食管癌是我国发病率较高的消化系统疾病。根据2020年全球癌症统计数据，食管癌的患病率和致死率分别位于第7位和第6位^[1]。食管癌的主要组织学亚型分别为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）、食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）和未分化癌，我国食管癌患者约占全球的50%，且以ESCC为主，患者预后差^[2-3]。当前ESCC主要的治疗手段为化疗和手术治疗等传统方法，但由于确诊晚、肿瘤易转移，患者的中位生存期仅有半年左右。目前，越来越多的研究将中医药用于ESCC的治疗。中医肿瘤学是在传统医学发展的悠久历史中逐步形成的以中医药来治疗恶性肿瘤的理论体系，其以清热解毒法及软坚散结法为基本方法，在整体调节、辨证施治的同时，以中医药抗肿瘤的临床治疗为主。中医在补正气、提高患者免疫力的同时，在肿瘤的防治上也显示出独特的优势，使患者的症状得到改善^[4-5]。中医药治疗不仅可以改善临床症状，还可以通过调理身体系统减轻放疗和化疗等传统治疗带来的不良反应，在提升患者的生活质量和延长患者生存方面发挥着积极作用^[6]。

近年来，基因芯片检测技术的飞速发展极大地促进了食管鳞状细胞癌的早期预测诊断，对于诊断和治疗ESCC起到了重要的推动作用^[7-9]。国内外研究人员在肿瘤基因筛选的分子层面有大量研究，利用基因检测手段对ESCC进行诊断，进而基于诊断出的致病基因进行靶向治疗，这是一种安全、高效的治疗策略^[10]，目前国内外已有多项研究成果问世。因此，在ESCC的诊断、预后分析和靶向治疗中，特征基因的筛选是非常重要的。本文以探索ESCC的可能作用靶点为切入点，将差异表达基因（differential genes，DEGs）进行免疫浸润分析，以探讨食管鳞状细胞癌的发病机制，并进一步利用生物信息学技术预测潜在治疗ESCC的中药，旨在为ESCC的诊断和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据采集

从开源基因表达数据库GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中以“esophageal squamous cell carcinoma normal”为检索词，将种属设置为“homo sapiens”，数据类型设置为“Series”进行检索，下载食管鳞状细胞癌基因芯片数据集（GSE17351、GSE38129、GSE77861、GSE20347）。

1.2 ESCC的DEGs分析

使用R4.3.1软件和R软件包“limma和SVA”对GSE17351、GSE38129、GSE77861基因表达矩阵进行合并，校正后作为训练组；将GSE20347作为验证组。使用R软件包“limma、pheatmap、ggplot2和ggrepel”筛选DEGs，并绘制热图和火山图，筛选标准设置为DEGs表达倍数的绝对值（logFC）＞1且校正后P＜0.05。

1.3 富集分析

为探究DEGs的功能，使用R软件包“colorsESCCe、stringi、ggplot2、Bioconductor”对DEGs进行基因本体（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，筛选条件设置为P＜0.05和校正后P＜0.05，并根据校正后P值对富集结果进行排序。使用R软件包“limma、org.Hs.eg.db、cluster Profiler、enrichplot”进行GSEA富集分析。

1.4 通过机器学习筛选疾病的特征基因

运用R语言包“glmnet、e1071、kernlab、caret”对DEGs进行最小绝对值收敛和选择算子回归分析（LASSO）及支持向量机-递归特征消除分析（SVM-RFE）筛选特征基因，且采用“venn”包对LASSO回归分析及SVM-RFE分析结果进行交集，获得两者共同的特征基因。

1.5 验证特征基因及诊断价值分析

通过R软件包“limma、ggpubr”，使用外部独立数据集即验证组GSE20347对特征基因进行验证，P＜0.05表示目标基因在训练组与验证组之间存在显著差异。将特征基因通过R软件包“pROC”绘制受试者工作特征（receiver operating characteristiccurve，ROC）曲线。ROC曲线可以计算曲线下面积（AUC）和95%置信区间（CI），以评估机器学习筛选出的特征基因作为疾病诊断基因的准确性，ROC曲线下面积介于0.5与1之间，面积越大说明该基因作为疾病诊断基因的准确性越高。

1.6 免疫细胞浸润分析及免疫细胞相关性分析

使用R软件包“e1071、preprocessCore”将所获得的DEGs基于CIBERSORT算法，以阈值P＜0.05对22种免疫细胞进行浸润分析，其中包括调节性T细胞、M0巨噬细胞、活化的自然杀伤细胞等免疫细胞，使用R软件包“corrplot、vioplot”将免疫细胞浸润的结果进行相关性分析。

1.7 特征基因与免疫细胞相关性分析及可视化

使用R软件包“limma、reshape2、ggpubr、ggExtra”进行特征基因与免疫细胞相关性分析。阈值P＜0.05表明该免疫细胞与基因的相关性显著。再使用R4.3.1对相关性分析进行可视化。

1.8 中药预测

通过Coremine数据库（https://coremine.com/medical/#search）和herb数据库（http://herb.ac.cn/）搜集特征基因对应的中药。

2 结果

2.1 DEGs的筛选与表达分析

基于数据集GSE17351、GSE38129、GSE77861、GSE20347，将疾病组与正常对照组相比，根据DEGs筛选条件，共得到110个食管鳞状细胞癌差异表达基因，其中上调基因33个，下调基因77个；利用DEGs绘制的热图见图1，每一列代表数据集中的一个样本，单个基因由每一行的每一个方格所代表，蓝色代表低表达、红色代表高表达；火山图见图2。图1和图2可以看出DEGs在鳞状细胞癌中多为低表达。

2.2 富集分析

GO富集分析表明食管鳞状细胞癌DEGs与“皮肤发育（skin development）、外部封装结构组织（external encapsulating structure organization）、表皮发育（epidermis development）”等生物学过程（BP）显著相关（图3a）；与“含胶原的胞外基质（collagen−containing extracellular matrix）、细胞顶端部分（apical part of cell）、顶端质膜（apical plasma membrane）”细胞组分（CC）显著相关（图3b）；分子功能（MF）析发现DEGs主要在“内肽酶活性（endopeptidase activity）、丝氨酸型内肽酶活性（serine-type peptidase activity）、丝氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）”等富集（图3c）；KEGG通路富集分析发现“蛋白质的消化和吸收（Protein digestion and absorption）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）”等与免疫细胞代谢、炎症相关通路有关（图3d）。这些证据表明，ESCC中的DEGs可能通过免疫系统和多种炎症因子的调节在ESCC的发病机制中发挥作用。GSEA分析结果显示，疾病组基因高表达显著富集的生物学过程和通路分别为：细胞周期-DNA复制（cell cycle DNA replication）、ECM受体相互作用（ECM receptor interaction）（图3e、3f）。

2.3 通过机器学习筛选疾病的特征基因

通过LASSO回归分析筛选得到13个特征基因，SVM-RFE算法筛选得到10个特征基因，将两种机器学习算法所得特征基因结果绘制韦恩图最终得到4个特征基因，分别为UBL3、KIF4A、KIF14、GPX3。见图4~6。

2.4 验证特征基因及诊断价值分析

通过验证组对食管鳞状细胞癌中特征基因的表达水平进行分析，结果表明，无论是验证组还是训练组，特征基因都有存在显著差异（图7）；特征基因在训练组和验证组的ROC曲线分析显示，AUC均大于0.9（图8—9），ROC曲线提示机器学习筛选出的特征基因具有很高的临床诊断价值，可以区别健康人群与食管鳞状细胞癌患者。

2.5 免疫细胞浸润分析及免疫细胞相关性分析

与正常组织相比，食管鳞状细胞癌患者中CD4⁺T细胞（T cells CD4⁺）、M0巨噬细胞（Macrophages M0）、M2巨噬细胞（Macrophages M2）、活化的树突状细胞（dendritic cells activated）显著上调、静息的肥大细胞（mast cells resting）、活化的肥大细胞（mast cells activated）显著下调；其余的免疫细胞表达水平差异不明显（图10）。免疫细胞相关性分析发现，静息的肥大细胞与M2巨噬细胞呈正相关（r=0.52）、M2巨噬细胞与活化的树突状细胞呈负相关（r=-0.44），见图11。

2.6 特征基因与免疫细胞相关性分析及可视化

深入分析特征基因，并对其与免疫细胞之间的相关性进行研究。KIF4A、KIF14与CD4⁺T细胞、M0巨噬细胞、活化的树突状细胞、活化的肥大细胞显著正相关（P＜0.05），与M2巨噬细胞、静息的肥大细胞浸润水平显著负相关；UBL3与M2巨噬细胞、静息的肥大细胞显著正相关，与CD4⁺T细胞、M0巨噬细胞、活化的树突状细胞、活化的肥大细胞浸润水平显著负相关；GPX3与M2巨噬细胞显著正相关，CD4⁺T细胞、活化的树突状细胞浸润水平显著负相关（图12-15）。

2.7 中药预测

KIF14、KIF4A通过Coremine和herb数据库预测出的中药主要有：香橼、枳实、茯苓、丹参、人参等。GPX3和UBL3通过Coremine和herb数据库预测出的中药主要有：丹参、西红花、鳖甲、枸杞子、丁香、乳香等。

3 讨论

ESCC作为一种侵袭性极强的恶性肿瘤，起病隐匿，病程进展快，转移率及复发率高，治疗效果差，预后不良，对患者的身体健康造成了很大的威胁^[11]。虽然ESCC的治疗方式较前几十年有所改善，但由于此病的病因及发病机制尚不明确，并且尚未找到与ESCC相关的特异性分子，因此患者的总体生存率依旧较低。研究表明，ESCC病变组织和正常组织之间存在DEGs，这些DEGs很可能会导致ESCC的发生和发展。因此，寻找ESCC患者的特征基因对改善ESCC的临床预后十分重要。机器学习能够预测疾病的发生风险，而在机器学习中常用的两种算法LASSO和SVM的联合应用能够对疾病发生过程中的特征基因进行有效筛选^[12]。随着基因芯片技术的发展，可以利用机器学习初步筛选出食管鳞状细胞癌潜在的治疗靶点，为研究ESCC的机制奠定基础，为ESCC诊断、风险评估及延长患者生存期提供新策略^[9，13]。

本研究通过对基因芯片的挖掘和机器学习得到DEGs和特征基因，并对DEGs进行富集和免疫浸润分析、对特征基因进行诊断价值和免疫细胞相关性分析。GO、KEGG和GSEA富集分析显示，表皮发育、含胶原的细胞外基质、蛋白质的消化和吸收、丝氨酸水解酶活性、白细胞介素（IL）-17通路均与ESCC的发生、发展密切相关。含胶原的细胞外基质是细胞外基质的重要组成部分。一方面，它是组织肿瘤转移的屏障；另一方面又参与肿瘤发生发展中细胞增殖、迁移、分化等多个过程^[14-15]。免疫细胞浸润结果显示，ESCC患者中CD4⁺T细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、活化的树突状细胞显著上调，静息的肥大细胞、活化的肥大细胞显著下调。通过IL-17诱导炎性因子的分泌，CD4⁺T细胞能促进炎性反应，介导自身免疫疾病和肿瘤的发展^[16-17]。

通过机器学习筛选得到4个特征基因，分别为：UBL3、KIF4A、KIF14、GPX3。UBL3被确认为是非小细胞癌的抑癌基因，且在ESCC、胃癌、胰腺癌中低表达，其机制可能是肿瘤细胞通过下调UBL3导致有缺陷的组织相容性复合体II类（MHC II）泛素化，从而引起肿瘤细胞免疫逃逸，使UBL3得到调节，使机体对肿瘤细胞的免疫反应增强，这可能是解决肿瘤免疫抑制的一个途径^[18]。越来越多的研究证明GPX3在多种癌症中低表达^[19]。有研究发现上调GPX3限制了人食管癌细胞（KYSE-510）的增殖和迁移能力，其机制可能与启动子CpG位点的高甲基化有关^[20]。研究发现在ESCC临床样本中KIF14和KIF4A过表达，下调KIF14和KIF4A可以抑制ESCC细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成并增强肿瘤对化疗药物的敏感性^[21-23]。综上，UBL3、KIF4A、KIF14、GPX3具有作为诊疗ESCC生物标志物的潜力。

无论是富集分析还是免疫浸润分析，都表明了ESCC与细胞外基质、免疫细胞代谢、炎症相关通路密切相关。中医治疗ESCC总的原则是扶正祛邪、和降胃气、化痰散瘀、甘凉濡润，辨证后灵活选用清热解毒、理气止痛、滋阴润燥等药物。通过中药的调理可以减轻临床症状、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤微环境恢复平衡状态、减少肿瘤细胞转移。本研究通过特征基因对治疗ESCC相关中药进行探索，发现微观层面的基因疗法与和中药治疗ESCC的思路有一定的相似之处。

本文可以为中医药治疗ESCC提供一定的理论依据，并对未来深入挖掘中医经典中可能存在的微观机制提供参考依据。然而本研究仍存在一些局限。首先，尽管本研究已经对几个数据集进行了批量校正，但系统误差依旧存在；其次，开源的数据集没有充分提供临床上特征基因的信息，这限制了研究进一步解释诊断基因与某些特征基因之间的潜在关系；最后，虽然本研究通过评估特征基因为诊断提供一定的依据，但是结果仍处于分析和推测阶段，没有实验验证。今后可以使用微阵列技术和实时荧光定量PCR等方法进一步评估特征基因的诊断价值。

参考文献