摘要
目的：探究人参皂苷Rg3调控神经元PAS结构域蛋白2（NPAS2）影响宫颈癌细胞生物学行为的机制。方法：常规培养宫颈癌Hela细胞，用RNA pull-down 和RNA免疫沉淀（RIP）法检测长链非编码RNA X无活性特异性转录本（LncRNA XIST）与NPAS2之间是否存在互作；用不同浓度的人参皂苷Rg3（0、25、50、100和200 µmol/L）处理Hela细胞，采用MTT法检测细胞增殖率，Transwell法检测细胞侵袭力，流式细胞术检测细胞凋亡，并用RT-PCR检测细胞LncRNA XIST的相对表达量，RT-PCR和Western blot检测细胞NPAS2的mRNA和蛋白相对表达量。结果：在Hela细胞中发现LncRNA XIST能与NPAS2存在相互作用；与空白对照组相比，25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L及200 μmol/L 、人参皂苷Rg3组细胞增殖率、侵袭力明显减低，细胞凋亡水平明显升高（P<0.05），LncRNA XIST表达降低，NPAS2 mRNA和蛋白表达均升高，并呈剂量依赖性（P<0.05）。结论：人参皂苷Rg3能降低LncRNA XIST表达，促进NPAS2表达，进而影响宫颈癌细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学行为。
关键词
Abstract
Objective To explore the mechanism of PAS domain protein 2 (NPAS2) regulated by ginsenoside Rg3 on the biological behavior of cervical cancer cell. Methods Cervical cancer cell Hela was cultured regularly, and the interaction between LncRNA XIST and NPAS2 was detected by RNA pull-down and RIP. Cervical cancer cells Hela were then treated with ginsenoside Rg3 (0, 25, 50, 100 and 200 µmol/L) at different concentrations. Cell proliferation rate was detected by MTT assay, cell invasion was detected by Transwell, cell apoptosis was detected by flow cytometry, and the relative expression of LncRNA XIST was detected by RT-PCR. The relative expression of NPAS2 was detected by RT-PCR and Western blot. Results LncRNA XIST was found to interact with NPAS2 in Hela cells. Compared with the blank control group, the proliferation rate and invasion of ginsenoside Rg3 groups in 25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L and 200 μmol/L groups were significantly decreased, the apoptosis level was significantly increased (P<0.05). The expression of LncRNA XIST was decreased. The mRNA and protein expressions of NPAS2 were increased in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion Ginsenoside Rg3 can decrease the expression of LncRNA XIST, promote the expression of NPAS2, and then affect the biological behavior of cervical cancer cell proliferation, invasion and apoptosis.
Keywords
宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，严重威胁女性身心健康[1-3]。手术切除与化疗、放疗相结合是目前宫颈癌的治疗的基本方法，放疗和化疗具有一定的不良反应，并易引起耐药性[4-6]。研究发现，多种含人参的方剂在辅助宫颈癌患者化疗中具有增效减毒、强化机体免疫、降低肿瘤标志物水平及提高患者生存质量的作用[7-8]。其中，人参皂甙Rg3作为从人参根浸出液中分离出的一种有效成分，目前已经证实可以通过诱导宫颈癌细胞凋亡、促进细胞自噬、抑制细胞增殖和新生血管形成，影响其生物学功能，发挥治疗作用[9-11]。
长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一类不能编码蛋白或多肽且长度不超过200个核苷酸RNA分子，通过表观遗传、转录和转录后水平调控靶基因表达。研究证实，LncRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关[12-13]。LncRNA X无活性特异性转录本（X-inactive Specific Transcript，XIST）是哺乳动物中发现的第一个LncRNA，其参与调控肿瘤的增殖、侵袭、转移和放射抵抗，且与宫颈癌预后、分期和淋巴结转移相关[14-15]。神经元PAS结构域蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）是位于人类2号染色体，长度约为176.68 kB的核心节律基因，编码转录因子螺旋-环-螺旋PAS结构域[16]。研究发现，NPAS2可以影响乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生和预后[17-18]，但目前关于NPAS2与LncRNA XIST互作及其对宫颈癌的影响研究较少。本研究在研究NPAS2和LncRNA XIST互作的基础上，探讨人参皂苷Rg3影响宫颈癌细胞生物学功能的作用机制，以期为宫颈癌的治疗提供新的思路和方案。
1 材料与方法
1.1 细胞及试剂
人宫颈癌细胞株Hela（美国ATCC细胞库）。人参皂苷Rg3（批号：110804-201504，纯度99.5%）购于中国食品药品检定研究院，NPAS2、GAPDH单克隆抗体购自英国Abcam公司，pcDNA3.1-XIST由安徽通用生物股份有限公司合成，Pull-Down Kit购自广州伯信生物科技有限公司，RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒购自广州吉赛生物科技股份有限公司，MTT增殖检测试剂盒购自上海纪宁生物科技有限公司，SYBR®Green Master Mix、流式Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂购自北京碧云天生物技术有限公司，RPMI1640不完全培养基、10%胎牛血清、青链霉素双抗购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和分组
HeLa细胞采用RPMI 1640培养基培养，培养基中添加10%胎牛血清和1%青链霉素，置于37℃、含5%CO2、95%湿度的培养箱培养。细胞铺满瓶底80%时，经胰酶消化后进行1⁚4传代培养，每周换液2次，选择第4代对数期细胞进行实验。
1.2.2 RNA pull-down检测
使用Pierce™磁性RNA-蛋白Pull-Down 试剂盒进行RNA pull-down分析。将生物素化的bio-NC和bio-XIST转染到HeLa细胞中。转染48 h后，细胞裂解液与磁珠混合形成蛋白质-生物/RNA-磁珠复合物，用高盐洗脱得到蛋白质-生物/RNA复合物，分别命名为空白对照组和Probe组。以Input为阳性对照（Input组）进行蛋白质印迹，以测量NPAS2在蛋白质-生物/RNA混合物中的相对表达。
1.2.3 RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）试验
收集HeLa细胞并用RIP裂解缓冲液孵育。随后将抗NPAS2抗体和兔IgG抗体（阴性对照）加入细胞裂解物中。采用酸性苯酚/氯仿法分离纯化RNA，qRT-PCR检测LncRNA XIST的相对表达量。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖水平
收集HeLa细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，将其传代到96孔板，待贴壁后，分别用含25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L人参皂苷Rg3的培养液孵育细胞4 h。随后在药物作用12 h、24 h、48 h、72 h时加入MTT，持续4 h后，每孔加入10 μL MTT继续培养3 h，最后每孔加入150 μL DMSO，用酶标仪于490 nm波长处测定吸光度值，计算细胞增殖率。
1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭水平
首先稀释基质胶并覆盖在Transwell室，并在培养箱中培养6 h。上室接种200 µL细胞悬液，下室填充600 µL培养基，此过程中采用无血清培养基。继续细胞培养，加入PBS轻轻晃动，之后加入甲醇作用10 min，使用结晶紫这一染料对细胞进行染色。染色完成后，在光学显微镜下随机选择5个不同的视场计数入侵细胞的数量。
1.2.6 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡
按照每孔5×105个细胞，将HeLa细胞接种到6孔板中。一旦细胞贴壁，便向每个孔中加入了含有药物的培养基，48 h后离心收集，重悬细胞后取1×106个细胞。之后向沉淀的细胞中加入了一定的PBS溶液，并在暗室中加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI，作用10 min后离心，重悬细胞后进行流式细胞仪检测，采用FlowJo软件分析。
1.2.7 Western blot检测细胞中NPAS2蛋白的表达
按照RIPA法进行蛋白提取，收集完成作用的细胞，将细胞提取的蛋白质转移至新的离心管中，通过分光光度计对蛋白定量，之后根据浓度加入5×Lodding缓冲液煮沸变性。配置电泳凝胶之后上样电泳，先80 V至marker分开，后120 V至凝胶底部，按照预算蛋白的大小用切胶板将凝胶分离，按照滤纸-PVDF膜-胶-滤纸的顺序放入转膜仪，200 mA，2 h；之后用脱脂牛奶封闭3 h，加入兔抗人NPAS2多克隆抗体（1⁚500），4℃过夜；之后进行二抗（1⁚5000）孵育，室温2 h；最后在全自动曝光系统中进行曝光，检测结果采用Image J进行分析。
1.2.8 采用qRT-PCR检测细胞中NPAS2和LncRNA XIST的表达
按照上述分组，离心去上清，加入1 mL Trizol，静置2 min，按照Trizol法提取RNA，之后采用NanoDrop微量分光光度计对浓度进行测定，取出1 µg的RNA，向其中加入DEPC水补充到11 µL，在上述体系中加入1 µL Oligo（dT），65℃变性5 min，之后将其放于冰上，向体系中加入4 µL 5×Reaction缓冲液，1 µL水，2 µL 10 mmol/L dNTP Mix，1 µL逆转录酶（200 U/µL），均匀后放入恒温金属浴中42℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存。实时荧光定量PCR体系如下：10 µL SYBR®Green Master Mix，6.8 µL 灭菌水，0.4 µL Primer 1（10 µmol/L），0.4 µL Primer 2（10 µmol/L），0.4 µL Rox，2.0 µL模版DNA。lncRNA XIST上游5’-CGGTTGCTGAACTGCGTGCTAC-3’，下游5’-CTGTTTCTGTAATGCTGTCG-3’；U6上游5’-CCTGTGTCATGTCATAACGT-3’，下游5’-TTGCAACTGGTCCATGCAT-3’；NPAS2上游5’-ATCTCGTGTGGGCATGCTG-3’，下游5’-TTGGCGTGCGTGACAATGCT-3’，GAPDH上游5’-CTCTGTGTCCCATGCTGA-3’，下游5’-CCTTTCTGTCACTAACTGTGCA-3’。
1.3 统计学方法
使用SPSS 26.0统计学软件对数据进行分析，所有实验均重复3次，实验数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 宫颈癌细胞中LncRNA XIST与NPAS2的相互作用
RNA pull-down实验结果显示，与空白对照组相比，Probe组NPAS2蛋白表达水平显著升高（P<0.05），表明LncRNA XIST与NPAS2结合（图1）。RIP结果显示，与IgG组比较，NPAS2组中LncRNA XIST发生显著的富集（P<0.05），验证了LncRNA XIST与NPAS2蛋白存在相互作用（表1）。
图1RNA pull-down检测结果
表1各组细胞LncRNA XIST相对富集程度
注：a与IgG组比较，P<0.05
2.2 人参皂苷Rg3对宫颈癌细胞Hela增殖的影响
人参皂苷Rg3作用12 h时，对Hela细胞增殖率没有显著影响（P>0.05）。人参皂苷Rg3作用24 h、48 h和72 h时，与空白对照组相比，25 µmol/L、50 µmol/L、100 µmol/L和200 µmol/L的细胞增殖率明显降低，并呈现出剂量和时间依赖性（P<0.05），见表2。
表2各组细胞增殖率比较
注：a与空白对照组比较，P<0.05；b与25 µmol/L组比较，P<0.05；c与50 µmol/L组比较，P<0.05；d与100 µmol/L组比较，P<0.05
2.3 人参皂苷Rg3对宫颈癌细胞Hela侵袭的影响
人参皂苷Rg3对Hela细胞侵袭的检测结果显示，与空白对照组相比，25 µmol/L、50 µmol/L、100 µmol/L和200 µmol/L组侵袭细胞数明显降低，并呈剂量依赖性（P<0.05），见图2、表3。
图2各组Hela细胞的侵袭能力比较（×40）
表3各组细胞侵袭细胞数、凋亡百分比
注：a与空白对照组比较，P<0.05; b与25 µmol/L组比较，P<0.05；c与50 µmol/L组比较，P<0.05；d与100 µmol/L组比较，P<0.05
2.4 人参皂苷Rg3对宫颈癌细胞Hela凋亡的影响
与空白对照组相比，25 µmol/L、50 µmol/L、100 µmol/L和200 µmol/L组人参皂苷Rg3作用48 h的细胞凋亡率明显增加，并呈剂量依赖性（P<0.05），见图3和表3。
图3各组Hela细胞的凋亡水平比较
2.5 人参皂苷Rg3对宫颈癌细胞LncRNA XIST和NPAS2表达的影响
与空白对照组相比，25 µmol/L、50 µmol/L、100 µmol/L和200 µmol/L组人参皂苷Rg3作用48 h的细胞LncRNA XIST表达水平降低，NPAS2 mRNA和蛋白表达水平升高，并呈剂量依赖性（P<0.05），见表4、图4。
3 讨论
2020年，我国宫颈癌发病率约为7.72/10万，死亡率约3.76/10万，较1990年分别增加了199.07%和201.47%[4-5]。肿瘤转移、复发和耐药等因素导致宫颈癌晚期患者死亡率较高，其5年生存率低于40%[19]。因此迫切需要阐明其发病机制，寻找新的治疗靶点和更有效的治疗方法。
图4各组Hela细胞NPAS2蛋白的表达
表4各组细胞LncRNA XIST、NPAS2相对表达量
注：a与空白对照组比较，P<0.05； b与25 µmol/L组比较，P<0.05；c与50 µmol/L组比较，P<0.05；d与100 µmol/L组比较，P<0.05
研究证实，多种LncRNA表达上调或下调与肿瘤的发生发展密切相关，并被认为是有前途的生物学治疗靶点[20-21]。XIST是最早被识别的LncRNA之一，最初针对其研究主要集中在胚胎发育的启动激活上，近年的研究陆续发现LncRNA XIST的表达与肿瘤发生存在密切关联，其在结直肠癌、甲状腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的增殖、转移和耐药过程中发挥重要调控作用[11]。还有研究探讨了LncRNA XIST在宫颈癌中的表达和作用，结果表明LncRNA XIST的异常表达往往会直接干扰宫颈癌细胞的生长、增殖和侵袭。Berti等[22]通过对HPV16和HPV18介导的宫颈癌中竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络的综合分析表明，LncRNA XIST是一种关键的ceRNA，其在HPV介导的肿瘤发生中起重要作用。NPAS2可以调节癌基因和抑癌基因以及转录因子等的表达，从而调节肿瘤细胞的周期、凋亡、DNA损伤和修复、放化疗敏感性、侵袭和转移等多种生物学过程[16-17]。本研究发现LncRNA XIST与NPAS2在宫颈癌中存在相互作用，LncRNA XIST可能通过靶向NPAS2影响宫颈癌的生物学行为[23]。
人参皂甙Rg3有良好的抗癌活性，且具备毒性小、不良反应低等明显优势[24-25]。游可理等[26]研究发现，人参皂甙Rg3可以通过调控核因子（NF）-κB信号通路抑制宫颈癌细胞增殖和迁移；马欢等[27]研究显示人参皂苷Rg3通过PI3K/Akt信号通路影响宫颈癌细胞的增殖抑制和凋亡。本研究也发现，人参皂甙Rg3能呈剂量性地抑制宫颈癌细胞的生长和侵袭，并促进其发生凋亡，提示人参皂苷Rg3在宫颈癌细胞的生物活性方面发挥着关键的调控作用。本研究还发现人参皂苷Rg3可影响LncRNA XIST和NPAS2在宫颈癌细胞中的相互作用，即人参皂苷Rg3抑制LncRNA XIST表达，促进NPAS2 表达，并呈剂量依赖性。在今后的研究中，我们将利用相应的细胞和动物模型进一步深入分析NPAS2和LncRNA XIST之间的相互作用在宫颈肿瘤发生和发展的机制，从而为日后用于肿瘤预测和诊断的新靶标、肿瘤预防和治疗的新药物开发提供依据。
综上所述，人参皂苷Rg3以剂量依赖性方式抑制宫颈癌细胞Hela的增殖和侵袭，促进其发生凋亡，其作用机制与调控LncRNA XIST和NPAS2互作有关。