摘要
目的：利用非靶向代谢组学寻找脓毒症伴急性肺损伤（ALI）特异性代谢标志物和代谢途径，为临床诊疗提供新的依据。方法：采用超高效液相色谱/质谱联用仪分别对脓毒症伴ALI组（23例）、不伴ALI组（14例）及同期体检健康人（15例）的血清样本进行代谢组学检测，并对差异代谢物及代谢途径进行统计分析。结果：与脓毒症不伴ALI组比，脓毒症伴ALI组的炎症相关代谢物7-氧代胆固醇、马尿酸浓度增加，抗氧化代谢物马特果酚7-O-葡萄糖苷、扁柏酚葡萄糖苷、去甲基阿兰吉苷浓度增加，能量相关代谢物PGK1、DL-3-羟基己酸和异纤维蛋白B3浓度增加，抗炎代谢物甘氨脱氧胆酸、抗氧化代谢物2-羟基雌酮、内源性代谢物N-(3-氯苯甲酰基)甘氨酸及药物(M)-生物碱浓度均降低。显著变化的代谢途径有雌醇代谢、氨回收、组氨酸代谢和胆汁酸代谢。结论：用非靶向代谢组学方法在脓毒症伴ALI患者血清中筛选出具有显著变化的炎症相关代谢物、抗氧化代谢物、能量相关代谢物及抗炎代谢物等，该组患者存在雌醇代谢、氨回收、组氨酸代谢和胆汁酸代谢途径紊乱。
关键词
Abstract
Objectives Using non-targeted metabolomics methods to search for specific metabolite markers and metabolism pathways in sepsis with acute lung injury (ALI), providing new basis and evidence for clinical diagnosis and treatment. Methods Metabolomics analysis was performed on serum samples from three groups of subjects with sepsis accompanied by ALI (23 cases), without ALI (14 cases), and healthy individuals (15 cases) during the same period using ultra-high performance liquid chromatography/mass spectrometry（UPLC/MS）. Differential metabolites and metabolism pathways were statistically analyzed. Results Compared with the sepsis without ALI group, the sepsis with ALI group showed an increase in the concentrations of inflammation related metabolites 7-oxocholesterol and hippuric acid, antioxidant metabolites 7-O-glucoside, kaempferol glucoside, and demethylangin, energy related metabolites PGK1, DL-3-hydroxyhexanoic acid, and fibrinogen B3, and a decrease in the concentrations of anti-inflammatory metabolites glycerodeoxycholic acid, antioxidant metabolite 2-hydroxyestrone, endogenous metabolite N-(3-chlorobenzoyl) glycine, and drug (M)-alkaloids. The metabolism pathways with significant changes include estradiol metabolism, ammonia recovery, histidine metabolism, and bile acid metabolism. Conclusion Non-targeted metabolomics methods were used to screen for inflammation related metabolites, antioxidant metabolites, energy related metabolites, and anti-inflammatory metabolites with significant changes in the serum of sepsis with ALI patients. At the same time, there were disturbances in estradiol metabolism, ammonia recovery, histidine metabolism, and bile acid metabolism pathways in this group of patients.
Keywords
脓毒症是感染引起的宿主反应失调进而导致危及生命的器官功能障碍[1]。脓毒症是重症监护病房（ICU）患者死亡的常见原因之一，发病率和病死率高[2-4]。肺部是脓毒症易损伤的靶器官，急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是脓毒症患者常见的严重并发症，其发病机制复杂，有研究显示，脓毒症患者中约68.2%合并ALI，90 d病死率约为35.5%[5]。因此，寻找评估脓毒症ALI的新型生物标志物对疾病的早期识别、干预治疗及预后具有重要意义。本研究基于超高效液相色谱/质谱（UPLC/MS）探究脓毒症ALI的代谢组学变化，力求寻找到新的代谢标志物及相关代谢路径。
1 材料与方法
1.1 一般资料
筛选2022年7月—2023年10月就诊于该院的脓毒症患者的37例，分为脓毒症伴ALI组（23例）、脓毒症不伴ALI组（14例），同时选取15例健康成人作为对照组。本研究经天津市南开医院伦理委员会批准（批号：NKYY-YXKT-IRB-2024-088-01）。
1.2 纳入及排除标准
1.2.1 纳入标准
脓毒症不伴ALI组：年龄>18岁的成年患者，入住ICU并根据脓毒症诊断标准sepsis 3.0[1]被临床诊断为脓毒症的患者，入住ICU 48 h内登记。脓毒症伴ALI组在满足上述标准的基础上还需满足如下相关诊断标准[6]，包括：1）有相应原发疾病或相关诱因及危险因素；2）有呼吸窘迫症状；3）氧合指数（PaO2/FiO2）≤300 mmHg；4）肺动脉嵌入压（PAWP）≤18 mmHg，或临床除外心源性因素；5）X线胸片显示双肺浸润。
1.2.2 排除标准
1）合并恶性肿瘤患者；2）免疫功能低下患者，或近2周内使用糖皮质激素或免疫抑制药等其他可能改变机体免疫功能药物者；3）既往有较严重的凝血功能障碍者；4）既往有较严重的脏器功能不全者；5）妊娠期或哺乳期妇女；6）原发疾病进一步进展者。
1.3 标本采集
受试者的血液标本使用离心机以4000 r/min离心10 min后收集血清，放入-80℃的冰箱中保存备用。
1.4 仪器与试剂
超高效液相色谱/质谱联用仪（美国赛默飞世尔科技公司）；冷冻离心机（德国艾本德股份有限公司）；XW-80A涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂）。色谱纯乙腈及甲醇（美国赛默飞世尔科技公司）；乙酸铵（美国sigma-aldrich公司）；ddH2O2（北京屈臣氏公司）；甲酸（美国ACS恩科化学公司）。
1.5 代谢组学分析
吸取100 μL血清样品，加入400 μL冰乙腈沉淀蛋白，离心10 min（离心半径10 cm，14000 r/min），离心后吸上清，吹氮气进行干燥，加入80%的甲醇100 μL进行复溶，待检，详细步骤参考王靖阳等研究[7]。
1.6 色谱条件选择
U3000超高效液相系统，2.1 mm×100 mm，1.8 μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（D）作为流动相，详细步骤参考王靖阳等研究[8]。
1.7 质谱条件选择
采用Thermo Fisher Q-Orbitrap MS（Q-Exative）系统，高能电喷雾离子源（HESI源）作为离子源，Fullms/dd-ms2模式扫描，正、负离子模式下同时进行采集，详细步骤参考文献[7]。
1.8 数据处理
采用SPSS22.0软件对数据进行统计分析。正态分布计量数据用表示，多组比较采用F检验；非正态分布计量数据用M（P25，P75）表示，多组比较采用秩和检验；计数资料采用例（%）表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。基础分析包括数据的预处理，多元变量统计分析包括主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）等；差异化合物筛选和鉴定可选择数据分析；差异代谢物的层次聚类分析；差异代谢物的相关性分析。原始数据包含12个质控（quality control，QC）样本和实验样本。
2 结果
2.1 三组基本信息比较
脓毒症伴ALI组、脓毒症不伴ALI组和健康对照组的性别、年龄无统计学差异，脓毒症伴ALI组的PaO2/FiO2低于脓毒症不伴ALI组，器官功能衰竭评分（SOFA）评分高于脓毒症不伴ALI组，差异有统计学意义（P<0.05） 见表1。
2.2 脓毒症伴ALI组与不伴ALI组代谢组学分析
52 例受试者共鉴定出代谢物834种，127种代谢物可区分脓毒症组和健康对照组，34种代谢物可区分脓毒症伴ALI组与不伴ALI组。随即进行PCA分析结果显示：脓毒症组与健康对照组比，分离趋势明显，组内分布集中，表明脓毒症组与对照组有明显差异，但脓毒症伴ALI组与不伴ALI组无明显差异，见图1。
表1脓毒症伴ALI组、脓毒症不伴ALI组和健康对照组的一般资料比较
注：a与健康对照组比较，P<0.05；b与脓毒症不伴ALI组比较，P<0.05
图1PCA得分散点图
为了进一步筛选各组间差异，进行OPLS-DA分析，发现脓毒症伴ALI组与不伴ALI组有进一步的分离。为检查是否存在过拟合，随机分组，进行200次置换检验该模型，本次建立的OPLS-DA模型不存在过拟合现象，可以准确描述数据，见图2。
2.3 脓毒症伴ALI组与不伴ALI组的差异代谢物分析
基于OPLS-DA分析的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）识别和揭示各组各离子含量具有差别的代谢物基础上，进行火山图分析结果显示，两组相比，浓度增加的代谢产物主要有：7-氧代胆固醇、马特果酚7-O-葡萄糖苷、PGK1、DL-3-羟基己酸、去甲基阿兰吉苷、扁柏酚葡萄糖苷、马尿酸、异纤维蛋白B3等，浓度下降的主要代谢产物有：甘氨脱氧胆酸、2-羟基雌酮、N-（3-氯苯甲酰基）甘氨酸和（M）-生物碱，见图3。
此外，以log2FC的绝对值降序排序取前40个化合物，对血清样本进行热图分析，结果显示各组的生物标记物相对变化趋势，蓝色表示增加，红色表示减少，见图4。
2.4 脓毒症伴ALI组与不伴ALI组的通路富集分析
通过MetaboAnalyst网站进行通路富集分析，通过差异代谢物来筛选相关代谢通路。不伴ALI组与健康对照组相比，显著相关的前22条代谢途径包括胆汁酸生物合成、苯乙酸代谢、丙酮醛降解和色氨酸代谢等，见图5。脓毒症伴ALI组与不伴ALI组相比，显著相关的前4条代谢途径为雌醇代谢、氨回收、组氨酸代谢和胆汁酸代谢，见图6。
图2有监督的OPLS-DA分析结果置换验证图
图3差异代谢物筛选火山图
图4差异代谢物热图
3 讨论
脓毒症伴ALI的发病机制复杂，病死率高[5]，寻找其特异性生物标志物，对准确评估脓毒症ALI的发生发展具有重要意义。目前传统标志物如降钙素原和C反应蛋白已被证明可用于脓毒症的诊断和监测，但特异性较低[8]。近年来代谢组学技术广泛应用于脓毒症ALI生物学标志物的筛选及建立中，还可以用于区分不同疾病表型[9]。脓毒症可诱发机体的代谢变化和能量代谢障碍[10]，运用代谢组学研究脓毒症ALI相关生物标志物有较好的应用前景和优势。
血清代谢特征的变化先于器官功能障碍，氨基酸、脂肪酸等代谢产物浓度与病情严重程度有一定相关性，脓毒症患者体内代谢紊乱现象可能与病情严重程度存在一定关联[11-12]。研究表明，与健康对照组相比，脓毒症患者血清中氨基酸、脂肪酸、葡萄糖等代谢产物含量明显升高[13]。另有研究发现，脓毒症患者的丙氨酸、谷氨酸及甘氨酸等氨基酸类浓度显著升高，证实了脓毒症患者体内发生了严重的代谢紊乱现象，提示血清代谢物浓度变化可能是判断脓毒症病情严重程度的重要指标之一[14]。
图5脓毒症不伴ALI组与健康对照组差异代谢物通路富集分析
图6脓毒症伴ALI组与不伴ALI组差异代谢物通路富集分析
本研究采用UPLC/MS进行非靶向代谢组学研究，发现脓毒症伴ALI组与不伴ALI组之间血清代谢物存在显著差异，其中，7-氧代胆固醇、马尿酸等代谢物通常在炎症过程中产生，其升高反映了脓毒症伴ALI组患者体内炎症反应增强，指示免疫系统正在积极应对感染和组织损伤。研究发现，7-氧代胆固醇是胆固醇代谢产物，与肺疾病进展相关，氧代胆固醇水平在慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中有所升高，并参与诱导支气管相关淋巴组织的生成和免疫病理过程[15]。本研究中具有抗氧化性质的代谢产物如马特果酚7-O-葡萄糖苷、扁柏酚葡萄糖苷、去甲基阿兰吉苷水平升高，表明机体正在增强其抗氧化防御机制，以抵御由脓毒症伴ALI引起的氧化应激。磷酸甘油酸激酶1（PGK1）是糖酵解过程中催化产生ATP的代谢酶之一，在能量代谢中发挥重要作用[16]。本研究中，除了PGK1升高外，DL-3-羟基己酸和异纤维蛋白B3等代谢产物水平升高也与能量代谢途径的调整有关。在脓毒症伴ALI患者中，由于肺部气体交换受损，细胞面临缺氧环境，所以在脓毒症伴ALI导致的缺氧条件下，这些物质水平升高对于维持细胞能量代谢和功能至关重要。
甘氨脱氧胆酸在肝脏中合成，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的特性。甘氨脱氧胆酸可以通过激活法尼醇X受体等受体来调节炎症反应，抑制促炎细胞因子的产生，减轻脓毒症伴ALI中的炎症反应[17]。本研究中甘氨脱氧胆酸水平下降，说明患者也可能存在肝脏功能的损伤，可与胆汁酸代谢异常有关，同时也与患者中枢神经系统损伤、肝病和代谢紊乱有关。2-羟基雌酮雌酮在体内的代谢物之一，同时它也具有抗氧化性质，可以通过减少氧化应激来对脓毒症及急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等疾病产生影响[18]。本研究中2-羟基雌酮等性激素水平的变化说明机体的炎症反应与免疫系统功能受到了影响，其下降可能与免疫抑制和激素失衡有关。N-（3-氯苯甲酰基）甘氨酸和（M）-生物碱的减少与肝脏功能受损或药物代谢酶活性的改变有关，说明机体药物代谢能力下降及内源性化合物的代谢改变。
与脓毒症不伴ALI组相比，脓毒症伴ALI组的上述差异性代谢产物涉及炎症反应、氧化应激、能量代谢、需求改变以及激素水平变化，这几类差异代谢产物的浓度变化可能揭示了脓毒症伴ALI与脓毒症不伴ALI在机制方面存在一定差异，有助于监测疾病进展并寻找诊断或区分两类疾病的特异性生物标志物。
研究表明，差异代谢物和代谢通路分析有利于更深层次地研究ALI的发病机制，并为ALI的防治提供重要依据[19]。本研究中，脓毒症伴ALI组与不伴ALI组相比，显著相关的前4条代谢途径分别是雌醇代谢、氨回收、组氨酸代谢和胆汁酸代谢。雌醇代谢涉及到多种酶和途径，研究发现，雌激素能够显著改善脓毒症大鼠的肺功能，减少肺组织损伤，并通过减少肺组织中内质网应激标志蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶（PERK）的表达抑制内质网应激（ERS）来减轻肺损伤[20]。本研究中雌醇代谢与脓毒症及ALI的联系主要体现在炎症反应及免疫调节方面。雌激素治疗能降低血清中炎症因子的水平，这表明雌激素能通过调节免疫反应来减轻炎症，在脓毒症和ALI中，抗炎作用可能有助于减轻炎症反应和组织的损伤。雌醇代谢能调节免疫细胞的活性，包括T细胞和巨噬细胞，从而影响脓毒症和ALI的免疫反应。
研究表明血氨水平升高可引起脑部并发症，还加重脓毒症ALI患者的炎症水平和多器官功能障碍[21]。本研究中，氨回收代谢途径与脓毒症伴ALI有显著关联，可能是由于脓毒症伴ALI能导致肝脏功能障碍，进而影响氨的代谢和回收。ALI中，肺部的氨代谢会受到影响，进而影响肺部的炎症状态和修复过程。肠道微生物群可以产生、代谢及回收氨，肠道健康对于氨的平衡至关重要。脓毒症可能通过影响肠道微生物群的组成和功能来间接影响氨的代谢，当然这一推测需要进一步研究验证。
本研究发现组氨酸代谢有显著差异，可能与氧化应激、炎症反应和免疫调节相关。组氨酸代谢产物，如组胺和组氨酸代谢途径中的其他中间产物，可以作为信号分子参与炎症反应的调节。在脓毒症和ALI/ARDS中，NF-κB通路的激活与炎症介质的产生和细胞损伤有关[22]。此外，组氨酸还可以通过影响树突状细胞的成熟和功能来调节抗原呈递和免疫反应[23]。氧化应激是脓毒症和ALI/ARDS的关键病理机制之一。组氨酸代谢途径中的某些酶，也参与调节细胞内的氧化还原平衡。通过调节这些酶的活性，组氨酸代谢可能影响细胞对氧化应激的敏感性和耐受性。
此外，本研究还发现胆汁酸代谢有显著差异，脓毒症引起的全身性炎症反应会导致肝脏功能受损，影响胆汁酸的合成和分泌。这些改变增加肠道通透性，从而加剧全身性炎症和内毒素血症。胆汁酸代谢还有调节免疫细胞功能的作用，可以通过FXR信号通路抑制炎症细胞因子的产生，减少炎症反应，影响脓毒症伴ALI/ARDS的疾病进展[24]。此外，胆汁酸还可以通过调节能量代谢和葡萄糖稳态来影响免疫细胞的功能[25]。
本研究基于UPLC/MS利用非靶向代谢组学方法在脓毒症伴ALI患者血清中筛选出具有显著变化的炎症相关代谢物、抗氧化代谢物、能量代谢物及抗炎代谢物等，同时，存在雌醇代谢、氨回收、组氨酸代谢和胆汁酸代谢途径紊乱，这些有望成为脓毒症伴ALI诊断的特异性代谢标志物和代谢途径。