癌症作为现代社会常见疾病，对人类的健康和生命有着严重威胁。近年来，食管胃结合部腺癌发病率呈现逐年增高的趋势^[1-3]。食管胃结合部在正常状态下，组织学和解剖学的定义位置相同，但发生病变后，鳞柱状上皮上移，导致具体的位置因人而异，难于判断^[4-5]。手术切除是目前临床医学中癌症治疗的最有效手段，但癌症的淋巴结能否完全清扫，对手术效果及癌症预后有着关键作用^[6]。纳米碳示踪技术是近20年来较新的淋巴结排查方法，其原理是利用平均直径21 nm的小颗粒纳米碳示踪剂与聚乙烯吡络烷酮共同溶解于0.9%氯化钠注射液中，生产纳米图案颗粒悬浊液，悬浊液分子团无法进入毛细血管却可直接进入毛细淋巴管，被淋巴管内的巨噬细胞吞噬，从而导致淋巴结显色，目前多结合食管胃根治术对食管胃癌患者进行手术治疗^[7-8]。华蟾素注射液是从干蟾皮脂溶性成分中提炼的一种中药抗肿瘤制剂，可解毒、消肿、止痛，临床主要用于中期肿瘤的辅助治疗，目前对于华蟾素注射液对接受合食管胃结合部腺癌根治术后预后改善的研究较少，且其作用机制尚不明确。本研究旨在探究围术期应用华蟾素注射液在纳米碳示踪技术结合根治术对食管胃结合部腺癌的预后作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取两院2018年3月—2020年12月接受食管胃结合部根治术治疗的患者80例，其中男44例，女36例；平均年龄（60.24±2.87）岁。依据不同的治疗手段均分为蟾蜍素组（围术期应用华蟾素与纳米碳示踪技术结合根治术联合治疗）和纳米组（围术期直接接受纳米碳示踪技术结合根治术治疗），每组40例。纳米组男21例，女19例；平均年龄（61.53±1.68）岁，平均肿瘤直径（3.5±2.9）cm，LAUREN分型：肠型28例，弥散型8例，混合型4例；临床分期：II期8例，III期32例；临床T分期：cT3期24例、cT4期16例；临床N分期：cN0期9例、cN1期20例、cN2期11例。蟾蜍素组男23例，女17例；平均年龄（60.03±1.22）岁，平均肿瘤直径（3.6±2.2）cm，LAUREN分型：肠型24例，弥散型9例，混合型7例；临床分期：II期14例，III期26例；临床T分期：cT3期26例、cT4期14例；临床N分期：cN0期10例、cN1期19例、cN2期11例。两组患者均无其他并发症、凝血功能障碍且临床资料均完整，两组患者基线资料比较均无统计学差异（P>0.05）。所有患者均知情本研究，本研究内容符合《赫尔辛基宣言》，所有患者均不使用剧烈兴奋心脏药物。

1.2 方法

两组患者均在入院后进行血常规、X线片、心电图、增强腹部CT、胃镜等术前必须检查。1）华蟾素治疗：术前，蟾蜍素组接受华蟾素注射液（通用名称：华蟾素注射液；商品名称：华蟾素注射液999；主要成份：干蟾皮提取物；规格型号：5 mL×10支/盒；批准文号：国药准字Z34020273；生产企业：安徽华润金蟾药业股份有限公司）治疗，肌内注射，每次2～4 mL（2/5～4/5支），每天2次；每天静滴1次10～20 mL，用5%的葡萄糖注射液500 mL稀释，每7 d为1个疗程，每疗程结束后休息1~2 d，至少接受2个疗程；术后持续治疗30 d，用法用量同术前。2）手术治疗：所有患者的根治术均由同一组医师完成。患者采取头颈部后仰高位，采用气管插管全身麻醉，并行胸腔和周围脏器检查，确保无肿瘤转移。胃切除术＋纳米碳示踪淋巴结清扫术的具体操作方法为：手术前1 d，将纳米碳注射液1 mL（内含纳米碳50 mg）与5-氟尿嘧啶（4 mL，0.1 g）混合，充分震荡（10~15 min）制备纳米碳-5-氟尿嘧啶混悬液，然后通过皮试细针在肿瘤边缘浆膜下选择4~8个点进行示踪剂注射，3 min内完成所有点的注射，期间注意避开血管，注射5 s后拔针并纱布按压，防止注射液外渗导致周围细胞被黑染。然后行标准开腹胃癌切除术和淋巴结排查，上腹正中切口，切除大网膜、横结肠系膜前叶、胃左动脉和周围淋巴组织，胃左静脉进行标准结扎，然后根据纳米碳示踪情况，进行结肠中动脉、肠系膜根部、胰头周围、小网膜、十二指肠、肝总动脉干淋巴结、脾动脉干淋巴结等淋巴结清扫；采用Rouxen-Y法进行消化道重建。

1.3 观察指标

比较患者平均靶区淋巴结检出数量、平均总淋巴结检出数量、平均周围淋巴结检出数；纳米组患者于手术治疗前取清晨空腹静脉血（3 mL），华蟾素治疗组于患者给予华蟾素注射液前取清晨空腹静脉血（3 mL），将静脉血以3500 r/min离心10 min后得血清。采用酶联免疫吸附法检测两组血清糖类抗原19-9（CA19-9）、癌胚抗原（CEA）水平，采用全自动电化学发光法检测两组血清糖类抗原125（CA125）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平。治疗前后采集患者血液样本，血液采集的方法同上，抗凝处理后以3500 r/min离心10 min后血浆，采用血凝仪检测凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）水平。采用酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）-3水平，试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司；采用基于TaqMan 探针的实时荧光定量PCR检测circAGFG1水平，引物序列：上游5'-TCGCTCTCACATCGTAGT-3'，下游5'-CGTCCAACATCCTGTTC-3'，2^–ΔΔCt法计算circAGFG1相对GAPDH。比较两组术后T分期情况；采用免疫组化染色检测术后肿瘤组织中的HKDC1、ANXA13蛋白阳性表达情况，对应蛋白抗体anti-HKDC1和anti-ANXA1为abcam抗体（ab228729，ab151517）半定量免疫组织化学（IHC）评分系统进行染色评估，该系统将染色强度乘以阳性细胞的百分比。染色强度评分分为阴性（0分）、弱（1分）、中（2分）和强（3分）。阳性细胞百分比评分如下：≤5%（0分）、6%~25%（1分）、26%~50%（2分）、51%~75%（3分）和>75%（4分），总分范围为0~12分，其中≥4分表示HKDC1和ANXA13阳性表达，<4分表示阴性表达。

1.4 靶区标准

根据放射治疗范围将淋巴结氛围靶区淋巴结和周围淋巴结^[9]，周围淋巴结为第4sb、4d、6组，靶区淋巴结为第1、2、3、7、8、9、11p、11d、19、20、110、111组。

1.5 统计学方法

数据均采用SPSS 26.0进行分析，计量资料用$\stackrel{-}{x}\pm s$表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用n（%）表示，组间比较采用χ²检验或Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴结检出情况

蟾蜍素组患者总淋巴结数、靶区淋巴数、周围淋巴数均低于纳米组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

注：^a与纳米组比较，P＜0.05

2.2 肿瘤标志物比较

与治疗前比，治疗后两组患者肿瘤标志物水平均降低，且蟾蜍素组更低（均P<0.05），见表2。

注：^a与本组治疗前比，P＜0.05；^b与纳米组比较，P＜0.05

2.3 凝血功能比较

与治疗前比，治疗后两组患者APTT、PT、TT均延长，FIB降低，且蟾蜍素组改善幅度更大（均P<0.05），见表3。

注：^a与本组治疗前比，P＜0.05；^b与纳米组比较，P＜0.05

2.4 IGFBP-3、circAGFG1比较

与治疗前比，治疗后两组患者IGFBP-3均升高，circAGFG1降低，且蟾蜍素组改善幅度更大（均P<0.05），见表4。

注：^a与本组治疗前比，P＜0.05；^b与纳米组比较，P＜0.05

2.5 术后病理指标比较

术后T分期方面，蟾蜍素组pT0~2期18例，pT3~4期22例；纳米组pT0~2期1例，pT3~4期39例，两组比较存在明显差异（χ²=19.948，P=0.000）；术后N分期方面，蟾蜍素组pN0~1期28例，pN2~3期12例；纳米组pN0~1期20例，pN2~3期20例，两组比较无明显差异（χ²=3.333，P=0.068）；40例肿瘤组织标本中，HKDC1、ANXA13蛋白多分布于细胞膜和细胞质，呈棕褐色；蟾蜍素组和纳米组的HKDC1阳性表达率分别为42.5%（19/40）、70.0%（28/40），蟾蜍素组低于纳米组，差异有统计学意义（χ²=4.718，P=0.040）；ANXA13的阳性表达率分别为37.5%（15/40）、50.0%（20/40），两组无明显差异（χ²=1.27，P=0.260），见图1、2。

3 讨论

食管胃结合部腺癌的临床治疗手段一般为根治术和D2淋巴结清扫术，但临床实际操作中发现对尚未浸润至浆膜层的肿瘤细胞无法准确定位，清扫淋巴结时存在扩大或缩小的情况，导致转移性淋巴结难以彻底清除，患者预后情况较差，生活质量显著降低。有研究发现，术前进行同步放化疗可以有效降低食管胃结合部腺癌的局部复发，且术中检测出的淋巴结数目明显优于直接手术治疗^[10-11]。纳米碳示踪法作为一种比较理想的淋巴结示踪技术，具有较高的淋巴特异性趋向，可以沿淋巴管传导并行程与周围组织颜色分明的显色，且不会进入血管、不存在滞留染色局部组织问题，具有一定的安全性且能有效减少漏检和错检。

CEA属于一种可溶性糖蛋白，临床常用于辅助恶性肿瘤疾病的诊断，故其含量越高表明晚期胃癌患者病情越严重；CA19-9、CA125在正常人体内水平降低，而在晚期胃癌患者体内含量较高；NSE属于烯醇化酶同工酶，可用于评价机体恶性肿瘤疾病的严重程度，当其含量降低时表明癌症患者的病情好转。华蟾素是我国传统中药材中华大蟾蜍阴干皮经提取加工制成的灭菌水溶液，主要包含吲哚生物碱、蟾蜍色胺、蟾蜍毒素等成分，不仅可通过干扰肿瘤细胞周期，抑制癌细胞脱氧核糖核酸、核糖核酸的表达，以阻碍肿瘤细胞增殖和分裂，加快肿瘤细胞凋亡；还可通过抑制肿瘤血管生成，以阻碍癌细胞转移、侵袭，进而发挥抗癌作用，下调肿瘤标志物含量。在肿瘤组织生长、转移过程中，可导致机体出现高凝血状态，从而不利于病情控制。本研究对两组患者的肿瘤标记物进行了检测，结果显示结合华蟾素注射液的围术期治疗对CEA、CA19-9等肿瘤标志物也有显著改善作用。有研究发现，华蟾素与CTX或与5-氟尿嘧啶^[12]、环磷酰胺 ^[13]、甲氨喋呤^[14]、长春新碱^[15]均具有协同作用，能减轻放、化疗的毒副作用。本研究结果显示，蟾蜍素组患者总淋巴结数、靶区淋巴数、周围淋巴数均低于纳米组（P<0.05），说明华蟾素的围术期结合应用有助于食管胃结合部腺癌的治疗。

IGFBP-3参与肿瘤发生发展的病理生理过程，并且在外周血中可检测到二者表达异常。circAGFG1是近年来新发现并被研究的环状RNA，在多种肿瘤组织中的表达异常，有学者发现circAGFG1在食管癌组织中明显上调，circAGFG1可通过调控miR-4306/MAPRE2轴，促进食管癌的进展，并可作为 ESCC 治疗和诊断的潜在生物标志物^[16]。本研究中，与治疗前比，治疗后两组患者IGFBP-3均升高，circAGFG1降低，且蟾蜍素组改善幅度更大。提示蟾素注联合纳米碳淋巴结示踪技术可提高食管胃结合部腺癌患者的抗肿瘤治疗效果。HKDC1是己糖激酶家族成员之一，在大部分正常组织中不表达，而在多种实体肿瘤中高表达，ANXA13是多基因膜联蛋白超家族中的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，调控细胞生长和Ca²⁺信号传导通路，研究显示HKDC1和ANXA13在食管癌组织、胃癌组织中高表达，参与AEG的发生及进展，影响患者预后。本研究结果显示，两组术后pT分期存在明显差异，蟾蜍素组HKDC1的阳性表达率更低，提示围术期应用华蟾素联合纳米碳淋巴结示踪技术联合根治术治疗，降低分期作用明显，预后效果更好，可能与其调控肿瘤免疫微环境有关。

综上所述，蟾素注可在不影响其他各项手术指标的情况下有效提高食管胃结合部腺癌患者给予纳米碳淋巴结示踪技术联合根治术的淋巴结清扫个数，降低肿瘤标志物水平和HKDC1蛋白表达，降低分期作用明显，改善患者凝血功能，提高手术质量。

参考文献