肝纤维化是良、恶性肝脏疾病最常见的伴随病理过程和最终结局，其发病率和死亡率在是全世界范围内居高不下，目前西医还没有有效的药物治疗^[1]。鳖甲煎丸出自东汉张仲景所著《金匮要略》，主治疟疾日久不愈，胁下痞硬有块，结为疟母，以及症瘕积聚，按之坚硬，推之不移，或时作疼痛，或时有寒热者。在临床常用于病毒性肝炎后、酒精性及非酒精性脂肪性等肝纤维化的治疗。中华中医药学会肝胆病学分会在2020年制定的《鳖甲煎丸治疗肝纤维化临床应用专家共识》中^[2]，推荐了其用法、用量、疗程、疗效、治则治法及安全性等问题，但鳖甲煎丸治疗肝纤维化的作用机制有待阐明。

肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活、增殖并分泌大量的胶原纤维引发细胞外基质沉积是导致肝纤维化的根本原因^[3]，故抑制HSC激活是阻止肝纤维化进程的关键，也一直是相关领域的研究难点和热点。AMP依赖的蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）是机体能量代谢调节的关键分子。在营养和能量匮乏、低氧、应激等条件下，ATP的浓度水平降低时，AMP/ATP比值升高，AMPK发生磷酸化，处于活化状态；反之，当ATP的浓度水平升高时，AMPK磷酸化被抑制。有研究表明，AMPK调节HSC表型^[4]，处于活化状态的AMPK促进HSC激活^[5]，抑制AMPK磷酸化能抑制HSC激活，减轻肝纤维化^[6]。

本研究采用高脂高糖饮食联合低剂量四氯化碳（CCl₄）腹腔注射制备肝纤维化小鼠模型，探讨鳖甲煎丸调控AMPK表达和活性，抑制肝星状细胞激活，进而阻止肝纤维化进展的作用机制，以期为阐明鳖甲煎丸治疗肝纤维化的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

鳖甲煎丸为国药集团中联药业有限公司商品（国药准字：Z42020772，规格：3 g×30袋，批号：210100），高脂高糖饲料购自北京博泰宏达生物技术有限公司，CCl₄为南京化学试剂股份有限公司产品，天狼星红染液（BA4356）购自珠海贝索生物技术有限公司，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、p-AMPK和AMPK抗体为美国Abcam公司产品。Mindray全自动生化分析仪BS-350E为迈瑞医疗公司产品。

1.2 高脂高糖饲料配方

参照 Tsuchida等^[7]的研究，每千克饲料含蔗糖405.36 g，无水乳脂肪210 g，胆固醇12.5 g，酪蛋白195 g，DL-蛋氨酸 3.0 g，矿物质4 g，维生素10 g，纤维素50 g，乙氧喹啉0.04 g，食用色素0.1 g。

1.3 模型制备及药物干预

健康雄性SPF级C57BL/6小鼠30只，体质量（20±2）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司（SCXK京2019-0010）。适应性喂养1周后，按随机数字表分为对照组、肝纤维化模型组（模型组）和鳖甲煎丸治疗组（治疗组），每组10只。模型组和治疗组小鼠参照Tsuchida等^[7]的方法给予高脂高糖饮食以及含有23.1 g/L果糖和18.9 g/L葡萄糖的饮用水，并每周1次腹腔注射CCl₄（1︰9溶于玉米油中，5.0 μL/g）；对照组小鼠饲以普通饲料和饮用水，同时腹腔注射等体积的玉米油。6周后，治疗组开始给予鳖甲煎丸，剂量按“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表”换算为1.365 g/kg，相当于人临床用药的0.15 g/kg；称取5 g 鳖甲煎丸溶于10 mL饮用水，配制溶液浓度为0.5 g/mL，每只小鼠0.546 mL灌胃，1次/d；模型组以相同方式予以饮用水。各组均连续灌胃6周。

1.4 血清生化分析

摘除小鼠眼球取血，以2000 ×g，4℃离心10 min获得血清，取200 μL上机检测甲状腺球蛋白（TG）、血清血清胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平。

1.5 组织病理学观察

取各组小鼠肝左叶，用4%多聚甲醛固定，乙醇脱水后石蜡包埋、3 μm连续切片制成石蜡切片，脱蜡至水，常规HE染色，中性树胶封片后，在显微镜下观察。参照Ishak评分系统^[8]对肝细胞坏死、纤维化和炎症程度行肝病理评分。

1.6 天狼星红染色

石蜡切片脱蜡至水，用天狼星红染色1 h后，苏木素染液（Mayer）染细胞核6 min，流水冲洗返蓝5 min，常规脱水透明，中性树胶封固。

1.7 免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡至水，EDTA抗原修复缓冲液进行抗原修复，置于PBS中晃动洗涤浸泡3次，每次5 min；阻断内源性过氧化物酶后行血清封闭，滴加抗α-SMA，于湿盒内4℃孵育过夜，加HRP标记的二抗，室温孵育50 min。DAB显色，苏木素复染，脱水封片。

1.8 Western blot检测蛋白表达水平

称取40 mg肝组织提取总蛋白，BCA法蛋白定量后行SDS-PAGE电泳，电转移电转印至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，加一抗[1∶1000 p-AMPK和AMPK，1∶1500磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）]低温孵育过夜，TBST洗膜后加二抗室温孵育2 h，发光显影，凝胶成像分析系统对目的条带进行扫描和密度分析，以相应蛋白条带的平均光密度值来表示p-AMPK和AMPK的相对蛋白表达量。

1.9 统计学方法

数据采用SPSS 17.0统计软件分析。计量数据以$\stackrel{-}{x}\pm s$表示，多组比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清生化指标分析

模型组小鼠血清ALT、AST、ALP和LDL较对照组均升高，TG、CHO和HDL较对照组降低（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组血清ALT、AST和ALP降低，差异有统计学意义（P＜0.05），如表1。

注：^a与对照组比较，P<0.05；^b与模型组比较，P<0.05

2.2 肝脏组织病理学和天狼星红染色

对照组HE染色结果可见小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列；模型组肝小叶结构紊乱、消失，肝细胞可见典型的大泡性脂肪变性和嗜酸小体，炎症细胞浸润由汇管区扩散至相邻汇管区及中央静脉区，天狼星红染色在偏振光下可见Ⅰ型和Ⅲ型胶原叠加呈明亮的橘黄色，起源于汇管区的，扩散至临近汇管区或中央静脉区，形成桥联纤维化，呈中度纤维化；治疗组肝组织病理学改变减轻，肝细胞坏死、炎症和纤维化评分较纤维化模型组降低（P<0.05），如图1和图2。

2.3 α-SMA表达

模型组小鼠肝组织α-SMA阳性表达由汇管区向临近汇管区或中央静脉区扩散；治疗组α-SMA阳性表达局限于汇管区，较模型组减弱（P﹤0.05），如图3和图4。

2.4 AMPK蛋白表达

模型组小鼠肝组织p-AMPK和AMPK蛋白表达较对照组升高（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组p-AMPK和AMPK蛋白表达均降低（P＜0.05），如图5。

2.5 p-AMPK、AMPK蛋白表达与纤维化评分的相关性

将p-AMPK、AMPK蛋白表达与肝组织纤维化评分进行相关性分析，结果显示其pearson相关系数分别为0.891和0.877，在0.01水平（双侧）上显著正相关，如图6。

3 讨论

鳖甲煎丸是临床治疗肝纤维化的常用药物，药味虽多但组方思路清晰，治癥瘕从痰瘀论治，将活血祛瘀通络与祛痰化浊利湿相结合，寒热并用，攻补兼施。《本经》中描述鳖甲 “主心腹症瘕坚积，寒热”，有软坚散结消癥之功效，为君药；臣药以硝石破坚散结，大黄攻积祛瘀，鼠妇虫、土鳖虫、蜂房、凌霄花、牡丹皮等破血逐瘀，行其血分之阏结，助君药加强软坚散结的作用；佐以厚朴、半夏、葶苈下气祛痰，行其气分之结滞；桂枝、柴胡通达营卫，行瘀散结；干姜、黄芩调和阴阳，平调寒热；石韦、瞿麦利水导湿；阿胶、党参益气养血，扶正固本，使全方攻邪而不伤正。

临床研究观察到，鳖甲煎丸治疗非酒精性脂肪肝疗效确凿，能回缩门静脉宽度，改善患者胁痛如刺、痛处不移和倦怠乏力等症状^[9]；单用鳖甲煎丸或联合替诺福韦均能改善慢性乙型肝炎早期肝硬化患者肝功能，延缓肝纤维化发展 ^[10-11]；最近一项随机、对照、双盲的研究表明，鳖甲煎丸对慢性乙型肝炎肝硬化患者的肠道菌群有调整作用^[12]。基础研究证实鳖甲煎丸的抗纤维化作用，并发现其作用机制主要包括：1）抑制肝组织NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及其靶基因表达、减少胶原生成^[13-14]；2）上调MMP-2和MMP-9表达、加快细胞外基质降解^[13]；3）通过降低PPARγ启动子甲基化程度促进PPARγ表达^[15]；4）抑制单核细胞趋化因子-1（MCP-1）表达、减轻炎症细胞浸润^[16]；5）通过增加血管紧张素转换酶（ACE2）和血管紧张素-1-7、减少血管紧张素Ⅱ及其1型受体调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统^[17]。

本课题组参照Tsuchida等^[7]的方法，采用西方饮食结合每周腹腔内注射低剂量CCl₄，诱导小鼠在6周时的非酒精性脂肪性肝炎、12周时的3期纤维化和24周时的肝癌模型，动态模拟临床炎症—纤维化—癌的病理变化过程。我们的研究在12周时运用病理学和天狼星红染色证实肝组织因出现中度纤维化，鳖甲煎丸有减轻肝纤维化的作用。同时本研究还检测到模型小鼠血清TG、CHO、HDL、LDL、ALT、AST和ALP较对照组均升高，鳖甲煎丸可改善肝功能指标，但不影响血脂水平，这和段文彪等^[18]的研究结果不完全相符，可能与模型制备方式、用药时间不同有关。

AMP在调节能量代谢和细胞增殖、分化中其重要作用的。HSC激活是一个耗能过程，以及激活后的增殖、迁移和分泌胶原等均对能量有较高需求，这就使得AMPK处于持续活化状态^[4]。本研究也检测到肝纤维化小鼠α-SMA阳性表达由汇管区向临近汇管区、中央静脉区扩散，表明这些区域的HSC呈激活态；AMPK和p-AMPK蛋白升高，证实AMPK被活化；同时还发现鳖甲煎丸能降低HSC激活程度，下调AMPK蛋白表达和活性，提示其抑制HSC激活的作用与抑制AMPK表达和活性有关。最近丁茂鹏等^[19]利用网络药理学发现鳖甲煎丸治疗肝纤维化的关键成分有78种，作用关键靶点有80个，包括STAT3、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）等。这些研究提示鳖甲煎丸可通过多成分-多靶点-多途径来发挥抗肝纤维化的整体作用。

综上，本研究初步发现鳖甲煎丸可能通过下调AMPK蛋白表达和活性，抑制HSC激活，减少胶原分泌，阻止肝纤维化进展的作用机制，为鳖甲煎丸临床治疗肝硬化提供新型的理论依据。但其抑制AMPK活化对相关信号通路的影响需要体外实验进一步探讨。

参考文献