摘要
目的：探讨谷胱甘肽过氧化物酶2（GPX2）对肺腺癌侵袭转移的影响及作用机制。方法：利用TCGA数据库分析肺腺癌（LUAD）转移癌及原发癌差异表达基因，利用GEPIA数据库分析差异表达基因在LUAD癌组织及正常组织中的表达，并分析GPX2在LUAD临床预后中的作用；用小干扰RNA转染实验敲低人肺腺癌细胞系A549及PC-9中GPX2的表达，用CCK-8和Transwell实验分别检测细胞相对活力和侵袭能力，并检测A549及PC-9细胞还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值及活性氧(ROS)水平，采用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理后检测A549及PC-9细胞相对活力和侵袭能力。结果：GPX2在LUAD转移癌中的表达水平明显高于原发癌，在癌中的表达水平明显高于正常组织，GPX2的高表达与LUAD的临床分期及总生存时间密切相关，预示着不良预后。敲低GPX2的表达可显著降低A549及PC-9细胞系的增殖及侵袭能力，降低GSH/GSSG比值，升高ROS水平；铁死亡抑制剂可逆转A549及PC-9细胞系中敲低GPX2对增殖、侵袭的抑制作用。结论：GPX2表达升高促进肺腺癌增殖及转移，这一作用与抑制铁死亡有关。GPX2有望成为早期预测肺腺癌转移的分子标志物。
关键词
Abstract
Objective To investigate the effect and mechanism of glutathione peroxidase 2 (GPX2) on the progression of lung adenocarcinoma metastasis. Methods The TCGA database was used to analyze differentially expressed genes and ferroptosis regulatory genes in metastatic and primary lung adenocarcinoma (LUAD) tumors; GEPIA database was used the to analyze the expression of differentially expressed genes in LUAD cancer tissue and adjacent tissues, and analyze the role of GPX2 in the clinical prognosis of LUAD; The small interfering RNA transfection experiment was used to knock down the expression of GPX2 in A549 and PC-9 cell lines, RT-qRCR and Western blotting experiments were used to detect GPX2 expression, CCK-8 experiments were used to detect the relative cell viability of A549 and PC-9 cell lines, Transwell experiments were used to detect the invasiveness of A549 and PC-9 cell lines, and the kit was used to detect the GSH/GSSG ratio and ROS level in A549 and PC-9 cell lines. The relative viability and invasiveness of A549 and PC-9 cells were measured after Ferrostatin 1, an iron death inhibitor, was used to target the iron death process. Results The expression level of GPX2 in LUAD metastatic tumors was significantly higher than that in primary tumors, and the expression level in cancer was significantly higher than that in adjacent tissues. The high expression of GPX2 is closely related to the clinical stage and overall survival time of LUAD, indicating poor prognosis. Knocking down the expression level of GPX2 can significantly reduce the proliferation and invasion ability of A549 and PC-9 cell lines, significantly reduce the GSH/GSSG ratio, and significantly increase the ROS level. At the same time, the use of ferroptosis inhibitors can reverse the proliferation and invasion inhibition effect of knocking down GPX2 in A549 and PC-9 cell lines. Conclusion The increased expression of GPX2 is an important molecular change in the metastasis of lung adenocarcinoma. GPX2 promotes the proliferation and invasion of lung adenocarcinoma through ferroptosis inhibition, and it is expected to be a molecular marker for early prediction of lung adenocarcinoma metastasis.
Keywords
据2020年全球癌症数据统计显示，肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤（除外女性乳腺癌），也是癌症死亡最常见的原因[1]。肺癌包括非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC，约占85%）和小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是NSCLC中最常见的组织学亚型，经常发生在外周肺组织中，约占NSCLC的70%和肺部肿瘤的40%[2-3]。近年来，各种新疗法层出不穷，如靶向肺腺癌驱动突变、靶向免疫检查点及其他抑制剂的开发，但晚期LUAD的1年生存率仍不足20%，这主要归因于其高浸润率和转移率[4-6]。因此，迫切需要进一步研究肺癌转移的机制，早期识别与转移相关的生物标志物，从而改善患者预后。
本研究基于转移癌及原发癌公共测序数据库，初步确定与LUAD转移的关键分子，并对其癌组织与正常组织的表达差异及在肺腺癌中的作用及其机制进行分析，以期为LUAD的发生进展及治疗提供新的分子靶点。
1 材料与方法
1.1 试剂及耗材
1640培养基、胎牛血清（FBS）、GSH/GSSG检测试剂盒购自美国Sigma公司，谷胱甘肽过氧化物酶2（GPX2）抗体（ab137431）购自美国Abcam公司，实时定量聚合酶链式反应（PCR）相关试剂购自日本Takara公司，细胞活力检测试剂CCK-8购自日本同仁公司，Lipotamin2000购自美国Invitrogen公司，小干扰RNA（siRNA，SR301932）购自美国Origene公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒均购自中国索莱宝公司。Ferrostatin-1（Fer-1）购自美国MedChemExpress公司。
1.2 细胞培养
人肺腺癌细胞系A549和PC-9均购自美国ATCC细胞库，通过短串联重复序列（short tandem repeat，STR）鉴定，传代次数50代以内。
1.3 生物信息学分析
从癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库（https://portal.gdc.com）获得LUAD的RNAseq数据和相应的临床病理信息，分析LUAD转移组（M1）与非转移组（M0）样本的基因表达差异。使用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）数据库对TCGA和GTEx数据集中GPX2和铁死亡调节基因的表达，以及GPX2在LUAD患者临床预后中的价值进行可视化验证。
1.4 小干扰RNA敲低实验
将A549细胞及PC-9细胞铺于6孔板中，加入含10%FBS的1640培养基，5%CO2，37℃培养。待细胞生长融合至60%时，去除原培养基，加入无血清1640培养基预培养2 h，随后将3 μL siRNA及3 μL Lipotamin2000加入细胞上清中混匀，在细胞培养箱中孵育6 h后，换为完全培养基进行培养，用于后续实验。siRNA序列如下：正向：5’-ACCTCGATCCTGAACAGTCTCAAGTATCAAGAGACTTGAGACTGTTCAGGATCTT-3’；反向：5’-CAAAAAGATCCTGAACAGTCTCAAGTACTCTTGATACTTGAGACTGTTCAGGATCG-3’。
1.5 实时定量PCR检测GPX2 mRNA表达量
用siRNA处理A549细胞及PC-9细胞24 h后，提取细胞总RNA，进行逆转录后，进行GPX2 mRNA检测，用ACTB作为内参。GPX2上游引物：5′-GAATGGGCAGAACGAGCATC-3′；GPX2下游引物：5′-CCGGCCCTATGAGGAACTTC-3′；ACTB上游引物：5′-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3′；ACTB下游引物：5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。
1.6 Western blotting检测GPX2蛋白表达量
siRNA处理A549细胞及PC-9细胞48 h后，裂解细胞收取细胞蛋白并进行浓度检测，将30 µg 蛋白质装载在10%的SDS-PAGE凝胶上，在60 V的恒定电压下电泳1.5 h，并在300 mA的恒定电流下作用1 h，电转移到PVDF膜。5%脱脂牛奶行封闭处理后，分别使用GPX2及GAPDH一抗（1∶1000稀释）孵育PVDF膜，4℃摇床过夜。将PVDF膜置入二抗（1∶5000稀释）中进行孵育，常温摇床2 h。实验重复3次。最后，将膜进行化学发光检测，并使用Image J软件进行灰度值量化分析。
1.7 CCK-8实验检测细胞增殖能力
将siRNA处理24 h后的A549细胞及PC-9细胞消化处理后，进行细胞计数，使细胞浓度稀释为5000个/mL，向96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液，分别培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，吸净孔中的培养基，用1640培养基配置好的CCK-8测定液（含CCK-8溶液10 µL）添加到每个孔中，并在细胞培养箱中孵育3 h。使用酶标仪检测各孔在450 nm处的光密度（optical density，OD）值，并计算细胞相对生长活力。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.8 Transwell实验检测细胞迁移能力
将细胞分为对照组：未敲低GPX2且未加药处理组；敲低组：敲低GPX2；联合组：敲低GPX2并用2 μmol/L Fer-1处理24 h。处理后的A549细胞及PC-9细胞消化处理后，进行细胞计数，并使用无血清的1640培养基将细胞浓度稀释为 10 000个/μL，吸取200 μL细胞悬液，放入铺有50 μL Matrigel胶的细胞培养小室上室中，下室中加入500 μL完全培养基，将24孔板放入细胞培养箱中孵育24 h后，将小室取出进行清洗、固定、结晶紫染色，并在显微镜下拍照并计数。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.9 GSH/GSSG试剂盒检测GSH/GSSG比值收取
siRNA转染或铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（2 μmol/L）处理24 h后的A549细胞及PC-9细胞，定量至相同细胞总数后，进行细胞裂解，高速离心收取裂解的细胞上清，按照GSH/GSSG试剂盒实验步骤检测GSH及GSSG含量，使用酶标仪检测各组412 nm处的光密度（OD）值，并计算分析GSH/GSSG比值。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.10 活性氧检测试剂盒检测活性氧水平
将siRNA转染或铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（2 μmol/L）处理24 h后的A549细胞及PC-9细胞消化处理后，稀释至5000个/μL，向96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液，待细胞贴壁后，去除细胞培养液，加入100 μL无血清1640培养基稀释好的2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，1∶1000）。37℃细胞培养箱内孵育30 min后，用无血清细胞培养液洗涤细胞，并使用酶标仪检测96孔板各孔在525 nm处的OD值。每组设3个复孔，实验重复3次。
1.11 统计学分析
使用Graphpad Prism软件进行统计学分析，计量资料以表示，两组比较采用独立样本t检验，多样本比较采用方差分析。生物信息学分析采用R软件v4.0.3。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LUAD转移癌中GPX2的表达明显升高
从TCGA数据库中获得347例LUAD原发癌及25例LUAD转移癌的RNAseq数据和相应的临床病理信息，对差异基因进行分析，并使用Fold change≥2和校正后P<0.05绘制火山图，结果显示，LUAD转移癌较LUAD原发癌的基因表达有明显差异（图1A）。随后在GEPIA数据库中对差异基因进行癌组织及正常组织表达比较，结果显示，仅GPX2在肺癌中表达明显高于正常组织（图1B、1C），因此，选取GPX2进行后续研究。
图1LUAD转移相关基因筛选
2.2 GPX2高表达与LUAD更差的预后密切相关
通过TCGA获取的LUAD RNAseq数据和相应的临床病理信息进一步分析GPX2在LUAD中的临床意义，结果显示，LUAD预后较差的Ⅳ期患者样本中GPX2表达更高，且GPX2高表达组患者的总生存期（overall survival，OS）更短，见图2。
2.3 敲低GPX2表达抑制LUAD细胞的增殖及侵袭
与对照组相比，敲低组GPX2的mRNA及蛋白表达明显减少（图3A、3B），细胞增殖及侵袭能力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.001，图3C、3D）。
2.4 LUAD转移瘤中铁死亡抑制相关基因明显激活
本研究通过对上文收集的LUAD转移癌、原发癌及正常组织的基因表达矩阵进一步分析LUAD原发癌与转移癌中铁死亡调节基因的表达，结果显示，铁死亡抑制相关基因范科尼贫血互补组D2（FANCD2）、CDGSH铁硫结构域1（CISD1）、柠檬酸合酶（CS）、热休克蛋白家族A成员5（HSPA5）、ATP合酶膜亚基C位点3（ATP5MC3）、核糖体蛋白L8（RPL8）、谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、热休克蛋白家族B（小）成员1（HSPB1）、半胱氨酰-tRNA合成酶1（CARS1）在正常组织、原发癌、转移癌中的表达呈逐渐增加的趋势（图4）。
图2GPX2表达水平与LUAD临床分期及生存率的相关性
图3敲低GPX2表达抑制LUAD细胞增殖及侵袭
图4LUAD正常组织、原发癌、转移癌中铁死亡调节基因的表达分布
2.5 GPX2通过铁死亡抑制增强LUAD细胞的侵袭能力
敲低GPX2表达后，A549及PC-9细胞中GSH/GSSG比值明显降低，ROS水平明显升高，细胞表现为脂质过氧化状态（图5A、5B）。侵袭实验结果显示，铁死亡抑制可逆转敲低GPX2对A549及PC-9细胞侵袭能力的抑制作用（图5C）。
图5GPX2的铁死亡调控功能在LUAD细胞侵袭中的作用
3 讨论
肺癌的发生发展与基因的调控和异常表达密切相关[7]。本研究基于大数据生物信息学分析了LUAD转移癌及原发癌中的差异表达基因，发现GPX2在LUAD原发癌组织中的表达明显高于正常肺组织，在转移癌中的表达明显高于原发癌，证实GPX2表达升高与肺腺癌较差预后相关，并在细胞实验明确了GPX2对LUAD细胞生长转移的促进作用，提示GPX2可能是LUAD转移进展为晚期的关键分子。
谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）是细胞内的一种关键抗氧化酶，在抗氧化过程中起着重要作用，不仅可以清除生物活动过程中产生的ROS等氧化物质，消除氧化应激对细胞造成的损害，而且在癌症进展中也起着非常重要的作用。GPX2是GPX家族的成员之一，主要在胃肠道系统中表达，也在食道、肺和肝脏的上皮细胞中表达[8-9]。大量研究证实，GPX2在胃肠道肿瘤、肝肿瘤、胶质母细胞瘤、肺腺癌、乳腺癌和其他细胞中的表达显著上调[10-12]，这与本研究结果一致。本研究也证实了GPX2在LUAD中的促癌作用，并与LUAD较差预后相关。有文献报道GPX2在肿瘤发生发展中的作用机制主要包括：中和与肿瘤发展相关的ROS过量产生来促进肿瘤的存活和生长，通过炎症反应抑制肿瘤形成但促进已形成肿瘤的进展[13-14]。鉴于GPX2经典的氧化还原平衡功能，本研究进一步分析了LUAD转移癌、原发癌及正常组织中铁死亡调节相关基因的表达情况，结果显示铁死亡抑制相关基因在正常组织、原发癌、转移癌中表达为逐渐增加的总体趋势，特别是GPX4和SLC7A11，它们是铁死亡中的关键酶。GPX4利用GSH将脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇，从而保护细胞免受铁死亡的影响。GPX4的活性对于维持细胞膜的完整性至关重要，因为它能够清除膜脂过氧化氢产物。GPX4的失活或抑制会导致脂质过氧化物的积累，进而引发铁死亡。而SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸转运体系统的一个组成部分，它在铁死亡的调节中扮演着关键角色。SLC7A11通过调节胱氨酸的摄取，间接影响GSH的生物合成，进而影响GPX4的活性和细胞对铁死亡的抵抗力。这些结果提示GPX2在LUAD中可能发挥自身调节氧化还原功能，通过抑制铁死亡促进肿瘤的增殖和迁移能力，加速肿瘤转移。
肿瘤转移过程受不同调控途径中的多种因素的调节，比如生长因子、肿瘤细胞与间质细胞间的相互作用，microRNA及肿瘤微环境（如缺氧）等信号[15-16]。而铁死亡是一种近年来新发现的铁依赖性程序性细胞死亡形式，由不受限制的脂质过氧化和质膜破裂引起，表现为GSH向GSSG转化，GSH/GSSG比值降低，以及细胞内ROS水平升高。越来越多的证据支持铁死亡参与癌症转移。Li等[17]研究发现CST1通过OTUB4调节GPX1蛋白稳定性，抑制铁死亡并促进胃癌转移。Liu等[18]指出失调的胆固醇稳态导致对铁死亡的抵抗力，从而增加癌症的致瘤性和转移性。本研究结果显示，在敲低GPX2后，GSH/GSSG比值降低、ROS水平升高，而进一步使用铁死亡抑制剂后可恢复GPX2的促转移作用。
综上所述，GPX2在肺腺癌尤其是转移性肺腺癌中高表达，与患者的不良预后密切相关。GPX2可通过铁死亡抑制途径促进肺腺癌的发展及转移，有望成为早期预测肺腺癌转移的分子标记物和晚期转移性肺癌的新靶标。