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创伤、感染或肿瘤切除导致的大段骨缺损的治疗是临床骨科面临的挑战，自体骨移植和骨移植替代物是治疗大段骨缺损的两种主要方法[1]。自体骨移植是最佳的组织选择，但临床实践指出，自体骨移植在大段骨缺损中的应用存在诸多限制，如移植来源受限、骨移植带来的二次创伤、术后疼痛等[2]。近年来，骨组织工程技术的不断进步使得骨缺损修复有了新的研究方向，该技术主张将自体骨细胞与支架材料相结合，形成组织工程骨，促进骨再生进程。目前，生物陶瓷多孔支架已被证实具有良好的生物相容性[3]。但也有研究指出，生物陶瓷支架的机械性能及可降解性能不佳，理想的支架材料应在具备良好的生物相容性之外，还具备接近骨的机械性能，且存在互连的多孔结构，便于骨重建进程[4-5]。近些年，骨科广泛应用可生物降解的镁合金作为新型可植入生物材料，因其具有良好的生物相容性、优异的机械性能、可生物降解性以及与人骨相似的杨氏模量，因而引起临床研究人员的兴趣[6]。但镁合金存在降解速度快的缺陷，难以支持骨愈合进程。锌（Zn）合金与镁（Mg）合金相比降解速度大幅降低，大鼠体内实验证实，Zn-Mg合金支架兼具良好的机械强度和生物相容性，且在骨缺损修复过程中，多孔Zn金属直接可以被逐渐降解吸收，达到了自体骨修复效果[7]。银（Ag）元素已被证实具有良好的抗菌性能。还有研究证实，相比于Zn-1Ag，Zn-3.5Ag支架具有更高的体外抗菌能力[8]，但Ag的比例并非越高越好，要求其力学性能与人骨类似为宜。本研究通过建立兔股骨缺损模型，并分别植入Zn支架、Zn-2Ag支架、Zn-2Ag-0.04Mg支架，分析各类支架的生物相容性和骨修复能力，报告如下。
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1 材料与方法
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1.1 Zn-2Ag-0.04Mg支架制备
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电阻炉中融化纯镁（99.99%）、纯锌（99.995%）和纯银（99.995%），并按照Wu等[9]的方法制备多孔Zn-Ag多孔合金支架的方式，制备Zn支架、Zn-2Ag支架及Zn-2Ag-0.04Mg支架。
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1.2 模型制备及干预过程
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实验兔由上海同济医院动物房提供，平均体质量（2.5±0.1）kg，均为2个月大雄性兔，实验动物许可证编号为SYXK（上海）2019-0005，研究报同济大学同济医院动物伦理委员会批准（批准号：2019-DW-026）。
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建立兔股骨滑车骨缺损模型后，将建模成功的30只实验兔随机均分为Zn支架组、Zn-2Ag支架组和Zn-2Ag-0.04Mg支架组（每组10只）。实验兔均使用兔用丙戊酸钠麻醉后使用碘伏对双后肢消毒3次，电钻通过股骨远端滑车中心部分打开髓腔，将20 mm（长）×3 mm（直径）支架插入髓腔中，骨蜡封闭髓腔，切口使用生理盐水冲洗并逐层封闭，术后连续3 d每天肌内注射80万U青霉素。术毕，将实验兔饲养在温湿度适宜、通风良好的环境中，正常饲养。
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1.3 观察指标
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1.3.1 成骨性能情况
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于术后6周和术后6个月时，分别处死各组5只实验兔，取出股骨，并使用4%多聚甲醛固定，使用Micro-CT对股骨造模部位及远端3 mm处进行扫描及三维重建，记录各组的骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）。
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1.3.2 骨缺损愈合情况
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于术后6周及术后6个月时，分别使用X线拍摄实验兔股骨侧位X线片，并由3名经验丰富的影像科医师进行骨缺损评分，评分范围为0~12分[10-11]，其中0分为无愈合，12分为恢复正常骨，7分视为初步重建。
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1.3.3 组织学情况
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于术后6周和术后6个月时，取部分股骨，使用10%中性缓冲液固定，乙醇脱水，并使用甲醛固定48 h，用切片机做股骨冠状切片（厚度8 mm），Van Gieson染色实验观察植入物组织学情况。
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1.3.4 生物安全性情况
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于术后6周及6个月时，取处死实验兔的肝脏、肾脏和心脏，采用HE染色的方式评估组织形态学变化，评估支架的安全性能。
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1.4 统计学方法
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使用SPSS 22.0对研究数据进行统计学分析，对符合正态分布的计量资料以（均数±标准差）表示，多组比较采用方差分析，组间进一步两两比较用LSD-t检验，计数资料以率表示，组间比较用卡方检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
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2 结果
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2.1 三组实验兔支架降解情况及局部骨缺损愈合情况
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三组实验兔在实验中均未出现异常行为及死亡现象，伤口均愈合良好，无感染及渗出情况出现。术后6周时，三组植入体轮廓位置均较为清晰，术后6个月，植入体均出现了一定程度降解，但Zn-2Ag-0.04Mg支架组中植入体位置及轮廓仍较为清晰（图1A），Zn-2Ag-0.04Mg支架组的X线评分高于Zn和Zn-2Ag组（P<0.05，图1B），提示Zn-2Ag-0.04Mg支架具有较好的骨重建性能。
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图1 三组实验兔支架降解情况及局部骨缺损愈合情况
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2.2 三组实验兔术后6周及术后6个月时骨再生情况
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术后6周时，Zn支架组及Zn-2Ag支架组植入物长度高于Zn-2Ag-0.04Mg支架组，三组实验兔植入物部位在术后6周均出现少量新骨，与Zn支架组比较，Zn-2Ag支架组新骨略少，但Zn-2Ag-0.04Mg支架组新骨生成显著增加，提示加入Mg在加快植入物降解的同时，有助于促进骨再生（图2）。
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图2 三组实验兔术后6周及术后6个月时骨再生情况
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2.3 三组实验兔术后6个月时植入物部位组织学情况
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Van Gieson染色实验显示，术后6个月时，三组实验兔植入物孔隙中均有明显的新骨生成，对比发现Zn-2Ag-0.04Mg支架组新骨生成最为显著（图3）。
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图3 三组实验兔术后6个月时植入物部位组织学情况（×10）
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2.4 三组实验兔术后6周及术后6个月时股骨三维CT重建情况
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术后6周时，三维CT重建结果提示Zn-2Ag-0.04Mg支架组股骨软骨表面相较其余两组更为光滑，Zn支架组和Zn-2Ag组均出现不同程度软骨下病变，术后6个月时，三维CT重建提示Zn-2Ag-0.04Mg支架组股骨软骨表面形态学良好（图4）。
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图4 三组实验兔术后6周及术后6个月时股骨三维CT重建情况
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2.5 三组实验兔术后6周及术后6个月时支架生物活性情况
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术后6周时，Zn-2Ag-0.04Mg支架组BMD、BV/TV及Tb.N值显著高于Zn支架组（图5A、图5B、图5D），Zn-2Ag-0.04Mg支架组Tb.Sp值显著低于Zn支架组和Zn-2Ag组（图5C），三组间Tb.Th值差异不明显（图5E）。术后6个月时，Zn-2Ag-0.04Mg支架组BMD、BV/TV及Tb.N值仍显著高于第6周时的Zn组。
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图5 三组实验兔术后6周及术后6个月时支架生物活性情况
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2.6 三组实验兔支架生物安全性分析
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在术后6个月时，与Zn支架组和Zn-2Ag支架组相比，Zn-2Ag-0.04Mg支架组实验兔的肝脏、肾脏和心脏并未出现形态学异常现象，Zn-2Ag-0.04Mg支架组实验兔上述组织细胞排列较为紧密有序，提示Zn-2Ag-0.04Mg合金具有较好的生物安全性（图6）。
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图6 三组实验兔支架生物安全性分析
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3 讨论
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生物可降解金属材料具有良好的力学强度以及生物可降解性，能够有效地解决应力遮挡以及二次手术带来的临床问题，属于具有较好应用前景的骨植入材料。研究指出，理想的生物可降解金属骨植入材料应具有如下特性：1）在术后早期的炎症和修复阶段，植入物应具有足够强度支撑骨折及缺损区域应力，带来较高的结构稳定性；2）在骨重建阶段，植入物应带来适当的应力刺激，确保骨愈合进程顺利进行，同时，在骨重建过程中，金属材料应逐渐降解，植入物刚度逐渐降低，将载荷转移至新生骨，避免应力遮挡带来的骨吸收；3）骨折愈合后无需二次手术取出[12-13]。
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目前的研究指出，Zn具有抑制破骨细胞骨吸收，以及促进成骨细胞骨形成的效果，能够有效加速骨重建进程，但纯Zn支架生物相容性及强度不足[14]。既往的研究指出，Zn-2Ag-0.04Mg合金支架具有典型的多孔结构，与人自体骨多孔结构类似，此类结构能够为成骨细胞的增殖以及分化提供良好结构条件[15]。前言提到，Mg支架既往被认为是理想的骨植入材料，但Mg支架降解速度过快，难以维持至患者骨再生，甚至存在造成二次骨折的风险，Zn支架降解速度较慢，但纯Zn支架生物相容性较差，故而出现了二元合金，甚至三元合金的理念，多元合金理念从促进骨生成、改善降解行为、提高体外力学性能等方面为新型骨植入物的设计提供了策略[16-17]。
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本研究结果提示，在支架植入时，三组实验兔支架长度一致，在植入6周时，Zn-2Ag-0.04Mg支架长度低于Zn支架组和Zn-2Ag组，提示Mg的加入有效加快了支架的降解速度。进一步术后6个月的三维重建结果提示，Zn-2Ag-0.04Mg在术后6个月仍清晰可见，此时实验兔股骨冠状切片提示支架孔洞内出现大量新生骨，提示了Zn-2Ag-0.04Mg支架兼有良好的降解性能，并能够支撑至骨重建阶段，为骨愈合提供了良好的条件[18]。
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本文还对比了三组实验兔术后支架生物活性情况，结果提示，术后6周时Zn-2Ag-0.04Mg支架组患者BMP、BV/TV及Tb.N值显著高于Zn支架组，Zn-2Ag-0.04Mg支架组Tb.Sp值显著低于Zn支架组和Zn-2Ag组，术后6个月时，Zn-2Ag-0.04Mg支架组的X线评分高于Zn和Zn-2Ag组，上述结果均提示Zn-2Ag-0.04Mg支架具有良好的生物活性，有助于促进骨重建进程。既往的研究指出，在Zn合金中增加Mg能够有效提高组织填充效果，且有助于促进骨缺损部位血管和骨组织生长，而Ag的加入能够有效提高支架抗菌效果，使得支架兼具生物相容性、机械性能以及生物可降解性[19-20]。
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良好的生物相容性意味着该合金对人体组织和器官无毒、无过敏反应、无免疫排斥和致癌性。Zn是人体必需元素之一，在人体新陈代谢中起着重要作用[21]。体外实验证实，Zn可以破坏细菌细胞膜的完整性并导致细胞内蛋白质变性，从而起到杀菌剂的作用[22]。Ag已被证明是另一种抗菌金属元素，它通过吸附细菌蛋白酶而有效抗菌，故而在锌镁合金中添加Ag可以提供良好的抗菌能力。目前的研究证实，Zn-0.04Mg-2Ag合金对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌具有良好的抗菌能力[23]。本研究中，Zn-2Ag-0.04Mg支架在6周和6个月时都很好地促进了骨恢复，且相比Zn支架组和Zn-2Ag支架组，Zn-2Ag-0.04Mg支架的股骨软骨表面形态学更佳，原因可能是Zn-2Ag-0.04Mg合金支架具有良好的抗菌性能，从而促进了骨恢复。本研究还通过对比三组实验兔心脏、肾脏等重要器官细胞形态学的方式，对植入物支架的安全性进行了侧面论证。
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综上所述，Zn-2Ag-0.04Mg合金支架在体内表现出良好的生物相容性和安全性，以及在较长时间内诱导骨再生和促进骨修复的能力，该材料再应用于骨损伤的新型支撑材料并促进骨愈合方面有一定潜力。
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摘要
目的：采用动物实验的方式，分析可生物降解Zn-2Ag-0.04Mg合金生物相容性及体内骨再生能力。方法：将30只实验兔随机均分为Zn支架组、Zn-2Ag支架组和Zn-2Ag-0.04mg支架组（每组10只），建立兔股骨缺损模型后分别使用不同材料的支架固定，术后6周及术后6个月，取出部分大白兔股骨，使用Micro-CT对股骨远端入口周围直径为3 mm的区域进行扫描和三维重建，分析支架体内成骨性能，使用X线观察局部骨缺损愈合情况，并观察股骨组织学情况。结果：入组实验兔实验中未出现异常行为及死亡现象，伤口均愈合良好，无感染及渗出情况出现；二维和三维显微CT结果显示，Zn-2Ag-0.04Mg支架组的新生骨明显多于Zn支架组，Zn-2Ag-0.04Mg合金支架组的骨体积更大（P<0.05）；Zn-2Ag-0.04Mg支架组的成骨指数也高于Zn支架组（P<0.05）；6个月时，Zn-2Ag-0.04Mg的支架比Zn组或Zn-2Ag组小（P<0.05）；肝脏、肾脏和心脏的HE染色未检测到任何异常，证实了Zn-2Ag-0.04Mg合金支架的生物安全性。结论：Zn-Ag-0.04Mg支架具有良好的生物相容性和体内骨再生能力，具有较好的临床应用前景。
Abstract
Objective To analyze the biocompatibility and in vivo bone regeneration ability of biodegradable Zn-2Ag-0.04Mg alloy through animal experiments. Methods Thirty experimental rabbits were randomly divided into three groups: Zn stent group, Zn-2Ag stent group, and Zn-2Ag-0.04mg stent group (10 rabbits in each group). After establishing a rabbit femoral defect model, different materials of stents were used for fixation. Six weeks and six months after surgery were selected as observation points. Part of the femur of the white rabbits was taken out at the above time points, and Micro CT was used to scan and reconstruct the area with a diameter of 3 mm around the distal femoral entrance, Analyze the osteogenic performance of the stent in vivo, observe the healing of local bone defects using X-ray, and observe the histological condition of the femur. Results No abnormal behavior or death was observed in the enrolled experimental rabbits, and the wounds healed well without infection or exudation; The two-dimensional and three-dimensional micro CT results showed that the newly formed bone in the Zn-2Ag-0.04Mg scaffold group was significantly more than that in the Zn scaffold group, and the bone volume in the Zn-2Ag-0.04Mg alloy scaffold group was larger (P<0.05); The osteogenic index of the Zn-2Ag-0.04Mg scaffold group was also higher than that of the Zn scaffold group (P<0.05); At 6 months, the Zn-2Ag-0.04Mg scaffold was smaller than that of the Zn group or Zn-2Ag group (P<0.05); The HE staining of the liver, kidneys, and heart did not detect any abnormalities, confirming the biological safety of the Zn-2Ag-0.04Mg alloy stent. Conclusion The Zn-Ag-0.04Mg scaffold has good biocompatibility and in vivo bone regeneration ability, and has good clinical application prospects.
关键词
可生物降解 ； Zn-2Ag-0.04Mg合金支架 ； 骨再生 ； 生物相容性 ； 动物实验
