菌目与血脂异常有较高的相关性。本研究还发现，AS模型大鼠尾噬菌体门相对丰度升高，但目前尚缺乏尾噬菌体门与AS的相关性研究，二者的相关性和机制有待进一步明确。
TMAO是肠道菌群代谢产物，可诱导活性氧生成，促进炎症因子表达，参与AS发病[23]。本研究结果表明，AS模型大鼠TMAO表达水平显著升高，RES可抑制TMAO的表达水平。
本研究存在一定的局限性：1）本研究采用5 mg/（kg·d）的RES剂量，参考了以往文献中已验证的有效剂量[8]，尽管该剂量已显示出显著的血脂调节和菌群调控作用，但剂量依赖性效应仍需进一步探究。2）AS的进展涉及慢性炎症、氧化应激等多因素交互作用，本研究的模型侧重于内皮损伤和脂质沉积的早期病理过程，可能不能准确地反映AS的病理生理学机制，后续研究中需结合更复杂的模型深入探讨RES对不同阶段AS的干预效果。3）由于实验动物与人类的肠道菌群结构和代谢途径存在显著差异，以及RES的生物利用度较低等原因，RES抗AS的临床转化仍面临挑战，未来或可探索新型递送系统或联合用药策略以提升疗效。
综上所述，RES可调节AS模型大鼠血脂代谢，抑制TNF-α和IL-6表达，降低TMAO的水平，改善AS，上述作用可能与RES调节肠道菌群有关，研究结果可为AS的治疗和预防提供思路。