摘要
目的：探究桃核承气汤对热秘型便秘大鼠的肠道功能和菌群组成及丰度的影响。方法：将40只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为5组：对照组、便秘模型组、低剂量桃核承气汤干预组、高剂量桃核承气汤干预组、乳果糖阳性干预组，每组8只。适应性喂养1周后，对照组不给予药物干预，其他四组大鼠均使用热性中药结合肠蠕动抑制剂灌胃给药14 d诱导建立便秘模型，其中使用低剂量（10 g/kg）和高剂量桃核承气汤（20 g/kg）进行干预治疗，另外一组进行乳果糖干预作为阳性对照。28 d灌胃结束后，将大鼠放置代谢笼24 h，收集大鼠新鲜粪便，取肠道组织后采集相关数据进行统计分析，用16S rRNA高通量测序检测大鼠粪便中的微生物后行定量分析。结果：桃核承气汤干预后，便秘大鼠的粪便颗粒数、含水率及肠道炭末推进率均显著升高。16S rRNA测序结果显示，Verrucomicrobiae、Actinobacteria、Akkermansiaceae等有益菌群相对丰度升高。代谢组学研究发现组间代谢物差异明显（P<0.05），对相关统计代谢物进行和KEGG富集分析，结果显示筛选出的差异代谢物主要涉及6条代谢途径。结论：桃核承气汤可显著改善热性中药诱导的便秘模型大鼠的肠道功能，促进肠道微环境向健康状态转变，其作用机制可能与调节肠道菌群的结构及功能平衡有关。
Abstract
Objective To investigate the effects of Taohe Chengqi decoction on the intestinal function, composition and abundance of the intestinal flora in rats with heat-type constipation. Methods Forty SPF-grade female Wistar rats were randomly divided into 5 groups, with 8 rats in each group. The groups were set as the control group, the constipation model group, the constipation model + low-dose Taohe Chengqi decoction intervention group, the constipation model + high-dose Taohe Chengqi decoction intervention group, and the constipation model + lactulose positive intervention group. After one week of adaptive feeding, the control group was not given any drug intervention. In the other four groups, the rats were intragastrically administered with heat-natured traditional Chinese medicines combined with intestinal motility inhibitors for 14 days to induce the establishment of a constipation model. Among them, two groups were randomly set as experimental groups and were intervened and treated with low-dose and high-dose Taohe Chengqi decoction respectively, and another group was intervened with lactulose as a positive control. After the intragastric administration was completed for 28 days, the rats were placed in a metabolic cage for 24 hours, and fresh feces of the rats were collected. After taking tissues, relevant data were collected for statistical analysis. 16S rRNA high-throughput sequencing was used to detect the microorganisms in the feces of the rats, and quantitative analysis was carried out. Results After the intervention of Taohe Chengqi decoction, the number of fecal pellets, water content and intestinal charcoal powder propulsion rate of the constipated model rats increased significantly. The results of 16S rRNA sequencing showed that the relative abundances of beneficial flora such as Verrucomicrobiae, Actinobacteria, and Akkermansiaceae increased. Metabolomics studies found that there were obvious differences in metabolites between groups (P<0.05). KEGG enrichment analysis was carried out on the relevant statistical metabolites. The results showed that the screened differential metabolites were mainly involved in six metabolic pathways. Conclusion Taohe Chengqi decoction can significantly improve the intestinal function of constipated model rats induced by heat-natured traditional Chinese medicines and promote the transformation of the intestinal microenvironment towards a healthy state. Its mechanism of action may be related to regulating the structural and functional balance of the intestinal flora.
Keywords
功能性便秘（functional constipation，FC）是一种常见的胃肠道疾病，全球患病率约为15.3%[1]，在老年和女性人群中更为高发。其发病机制涉及肠道动力异常、内脏敏感性改变、神经内分泌调节紊乱及肠道菌群失衡等多因素[2]。FC的临床表现以排便困难、排便频率减少、粪便干硬及腹胀腹痛为主[3]。微生物组学研究为FC的发病机制提供了新视角[4]，还可通过调控代谢产物或免疫信号介导的“肠-肝轴”“肠-脑轴”来改善疾病[5-6]。中药也可以调节肠道菌群代谢物[7-8]，Zhou等[9]研究发现，助阳通便汤可通过调节短链脂肪酸水平降低炎症标志物，从而改善FC患者肠道菌群组成和肠道菌群代谢功能。
中医认为热邪可最终导致“瘀热互结”[10]，瘀血阻滞肠道脉络，致大肠传导失常，引发便秘。桃核承气汤是中医经典名方之一[11]，可起到逐瘀泻热、通腑泄热的作用，对“瘀热互结”导致的便秘疗效显著[12]。临床研究证实桃核承气汤在改善术后患者的并发症方面具有显著疗效[13-14]。而育龄期女性便秘临床常见，“瘀热互结”是其重要病机，针对此病机寻求更有针对性的治疗方式是当今育龄期女性便秘治疗的热点和难点，本研究旨在讨论桃核承气汤对雌性便秘大鼠肠道菌群的影响。
1 材料
1.1 实验动物
选取40只5~6周龄SPF级雌性Wistar大鼠，初始体质量（180±20）g，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，使用许可证号：SCXK（京）2021-0006。所有动物实验经天津中医药大学动物伦理委员会审核通过（审批号：TCM-LAEC 2024161s1026），饲养于该校实验动物中心屏障系统内。环境条件设为室温22~24℃，相对湿度50%~60%，光暗周期12 h/12 h。实验期间，动物自由摄取由该校实验动物中心统一供应的饲料及饮用水。将40只大鼠按照随机数字表分为对照组、模型组、低剂量桃核承气汤干预组、高剂量桃核承气汤干预组及乳果糖干预组，每组8只。
1.2 实验药物
便秘模型建立以附子（为黑附片）、干姜、吴茱萸、肉桂、胡椒五味中药等比组合，干预组为桃核承气汤方：桃仁12 g，大黄12 g，桂枝 6 g，甘草6 g（炙），芒硝 6 g。用法：上五味，以水七升，煮取二升半，去滓，内芒硝，更上火，微沸下火。水煎液制备流程：饮片经称重后10倍量蒸馏水浸泡30 min，在进行武火煮沸后文火煎煮60 min（重复2次），煎煮液经旋转蒸发浓缩至含生药浓度为20 mL/kg，进行灭菌（121 °C，15 min），然后置于0~4℃冰箱中保存。盐酸洛哌丁胺2 mg/mL现用现配，4℃避光保存，24 h内使用。所用中药均购自天津中医药大学第一附属医院中药房。盐酸洛哌丁胺胶囊2 mg×12粒（西安杨森制药有限公司，产品批号：H10910085），乳果糖（产品批号：H20244275）购于阿里健康大药房。
1.3 实验仪器与设备
使用TianGen磁珠法提取试剂盒（货号：DP712，北京天根生化科技有限公司）提取DNA样品，应用PacBio测序仪（型号：Sequel，美国PacBio公司）进行16s RNA检测；AB SCIEX代谢质谱仪（型号：TOF6600，AB SCIEX公司）进行代谢组学检测；Brukertimes蛋白质谱仪（型号：TOF PRO，赛默飞世尔科技公司）用于蛋白组学检测。其他主要仪器包括PCR仪（型号：Bio-rad T100，生产厂家：美国BIO-RAD公司）；电泳仪（型号：DDY-6C，北京市六一仪器厂）。
1.4 大鼠便秘模型建立
大鼠适应性饲养1周后，采用热性中药结合肠蠕动抑制剂以灌胃给药的方式进行造模[15-16]。给药的剂量（相当于20 g生药/kg和2 mg盐酸洛哌丁胺/kg）每日灌胃1次，连续给药14天。给药期间观察大鼠表型变化并进行统计，称量大鼠体重、24 h粪便干重和湿重3 d/次。称取阿拉伯胶50 g，加超纯水400 mL，磁力搅拌溶解后加热至沸腾，持续煮沸至溶液透明，加入活性炭25 g，每次煮沸10 min，共3次循环脱色冷却至室温后用超纯水定容至500 mL，经0.22 μm滤膜除菌，4℃避光保存[17]。
1.5 药物干预
按照体表面积换算系数法确定大鼠等效剂量[18]，1次/d，连续给药14 d。对照组正常进食饮水；便秘模型组给予热性中药，剂量为 20 mL/kg（附子、干姜、吴茱萸、肉桂、胡椒），盐酸洛哌丁胺2 mg/kg；低剂量桃核承气汤干预组：10 g/kg；高剂量桃核承气汤干预组：20 g/kg；乳果糖干预组：10 g/kg。
1.6 样本收集
末次干预后，收集24 h粪便样本，统计颗粒数并测定粪便含水率；禁食不禁水24 h后进行活性炭悬液灌胃（3 mL/只），0.5 h后麻醉大鼠并取血，无菌条件下完整摘取消化道，测量肠道总长度及炭末推进距离，计算肠道炭末推进率。
1.7 16s RNA高通量测序检测大鼠粪便中的微生物
基于有效数据进行降噪分析，生成扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）。根据 ASV分析结果，进行物种注释，得到对应的物种信息和丰度分布情况。同时，对ASV进行多序列比对，通过PCoA、PCA、NMDS等降维分析，探究不同样本或组别间群落结构的差异。
1.8 TM广靶代谢组学检测大鼠粪便中的差异代谢物
实验选取24个样品，分3组进行代谢研究。首先用非靶向技术鉴定代谢物，再结合广泛靶向技术分析，共发现2999个代谢物。利用UPLC-MS/MS平台、自建数据库和多变量统计分析研究样品间的代谢差异。
1.9 统计学分析
使用GraphPad Prism 9.0.0软件进行数据统计分析和图表绘制。使用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，计量资料以表示，满足正态分布，组间比较使用t检验和单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物造模结果
2.1.1 大鼠粪便颗粒数比较
与对照组比较，模型组大鼠粪便颗粒数明显降低（P<0.05）；与模型组比较，桃核承气汤低、高剂量干预组及乳果糖干预组大鼠的粪便颗粒数均升高（P<0.05），但三个干预组间的大鼠粪便颗粒数差异无统计学意义，见表1。
表1各组大鼠粪便颗粒数和肠炭末推进率比较
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
2.1.2 肠炭末推进率
与对照组比较，模型组大鼠小肠炭末推进率明显降低（P<0.05）；与模型组比较，桃核承气汤低、高剂量干预组及乳果糖干预组大鼠的小肠炭末推进率均升高（P<0.05），但三个干预组间的肠炭末推进率差异无统计学意义，见表1，图1。
图1各组大鼠肠炭末推进率比较
2.1.3 粪便含水率
与对照组比较，模型组大鼠粪便含水率显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，桃核承气汤低、高剂量干预组及乳果糖干预组大鼠的粪便含水率均显著增加（P＜0.05），见表2。
表2各组大鼠粪便含水率结果比较
注：a与对照组比较，P<0.05；b与模型组比较，P<0.05
2.2 16S rDNA肠道菌群分析
通过大鼠表型及数据统计，发现高剂量桃核承气汤干预组比低剂量干预组效果更加显著，筛选出对照组（C）、模型组（G）、桃核承气汤高剂量干预便秘模型（J）3组大鼠的新鲜粪便进行16S rDNA肠道菌群检测及分析。
2.2.1 微生物16S rDNA基因测序评估
各分组样品的横向波折线较宽并最终趋于平缓，说明样本构成中均匀且丰富，见图2A；随着测序深度的增加，OTU数目逐渐增加，并最终趋于平缓，表明数据量较为合理，见图2B。
图2Rank Abundance曲线和稀释曲线图
2.2.2 总体样品微生物多样性OTUs分析
为研究各样本物种组成，对所有样本进行OTUs聚类及物种注释。绘制成韦恩图，结果显示：C组、G组、J组共有356个OTUs，G组有62个OTUs，J组特39个OTUs，与正常组大鼠相比，便秘会使OTUs数目改变，见图3。
2.2.3 样本微生物群落多样性分析
利用Alpha Diversity法分析微生物群落多样性，主要是估计群落中包含物种的数目（丰度）。与对照组相比，便秘模型组大鼠的肠道微生物群落多样性明显降低，经高剂量桃核承气汤干预后，大鼠肠道微生物多样性显著升高，见图4。
图3物种组成韦恩图
图4样本微生物群落多样性分析图
2.2.4 大鼠肠道菌群微生物群落多样本比较
Beta多样性衡量不同微生物群落间的物种多样性差异。样本间距离显示组成和丰度的相似性。C组、G组和J组分离明显，表明便秘影响大鼠肠道菌群结构，桃核承气汤可优化这种结构，见图5。
图5主坐标分析图和非度量多维尺度分析图
2.2.5 桃核承气汤对热秘型功能便秘大鼠肠道菌群物种相对丰度的影响
选取各组在门（Phylum）水平上最大丰度排名前10的种水平菌群，生成物种相对丰度柱形图，见图6。大鼠肠道中的优势菌门为Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidota（拟杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）和Proteobacteria（变形菌门）。
图6相对丰度排名前10的门水平肠道菌群柱形图
根据物种注释结果，选取每个组在科（Family）水平上最大丰度排名前十名的物种，生成物种相对丰度柱形图。与C组相比，G组Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）相对丰度降低；经过桃核承气汤干预后，与G组相比，J组Akkermansiaceae（阿克曼氏菌科）的相对丰度升高，见图7。
图7相对丰度排名前10的门科水平肠道菌群柱形图
在属（Genus）水平的差异上，与C组相比，G组Lactobacillus相对丰度降低；经过桃核承气汤干预后，与G组相比，J组Blautia相对丰度升高，见图8。
图8相对丰度排名前十名的属水平肠道菌群柱形图
2.2.6 LEfSe分析
通过LEfSe（LDA Effect Size）分析对照组、模型组、高剂量桃核承气汤干预组的菌群差异。筛选有统计学显著性差异的物种（biomaker）绘制LDA值柱状分布图（图9A）、进化分枝图（图9B）。菌种的显著性差异主要来自厚壁菌门。
2.3 代谢组学分析
2.3.1 OPLS-DA得分图
根据OPLS-DA模型分析代谢组数据，绘制得分图观察不同组样本在得分图上的分布情况，不同组样本分离度越高，说明组间差异越显著，研究因素对样本的影响越大（图10A）。
2.3.2 OPLS-DA的S-plot图
OPLS-DA的S-plot图，横坐标表示主成分与代谢物的协方差，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，越靠近右上角和左下角的代谢物表示其差异越显著（图10B）。
2.3.3 代谢物含量差异动态分布
模型组与高剂量桃核承气汤干预组代谢差异情况，对比较组中代谢物进行差异倍数值计算，取排名前十的差异代谢物绘制代谢物含量差异动态分布图，见图11。
图9基于ASV的进化分支图和LDA值分布的柱状图
图10OPLS-DA得分图和OPLS-DA S-plot图
图11代谢物含量差异动态分布图
2.3.4 差异代谢物VIP值图
对模型组和桃核承气汤干预组比较中基于筛选标准鉴定得到的差异代谢物，选择在OPLS-DA模型中VIP值最大的前20个代谢物进行展示（图12）。
图12差异代谢物VIP值图
2.3.5 差异代谢物火山图
火山图（Volcano Plot）主要用于展示代谢物在对照组、模型组样品中的相对含量差异以及在统计学上差异的显著性，在两组差异代谢物中，上调差异代谢物显著多于下调差异代谢物（图13）。
图13差异代谢物火山图
2.3.6 差异代谢物KEGG富集分析
根据差异代谢物结果，进行KEGG通路富集分析，其中Rich Factor为对应通路中差异代谢物个数与该通路注释到的代谢物总数的比值，该值越大表示富集程度越大，这些差异代谢物主要富集在乙醛酸和二羧酸代谢、半乳糖代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、核苷酸糖的生物合成、突触小泡循环、氨基糖和核苷酸糖代谢、环磷酸腺苷（cAMP）等信号通路中（图14）。
图14差异代谢物KEGG富集分析
3 讨论
在功能性便秘患者中，热秘型占比颇高[19]。该类型便秘不仅导致患者排便障碍，还易引发口臭、痤疮等伴随症状，影响生活质量与心理健康，故热秘型便秘患者因并发症而就医的频率高于普通FC患者[20]。目前，热秘型FC的发病机制未完全明确，有效干预靶点也不清晰。现有治疗手段多为缓解症状，无法从根本上纠正肠道内环境紊乱，恢复肠道传导功能。
肠道菌群作为人体肠道微生态的核心组成部分，与便秘之间存在着极为密切且复杂的关联[21]。Pan等[22]研究证实，膳食纤维或益生菌可以缓解硬便，肠道微生物群的干预特异性变化与便秘缓解相关。肠道菌群失调与不同病因诱发的便秘存在显著关联，患者肠道菌群的多样性及群落结构均呈现特征性改变，表现为益生菌丰度降低、致病菌异常增殖等微生态失衡现象[23-24]。本研究发现，FC大鼠的肠道菌群呈现出多样性上升且组成紊乱的现象，各菌群的相对丰度出现异常变化，而桃核承气汤对这种因便秘引发的肠道菌群紊乱具有积极的调节作用，在一定程度上缓解了肠道菌群紊乱的问题。
本研究采用热性中药结合肠蠕动抑制剂成功诱导建立大鼠便秘模型。经桃核承气汤干预后，大鼠的热秘型便秘症状得到有效缓解。研究还选取了对照组、便秘模型组、高剂量桃核承气汤干预组进行16S rRNA肠道菌群分析发现，各组大鼠门水平上的优势菌群为厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门。便秘大鼠肠道菌群结构紊乱，表现为厚壁菌门和变形菌门相对丰度升高，拟杆菌门相对丰度降低。桃核承气汤干预后，菌群结构接近于健康状态。目前已有实验研究表明，嗜黏蛋白阿克曼氏菌可增强肠道屏障功能、调节免疫反应，其丰度增加可能有助于改善便秘症状[25]；Blautia能够参与物质代谢、调节免疫功能，其增多对肠道健康有益[26-27]。而Prevotellaceae与肠道炎症相关，其丰度降低可能减轻肠道炎症反应，利于便秘症状的缓解[28]。这表明桃核承气汤可能通过调节肠道菌群结构和多样性，促进有益菌生长，抑制有害菌增殖，改善肠道微生态环境，进而缓解便秘症状。最后，通过代谢组学分析OPLS-DA模型等方法[29]，揭示了三组样本间的代谢差异。OPLS-DA得分图显示不同组样本能明显分开，表明组间存在显著差异，桃核承气汤干预对样本代谢产生了重要影响。通过S-plot图、代谢物含量差异动态分布图、差异代谢物VIP值图、火山图等分析[30]，筛选出大量上调和下调的差异代谢物，并对其进行KEGG富集分析[31]，发现这些差异代谢物主要富集在多个与能量代谢、物质代谢和信号转导相关的通路中，有乙醛酸和二羧酸代谢、半乳糖代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、核苷酸糖的生物合成、突触小泡循环、氨基糖和核苷酸糖代谢、cAMP信号通路等，研究发现肠道菌群可利用乙醛酸和二羧酸代谢途径生成琥珀酸等物质，这些产物能进入三羧酸循环，为肠道菌群的生长和繁殖提供能量，保证菌群的正常生理功能和代谢活动[32]。桃仁、大黄作为桃核承气汤君药发挥着重要的作用，桃仁活血祛瘀，降低血液黏度、增加局部血流进而起到润肠的作用[33]，同时大黄可调节肠道菌群及代谢产物、促进肠道黏液分泌，以及增加离子通道、水通道蛋白、神经递质等物质的合成，促进肠道动力[34-35]。
综上，桃核承气汤可显著改善热性中药诱导的便秘模型大鼠肠道功能，促进肠道微环境向健康状态转变，其作用机制可能与调节肠道菌群的结构、菌群多样性及功能平衡有关，同时通过调节代谢通路影响机体代谢，最终发挥治疗便秘的作用。然而，本研究仍存在一定局限性，虽然发现了桃核承气汤对肠道菌群和代谢组的影响，但具体的分子机制尚未完全明确，肠道菌群与代谢通路之间的相互作用也有待深入研究。