摘要
目的：应用糖尿病大鼠溃疡模型观察芪柏愈疡油对糖尿病溃疡创面的治疗效果，并研究相关作用机制。方法：将80只SD雄性大鼠随机分为空白对照组（n=16）和糖尿病（n=64），将后者制备糖尿病大鼠溃疡模型，成模后随机分为模型组、芪柏愈疡油组、复方紫草油组。实验期间记录各组大鼠的创面大小变化。采用HE染色观察创面组织细胞形态学变化。免疫组化染色检测各组大鼠创面组织中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。结果：芪柏愈疡油组和复方紫草油组的创面愈合率明显高于模型组（P<0.05），芪柏愈疡油组的创面愈合率高于复方紫草油组（P<0.05）。芪柏愈疡油组和复方紫草油组的创面IL-6、TNF-α表达水平明显低于模型组（P<0.05），药物干预后7 d，芪柏愈疡油组创面组织中IL-6的表达明显低于复方紫草油组（P<0.05），芪柏愈疡油组与复方紫草油组的TNF-α表达无明显差异。结论：芪柏愈疡油能够减轻创面炎症反应，降低创面组织中促炎介质IL-6、TNF-α的过表达，进而促进溃疡创面的愈合。
Abstract
Objective To observe the therapeutic effect of Qibai Yuyang oil on diabetic ulcer wound by using diabetic rat ulcer model, and to study the relevant mechanism. Methods Eigty male SD rats were randomly divided into a blank control group (n=16)and a diabetes group (n=64),The latter was used to prepare ulcer model of diabetes rats, After modeling, the mice were randomly divided into model group, Qibai Yuyang oil group, and compound comfrey oil group.The rats were randomly divided into blank control group, model group, Qibai Yuyang oil group and compound comfrey oil group. The changes of wound size were recorded during the experiment. HE staining was used to observe the morphological changes of ulcer wound tissue. The expression of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by immunohistochemical staining. Results The wound healing rate of Qibai Yuyang oil group and compound comfrey oil group was significantly higher than that of model group (P<0.05). The wound healing rate of Qibai Yuyang oil group was higher than that of compound comfrey oil group (P<0.05). The expressions of IL-6 and TNF-α in wound tissue of Qibai Yuyang oil group and compound comfrey oil group were significantly lower than those of model group (P<0.05). At 7 days after drug intervention, the expression of IL-6 in the wound tissue of Qibai Yuyang oil group was significantly lower than that of compound comfrey oil group (P<0.05), but there were no significant differences in the rest. Conclusion Qibai Yuyang oil can reduce the inflammatory reaction of wound, reduce the overexpression of pro-inflammatory mediators IL-6 and TNF-α in wound tissue, and promote the healing of ulcer wound.
Keywords
糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是周围血管病变、周围神经病变及感染等因素综合作用的结果，常易导致皮肤溃疡，并出现不同程度的修复缺陷，成为下肢截肢及死亡的主要危险因素[1-3]，在我国己成为慢性皮肤溃疡的主要原因之一，全球发病率为6.3%，中国发病率为4.1%[4-5]，严重危害糖尿病患者的健康，对其治疗是临床急需解决的重要课题之一。临床应用中发现中药外用治疗糖尿病足溃疡能够促进创面的愈合，疗效确切[6-8]。高雅楠等[9]应用芪柏愈疡油治疗慢性创面患者的疗效显著，安全性高，无明显不良反应，临床总有效率为90%，具有较明显的实用价值。但其具体作用机制尚未明确。本实验以糖尿病大鼠溃疡创面为模型，对芪柏愈疡油促进糖尿病溃疡创面愈合的作用机制进行研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物
8～12周龄SD雄性大鼠80只，体质量（160±20）g，购自动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK（黑）2018-003。
1.2 实验药品
1）芪柏愈疡油：中药饮片由药剂科提供，黄芪、黄柏、大黄、白芷、赤芍、血竭等药物按一定比例熬制而成。2）阳性对照药：复方紫草油[武汉健民集团叶开泰国药（随州）有限公司，国药准字Z20044385]由古方传承而来，经过多年临床运用，在治疗糖尿病足及溃疡等方面效果明确。因此，此次实验选用复方紫草油作为阳性对照药。
1.3 实验试剂及器材
链脲佐菌素CAS18883-66-4、水合氯醛AL3560、TNF-α（IHC）bs-10802R、IL-6（IHC）bs-6309R等。GA-3血糖仪、DJ-500A电子天平、DSC-WX700数码相机、Thermo Histostar组织包埋机、Thermo HM 340E石蜡切片机、BX60研究型显微镜等。
1.4 实验方法
1.4.1 糖尿病大鼠模型的建立
将80只雄性SD大鼠随机分为空白对照组（NC组）16只，糖尿病组（DM组）64只。对DM组大鼠腹腔注射配置好STZ溶液，NC组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。大鼠尾静脉随机血糖值2次或2次以上≥16.7 mmol/L，则提示造模成功[5]。64只大鼠注射STZ 溶液后，死亡2只，4只大鼠未达到标准，剔除实验，糖尿病成模率为58/64=90.6%。继续喂养2周，中途死亡2只，最后存活的56只糖尿病大鼠随机分为3组，其中模型组（MG组）19只，芪柏愈疡油组（TG1组）18只，复方紫草油组（TG2组）19只。
1.4.2 糖尿病大鼠溃疡模型的建立
在大鼠背部正中偏左侧做2.0 cm×2.0 cm的圆形标记，剪去标记处全层皮肤，制备糖尿病大鼠溃疡模型。制作溃疡模型时，由于麻醉意外及应激能力下降等原因，MG组死亡2只，TG1组死亡1只，TG2组死亡2只。7d取材时，NC组8只，MG组8只，TG1组8只，TG2组8只；14 d 取材时，NC组8只，MG组7只，TG1组7只，TG2组7只。
1.4.3 给药方法
1）NC组与MG组：消毒清创后，用生理盐水外用于创面，无菌敷贴缠绕包扎。2）TG1组：消毒清创后，用生理盐水润洗创面，用芪柏愈疡油外用于创面，无菌敷贴缠绕包扎。3）TG2组：清创消毒后，用生理盐水润洗创面，用复方紫草油外用于创面，无菌敷贴缠绕包扎。每天换药1次。
1.4.4 取材
用药周期为14 d，分别于药物干预后7、14 d，取大鼠创面组织（包括创面周围正常皮肤组织），应用福尔马林固定，石蜡包埋切片。
1.4.5 研究指标
1）创面愈合率：于药物干预后0、7、14 d拍照记录创面，用Image J软件计算创面面积，计算创面愈合率=（初始创面面积—治疗后创面面积）/初始创面面积×100%[6]。2）应用光镜观察创面组织形态学变化；3）免疫组织化学染色观察创面组织中白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α的表达情况。
1.5 统计学方法
采用Graphpad 7.0软件绘图。采用SPSS22.0软件进行数据分析，以均数±标准差（）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Tamhane's T2法，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 创面愈合情况
药物干预后7 d，NC组大鼠创面面积明显缩小，创面肉芽组织鲜红，无异常分泌物；MG组大鼠创面面积无明显缩小，可见出血积渗出，创缘深；TG1组、TG2组与MG 组相比创面愈合速度较快，可见创面表皮新生，剩余开放创面略有渗出，肉芽组织色泽红润，TG1组优于TG2组。药物干预后14 d，NC组创面已基本愈合，创面颜色由粉色逐渐变白，新生表皮逐渐成熟、加厚；DM组大鼠仍存在较大面积的开放创面，颜色暗红，表皮爬行修复不明显；TG1组、TG2组创面已大部分愈合，创面干燥，无异常分泌物，创面呈粉红色，TG1组优于TG2组，见图1。
图1大鼠创面愈合情况
药物干预后7 d，NC组创面愈合率接近60%，TG1组与TG2组愈合较MG组好（P＜0.05），且TG1组效果优于TG2组（P＜0.05）；药物干预后14 d，NC组大鼠创面愈合率接近94%，TG1组与TG2组大鼠创面愈合良好，且明显优于MG组（P＜0.05），以TG1效果更佳，大鼠创面愈合率达到88.48%。见表1、2。
表1四组创面面积比较
注:a与NC组相比，P＜0.05；b与MG组相比，P＜0.05；c与TG1组相比，P＜0.05
表2四组创面愈合率比较
注:a与NC组相比，P＜0.05；b与MG组相比，P＜0.05；c与TG1组相比，P＜0.05
2.2 创面组织HE染色结果
药物干预后7 d，各组创面组织中的炎症细胞均有不同程度的浸润，同时伴有组织坏死、渗出。NC组创面炎性反应最轻，新生血管较多，成纤维细胞大量增殖，伴有少量坏死组织，创面被新合成的基质胶原填充；DM组创面炎症反应最重，创面表面可见大量中性粒细胞、巨噬细胞，下方渗出组织疏松，可见散在炎症细胞，新生血管少，表皮修复欠佳；TG1组、TG2组大鼠创面炎症细胞亦较多，但较DM组少，可见较多新生血管。药物干预后14 d，NC组创面组织间隙残存少许巨噬细胞，中性粒细胞几乎消失，胶原基质丰富，创面覆盖表皮逐渐加厚。DM组创面仍存在大量未被修复的开放创面，炎性细胞散在存在，成纤维细胞少，且形态欠佳，基质沉积不足；TG1组与TG2组血管明显消退，成纤维细胞较多，胶原纤维排列较为整齐，基质沉积、表皮覆盖较好，TG1组修复效果更佳，见图2。
2.3 各组创面组织中IL-6、TNF-α表达水平比较
药物干预后7、14 d，NC组创面中IL-6和TNF-α表达水平均明显低于DM组（P＜0.05），其中TG1组与TG2组的IL-6和TNF-α表达水平明显低于MG组（P＜0.05），TG1组创面中IL-6的表达水平明显低于TG2组（P＜0.05）；药物干预后14 d，TG1组与TG2组创面IL-6和TNF-α表达水平明显低于MG组（P＜0.05），见图3~6。
图2四组创面组织HE染色（×200）
图3四组IL-6免疫组化染色结果（×200）
图4四组IL-6水平比较
图5四组TNF-α免疫组化染色结果（×200）
图6四组TNF-α水平比较
3 讨论
创面愈合要经历止血、炎症、增殖和组织重塑及疤痕形成4个阶段[7]。炎症反应异常时，炎症细胞消散延迟，使修复过程停滞在炎症期，从而影响创面的愈合速度。TNF-α和IL-6等介导的过度炎症反应可损伤血管内皮细胞，导致创面愈合延迟[9]，IL-6是在机体发生感染和急性损伤的早期大量生成，其过表达可使血小板大量聚集，造成局部微循环障碍，最终影响创面的愈合。STAT3可以介导响应IL-6细胞因子家族的基因转录[8]，研究发现，抑制IL-6/STAT3信号通路可减少IL-6/STING通路引起的持续炎症，并改善糖尿病伤口修复。同时IL-6能促进TNF-α的生成，TNF-α刺激中性粒细胞，再次释放IL-6 [10]。在糖尿病溃疡创面组织中TNF-α的表达会异常升高，与IL-6等相互作用，募集更多的炎性反应细胞，形成糖尿病伤口的促炎环境，严重影响创面愈合[11]。
芪柏愈疡油具有益气活血、解毒生肌之功效。方中黄芪补气生血，托疮生肌，为君药，现代药理研究表明，黄芪有抗炎活性[12]，其提取物能通过抑制脂多糖引发的巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、一氧化氮（NO）等，提高机体抗炎反应。臣药黄柏清热燥湿、泻火解毒。大黄凉血解毒、疏通经络，黄芪、黄柏、大黄三者合用，补气而不助火，清热而不伤正。研究表明黄柏中的小檗碱成分能抑制IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，阻断IL-6/STAT3/NF-KB信号通路。大黄素能够通过抑制NF-κB p65磷酸化的信号通路，从而抑制巨噬细胞释放炎症因子[13]。赤芍、血竭、白芷共为佐药，白芷主治疮疡肿痛，善消肿排脓。白芷提取物可降低滑膜组织中NLRP3、IL-1、IL-6、TNF-α的蛋白及mRNA表达[14]。赤芍凉血活血祛瘀，芍药苷可抑制促炎介质如TNF-α、IL-1β等的上调，而抑制JNK、p38MAPK的活化。血竭具有生肌敛疮、活血止痛之功，现代药理表明血竭具有较强的抗炎活性，可降低颅脑损伤模型大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量，从而减轻炎症反应[15]。
综上所述，芪柏愈疡油可有效促进创面的愈合，在其干预后7、14 d时创面愈合率均优于复方紫草油，且能减少创面组织中IL-6、TNF-α的过表达。证明芪柏愈疡油可通过减少创面组织中炎症介质IL-6、TNF-α等的过表达促进炎症细胞消散，改善创面微环境，从而促进糖尿病溃疡创面的愈合。