摘要
目的：研究杜仲对去卵巢骨质疏松症（OVX）大鼠骨的保护作用及机制。方法：将40只SD大鼠随机分为Sham组、OVX组、OVX+杜仲组、OVX+雌激素组，每组10只。Sham组大鼠仅切除卵巢旁部分脂肪组织，其余3组大鼠均切除双侧卵巢建立OVX模型。OVX+杜仲组给予杜仲颗粒剂2.76 g/kg灌胃，OVX+雌激素组采用炔雌醇10 μg/kg灌胃，Sham组及OVX组灌胃等量蒸馏水。显微计算机断层扫描（Micro CT）检测各组大鼠股骨小梁的微观结构[骨矿物质密度（BMD）、骨矿物质含量（BMC）、骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨表面体积比（BS/BV）和骨小梁分离度（Tb.Sp）]，小动物骨密度仪和骨强度检测仪检测股骨骨质情况，Western blot检测JAK2/STAT3通路蛋白含量，酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清骨标志物骨碱性磷酸酶（BALP）、前胶原I型肽（PINP）、骨钙蛋白（OCN）、胶原酶降解肽（CTX-1）含量。结果：OVX大鼠BMD、BMC、BV/TV和Tb.Th明显降低，BS/BV和Tb.Sp明显升高（P＜0.01），杜仲可显著提高BMD、BMC、BV/TV和Tb.Th，明显降低BS/BV和Tb.Sp（P＜0.01），同时增强骨密度和骨压碎力。同时，杜仲下调OVX大鼠血清BALP和CTX-1水平，上调PINP和OCN水平（P＜0.01）。机制探究显示，杜仲可调节OVX大鼠股骨中的JAK2/STAT3信号通路，降低p-JAK2和p-STAT3蛋白的相对表达水平（P＜0.01）。结论：杜仲可增强OVX大鼠的股骨骨质，减轻骨质疏松严重程度，其机制可能与调节JAK2/STAT3通路有关。
关键词
Abstract
Objective To investigate the protective effects and mechanisms of Eucommia ulmoides on bone in ovariectomized(OVX) rats. Methods Forty SD rats were randomly divided into four groups: sham group, OVX group, OVX+Eucommia group, and OVX+estrogen group, with ten rats in each group. The sham group underwent partial removal of the fat tissue adjacent to the ovaries, while the other three groups underwent bilateral ovariectomy to establish the OVX model. The OVX+Eucommia group received a gavage of Eucommia granules at a dosage of 2.76 g/kg, and the OVX+estrogen group was administered ethynyl estradiol at 10 μg/kg via gavage. The sham and OVX groups were given an equivalent volume of distilled water. Micro-computed tomography (Micro CT) was used to assess the microstructural parameters of the femoral trabecular bone in each group, including bone mineral density (BMD), bone mineral content (BMC), trabecular volume fraction (BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), bone surface-to-volume ratio (BS/BV), and trabecular separation (Tb.Sp). A small animal densitometer and bone strength testing apparatus were used to evaluate the bone properties of the femur. Western blot analysis was conducted to measure the levels of JAK2/STAT3 pathway proteins, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to determine the serum levels of bone markers: bone alkaline phosphatase(BALP),procollagen type I N-terminal propeptide (PINP), osteocalcin (OCN), and collagen type I C-terminal cross-linked telopeptide (CTX-1).Results The OVX rats exhibited significant reductions in BMD, BMC, BV/TV, and Tb.Th, alongside significant increases in BS/BV and Tb.Sp (P＜0.01). Eucommia ulmoides significantly improved BMD, BMC, BV/TV, and Tb.Th, and markedly reduced BS/BV and Tb.Sp (P＜0.01), while also enhancing bone density and strength. Furthermore, Eucommia ulmoides downregulated serum levels of BALP and CTX-1, while upregulating levels of PINP and OCN in OVX rats (P＜0.01). Additionally, mechanistic investigations revealed that Eucommia ulmoides modulated the JAK2/STAT3 signaling pathway in the femur of OVX rats, leading to decreased relative expression levels of p-JAK2 and p-STAT3 (P＜0.01). Conclusion Eucommia ulmoides can increase femoral bone quality and reduce the severity of osteoporosis in OVX rats, possibly through the modulation of the JAK2/STAT3 signaling pathway.
骨质疏松症是一种全身性骨病，主要表现为骨量低、骨微结构退化、骨脆性增高和骨折风险增加[1-2]。据中国疾病预防控制中心统计，2015年中国骨质疏松症患者总数超过1.6亿，患病率为12.4%，其中绝经后女性患者最多[3]。绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMPO）是临床上最常见的原发性骨质疏松症。由于衰老和雌激素减少等多种因素，绝经后妇女更容易患骨质疏松症（近80%）[4-5]。此外，PMPO的发病率高达50%左右，且逐渐呈年轻化趋势[6-7]。据《黄帝内经》“肾为先天之本，主骨生髓”，骨髓的生成受到肾精的支持，肾充足则骨质健康。中医认为，当七七之后女性肾气减弱，易导致精血不足的情况发生[8]。肾功能不足可能导致钙、磷等重要营养成分的流失，导致骨质疏松[9]。《本草纲目》记载“杜仲，能入肝补肾，补中益精气，坚筋骨，强志”。杜仲入肾经，有研究表明杜仲有补肾活血、缓解骨关节损伤的功效[10]，此外，杜仲提取物具有预防或治疗铅暴露导致的骨质疏松症的潜力，但其具体机制尚未明确[11]。本研究基于“杜仲入肾经，肾主骨”思想，采用去卵巢骨质疏松大鼠模型，探究杜仲对去卵巢骨质疏松症（ovariectomized osteoporosis，OVX-OP）大鼠的保护作用及潜在机制，为防治PMPO提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
采用成年雌性SD大鼠（6周龄，体质量180～220 g）购自北京华阜康生物公司。购入后适应性饲养1周，置于标准SPF级动物房，环境恒温23℃，湿度65%±5%，12 h光照/黑暗交替，自由取食与清洁饮水。动物实验按照《国家实验动物使用和护理准则实验动物的使用和护理指南》进行，并经医院动物伦理委员会批准（编号：2023002）。正式实验开始时，大鼠被随机分为4组：假手术组（Sham组）、卵巢切除组（OVX组）、卵巢切除+杜仲组（OVX+杜仲组）、卵巢切除+雌激素组（OVX+雌激素组），每组10只。
1.1.2 试剂耗材
杜仲颗粒（5 g/袋，贵州圣济堂制药有限公司，批号：Z52020412）；炔雌醇（HY-B0216）；麻醉剂：戊巴比妥钠（南京北鱼生物科技公司）；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、骨碱性磷酸酶（BALP）试剂盒（ml003415）、I型前胶原氨基端肽（PINP）试剂盒（ml058997）、骨钙素（OCN）试剂盒（ml002883）和I型胶原C端末端肽（CTX-1）试剂盒（ml059217）均购自上海酶联生物公司。一抗：抗-JAK2抗体（1∶1000），抗-p-JAK2抗体（Tyr1007/1008）（1∶500），抗-STAT3抗体（1∶2000），抗-p-STAT3抗体（Tyr705）（1∶1000），抗-β-actin抗体（1∶5000）；二抗：HRP结合抗体（1∶10 000）。
1.2 方法
1.2.1 建立OVX-OP大鼠模型
去卵巢模型参考既往研究[12]：各组大鼠禁食12 h后腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉。大鼠四肢固定为仰卧位，消毒皮肤，取距阴道口3.5 cm的白线作为切口，用手术刀纵向切开1.5～2 cm。除Sham组外，其余3组均摘除卵巢，常规消毒并缝合切口。为避免感染，所有大鼠术后连续3 d肌内注射青霉素G。建模4周后灌胃给药：Sham组及OVX组给予等量生理盐水；OVX+杜仲组给予2.76 g/kg杜仲溶液（杜仲颗粒剂2袋溶解于蒸馏水）；OVX+雌激素组给予炔雌醇10 μg/kg。每天1次，共12周，干预结束后，取各组股骨及血清进行下一步操作。
1.2.2 显微计算机断层扫描（Micro CT）
大鼠股骨小梁的微观结构用SkyScan1276系统以10 μm扫描整个股骨。通过灰度图像的距离变换，从二维图像获得三维图像。然后使用软件分析仪进行二维和三维分析。在感兴趣区进行骨微结构分析，最后确定骨矿物质密度（BMD）、骨矿物质含量（BMC）、骨小梁体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨表面体积比（BS/BV）和骨小梁分离度（Tb.Sp）。
1.2.3 骨质检测
骨密度检测：分别在造模前和干预12周后，使用小动物骨密度仪对大鼠右侧股骨近端的骨密度进行检测。骨压碎力检测：大鼠处死后取股骨，检测股骨质量；然后将股骨头放入YLS-16A骨强度检测仪中检测骨骼压碎力。
1.2.4 骨组织形态学检测
将大鼠股骨固定24 h 后，以10%EDTA脱钙。骨组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明化，包埋于石蜡，切片至6 μm。二甲苯脱蜡，梯度乙醇再水化，蒸馏水浸洗，苏木精染色20 min，冲洗，伊红染色10 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性胶封片。在光学显微镜下观察股骨组织的病理变化（放大100倍）。采用Image J软件计算小梁面积的百分比=小梁面积/总骨组织面积×100%。
1.2.5 Western blot检测JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平
按RIPA裂解液说明书于冰上提取大鼠股骨组织蛋白。BCA法测定蛋白浓度，30 µg蛋白经SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜。将PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭2 h，4℃一抗孵育过夜。TBST洗3次，室温二抗孵育1 h。ECL显色，拍照。Image J分析灰度，以β-actin为内参评估目标蛋白表达水平。
1.2.6 ELISA检测大鼠血清学骨标志物指标水平
将大鼠的血液收集到采血管中，然后在4℃以1000 ×g离心15 min。用移液管分离血清，进行后续测量。按照ELISA试剂盒的说明测定大鼠血清中BALP、 PINP、OCN和CTX-1的含量。
1.3 统计学分析
数据使用SPSS 24.0软件进行统计分析。资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 杜仲对OVX大鼠股骨小梁微结构的影响
二维和三维显微CT图像显示，杜仲可改善OVX大鼠模型中广泛的骨量丢失。与Sham组相比，OVX组的BMD、BMC、BV/TV和Tb.Th显著降低（P＜0.01），但BS/BV和Tb.Sp明显升高（P＜0.01），表明卵巢切除成功地构建了PMPO大鼠模型。与OVX组相比，OVX+雌激素组和OVX+杜仲组大鼠股骨的BMD、BMC、BV/TV和Tb.Th水平明显增加，但BS/BV和Tb.Sp水平下降（P＜0.01）；OVX+杜仲组虽然缓解效果较雌激素差（P＜0.05），见图1。
图1杜仲对去卵巢大鼠股骨小梁微结构的影响
2.2 杜仲对OVX大鼠股骨骨质的影响
造模前，各组大鼠骨质发育良好，平均密度无明显差异；在卵巢切除及药物干预12周后，OVX组大鼠骨密度较Sham组明显降低（P＜0.01），OVX+杜仲和OVX+雌激素组大鼠骨密度明显高于OVX组（P＜0.01，图2A）。在股骨质量和股骨压碎力上，OVX组较Sham组明显降低，OVX+杜仲组和OVX+雌激素组股骨质量和压碎力高于OVX组大鼠（P＜0.01，图2B、2C）。HE染色结果显示，Sham组骨结构正常，骨小梁厚度均匀，结构完整，小梁连接良好，脂肪细胞和骨细胞形态清晰（图2D）；OVX模型组中，松质骨结构发生改变，部分骨小梁明显细长或断裂，连接不完整；空泡脂肪细胞增多，与骨形态损伤一致，表明模型建立成功（图2D）。OVX+杜仲组和OVX+雌激素组的Tb.Ar均高于OVX组（P＜0.01，图2E）。
图2杜仲对OVX大鼠股骨骨质的影响
2.3 杜仲对OVX大鼠血清中骨标志物水平的影响
与Sham组相比，OVX组BALP和CTX-1水平明显升高（P＜0.01），而PINP和OCN水平明显降低（P＜0.01）；与OVX组相比，OVX+杜仲组和OVX+雌激素组血清中BALP和CTX-1水平明显降低，而PINP和OCN水平明显升高（P＜0.01），见图3。
2.4 杜仲对OVX大鼠股骨中JAK2/STAT3信号通路的影响
OVX组股骨中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平远高于Sham组（P＜0.01）。OVX+杜仲组和OVX+雌激素组股骨中p-JAK2和p-STAT3蛋白水平显著低于OVX组（P＜0.01），表明杜仲能通过调控OVX大鼠股骨中的JAK2/STAT3信号通路发挥保护作用，见图4。
3 讨论
随着全球老龄化趋势加剧，骨质疏松症的发病率近年来大幅增加，其引发的骨折致死率高达15%~30%[13]。骨质疏松性骨折显著增加致残率和死亡率[14]。BMD和BMC可有效评价骨质流失程度。BV/TV和BS/BV分别能较好地反映松质骨、骨皮质和骨量。Tb.Sp和Tb.Th主要用于评估骨小梁的空间形态结构[15]。骨转换标志物如BALP、PINP、OCN和CTX-1通常用于监测骨质疏松症[16]。BALP、OCN和P1NP是骨形成的标志，CTXI则是骨吸收的指标[16]。骨质疏松症的实验动物模型是研究骨质疏松症的合适工具，在这些模型中，OVX大鼠模型是最常用的[17]。本研究采用卵巢切除法建立了OVX大鼠模型。OVX大鼠BMD、BMC、BV/TV和Tb.Th均显著降低。BS/BV和Tb.Sp显著增加。BALP、CTX-1水平明显上调，PINP、OCN水平显著下调，与以往研究一致[18]。
图3各组大鼠血清BALP（A）、CTX-1（B）、PINP（C）、OCN（D）水平比较
图4各组大鼠股骨组织p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平比较
杜仲为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，性温平，味甘、微辛。《神农本草经》记载:“杜仲，主腰脊痛，补中，益精气，坚筋骨，久服轻身耐老”[19]。近年来，有证据揭示了杜仲在成骨细胞生长、分化和功能中的调节作用[20]。研究表明，杜仲能促进成骨细胞分化，调节骨代谢水平，加速骨形成从而治疗骨质疏松[21]。为进一步探索杜仲改善骨质疏松的具体机制，本研究建立了OVX骨质疏松大鼠模型，通过12周的杜仲灌胃干预，以雌激素为阳性参考，大鼠股骨Micro CT结果显示，与VOX组相比，杜仲及雌激素干预大鼠的股骨BMD、BMC、BV/TV和Tb.Th均升高。BS/BV和Tb.Sp下降。此外，杜仲组和雌激素干预组血清中骨标志物BALP和CTX-1水平降低，而PINP和OCN水平升高，且骨密度和骨硬度均有所改善。这些研究结果均表明杜仲可能通过促进OVX大鼠骨质形成、抑制骨吸收，对绝经后骨质疏松症有一定的治疗作用，与文献报道一致[22]。
骨骼的发育和稳态取决于破骨细胞吸收旧骨或受损骨，同时成骨细胞形成新骨。如果这一平衡失衡，就可能导致骨质疏松症和自发性骨折等疾病的发生。这种紧密关联的过程的不平衡可能对人体健康造成重大影响。多项研究指出，JAK2/STAT3信号通路参与调控骨代谢，对骨骼发育和骨内稳态起到重要作用[23-24]。
本研究发现，经杜仲干预后，JAK2/STAT3信号通路关键蛋白有着明显改变，表明杜仲可通过JAK2/STAT3通路对OVX大鼠骨质疏松发挥保护作用。但本文也有一定的局限性，动物实验中杜仲给药只有一种剂量，是否给药剂量的高低也会对治疗OP产生不同的结果暂未阐明，有待后续进一步研究。
综上所述，杜仲可改善OVX大鼠的股骨骨质，包括增加骨密度和骨硬度，减轻骨质疏松严重程度，这可能与杜仲调控JAK2/STAT3通路有关，为杜仲改善骨质疏松症的潜在机制研究提供了新的参考。