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miRNA-28-5p对胆管细胞癌患者预后的预测作用及对肿瘤增殖和侵袭的作用

  • 程立超1

    机 构：

    1. 山东第二医科大学附属医院肝胆胰外科（潍坊 261000 ）

    ×
  • ，于国秀2

    机 构：

    2. 潍坊市人民医院甲乳外科（潍坊 261000 ）

    ×
  • ，李洁旭1

    机 构：

    1. 山东第二医科大学附属医院肝胆胰外科（潍坊 261000 ）

    ×

1. 山东第二医科大学附属医院肝胆胰外科（潍坊 261000 ）；
2. 潍坊市人民医院甲乳外科（潍坊 261000 ）；

Study of prognostic predictive role of miRNA-28-5p in cholangiocarcinoma patients and its promotion of tumor proliferation and invasion

  • Cheng Li-chao1

    Affiliation：

    1. Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery, Shandong Second Medical University Affiliated Hospital, Weifang ( 261000 ), China

    ×
  • ，Yu Guo-xiu2
  • ，Li Jie-xu1

    Affiliation：

    1. Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery, Shandong Second Medical University Affiliated Hospital, Weifang ( 261000 ), China

    ×

Department of Hepatobiliary Pancreatic Surgery, Shandong Second Medical University Affiliated Hospital, Weifang ( 261000 ), China；

通讯作者:

李洁旭，E-mail: 530441292@qq.com

中图分类号:R735.8

文献标识码:A

DOI:10.3969/j.issn.1007-6948.2024.04.017

参考文献 1
Banales JM,Cardinale V,Carpino G,et al.Expert consensus document:Cholangiocarcinoma:current knowledge and future perspectives consensus statement from the European Network for the Study of Cholangiocarcinoma(ENS-CCA)[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2016,13(5):261-280.
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参考文献 2
Morise Z,Sugioka A,Hoshimoto S,et al.Patient with advanced intrahepatic cholangiocarcinoma with long-term survival successfully treated with a combination of surgery and chemotherapy[J].J Hepatobiliary Pancreat Surg,2008,15(5):545-548.
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参考文献 3
Razumilava N,Gores GJ.Cholangiocarcinoma[J].Lancet,2014,383(9935):2168-2179.
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参考文献 4
Wu ZW,Jiang SM,Chen Y.Non-coding RNA and Drug resistance in cholangiocarcinoma[J].Noncoding RNA Res,2024,9(1):194-202.
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参考文献 5
Yang MH,Yao Y,Eades G,et al.MiR-28 regulates Nrf2 expression through a Keap1-independent mechanism[J].Breast Cancer Res Treat,2011,129(3):983-991.
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参考文献 6
Bartolomé-Izquierdo N,de Yébenes VG,Álvarez-Prado AF,et al.MiR-28 regulates the germinal center reaction and blocks tumor growth in preclinical models of non-Hodgkin lymphoma[J].Blood,2017,129(17):2408-2419.
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参考文献 7
Wang C,Wu CY,Yang Q,et al.MiR-28-5p acts as a tumor suppressor in renal cell carcinoma for multiple antitumor effects by targeting RAP1B[J].Oncotarget,2016,7(45):73888-73902.
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参考文献 8
Hosseini SF,Javanshir-Giv S,Soleimani H,et al.The importance of hsa-miR-28 in human malignancies[J].Biomedecine Pharmacother,2023,161:114453.
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参考文献 9
Zhang JB,Yao Y,Li HZ,et al.MiR-28-3p inhibits prostate cancer cell proliferation,migration and invasion,and promotes apoptosis by targeting ARF6[J].Exp Ther Med,2021,22(5):1205.
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参考文献 10
Zhou SL,Hu ZQ,Zhou ZJ,et al.MiR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis[J].Hepatology,2016,63(5):1560-1575.
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参考文献 11
Guo YT,Cui XL,Zhang Y,et al.Diagnostic and prognostic value of serum miR-296-5p and miR-28-3p in human gastric cancer[J].Cancer Biother Radiopharm,2023,38(2):95-101.
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参考文献 12
Ma L,Zhang YF,Hu F.MiR-28-5p inhibits the migration of breast cancer by regulating WSB2[J].Int J Mol Med,2020,46(4):1562-1570.
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参考文献 13
Almeida MI,Nicoloso MS,Zeng LZ,et al.Strand-specific miR-28-5p and miR-28-3p have distinct effects in colorectal cancer cells[J].Gastroenterology,2012,142(4):886-896.
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参考文献 14
Cui MF,Chen MY,Shen ZM,et al.LncRNA-UCA1 modulates progression of colon cancer through regulating the miR-28-5p/HOXB3 axis[J].J Cell Biochem,2019,120(5):6926-6936.
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目录contents

    摘要

    目的：探讨miR-28-5p表达与胆管细胞癌患者预后的关系及其对肿瘤增殖和侵袭的作用。方法：纳入2017年10月—2020年12月在我院接受根治性切除的胆管细胞癌患者112例。选取其胆管细胞癌组织和相邻癌旁组织，在胆管癌细胞系TFK-1、RBE、HuH28、HuCCT-1、QBC939及正常胆管上皮细胞HIBEpic中检测miR-28-5p的表达水平。采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析miR-28-5p与患者预后的关系。采用CCK-8和Transwell实验分析miR-28-5p对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果：胆管细胞癌癌组织和细胞系中miR-28-5p表达水平均显著高于癌旁组织和正常上皮细胞。miR-28-5p低表达与患者的不良预后显著相关。下调miR-28-5p可促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达miR-28-5p则可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。结论：miR-28-5p有作为胆管细胞癌患者的预后标志物和潜在治疗靶点的前景。

    Abstract

    Objective To investigate the relationship between miR-28-5p expression and the prognosis of cholangiocarcinoma patients, as well as its functional role in tumor occurrence and development. Methods A total of 112 cholangiocarcinoma patients who underwent surgical resection were included in this study. The expression levels of miR-28-5p were detected in 112 pairs of cholangiocarcinoma tissues and adjacent non-cancerous tissues, as well as in CCA cell lines (TFK-1, RBE, HuH28, HuCCT-1, QBC939) and normal biliary epithelial cells (HIBEpic). The relationship between miR-28-5p and patient prognosis was analyzed using Kaplan-Meier curves and Cox regression analysis. The effects of miR-28-5p on cell proliferation, migration, and invasion were assessed using CCK-8 and Transwell assays. Results The expression levels of miR-28-5p in cholangiocarcinoma tissues and cell lines were significantly higher than those in adjacent non-cancerous tissues and normal epithelial cells. Additionally, low expression of miR-28-5p was significantly associated with poor prognosis in patients. Downregulation of miR-28-5p promoted proliferation, migration, and invasion of cholangiocarcinoma cells, while overexpression of miR-28-5p inhibited these processes. Conclusion miR-28-5p holds promise as a prognostic marker and potential therapeutic target for cholangiocarcinoma patients.

    关键词

    胆管细胞癌 ； miRNA-28-5p ； 预后 ； 增殖 ； 侵袭

  • 胆管细胞癌是肝胆系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。由于临床症状隐匿，约半数胆管细胞癌患者在诊断时已为晚期，并失去手术机会，预后很差[2]。即使采用手术治疗后，胆管细胞癌复发和转移率仍然非常高[3]。目前现有的临床分期系统在胆管细胞癌患者的治疗选择和预后准确性方面仍存在不足。因此，临床上仍迫切需要可靠的预后指标，以实现最佳治疗方案选择。

  • miRNA是包含约22个核苷酸的非编码RNA分子，主要在转录后水平发挥调节作用。miRNA的异常表达在各种恶性肿瘤中普遍存在，并参与包括胆管细胞癌在内的多种肿瘤的发生发展[4]。多项研究显示，miRNA-28-5p在乳腺癌、结直肠癌、淋巴瘤及肾癌等多种肿瘤中存在异常表达，并与患者不良预后相关[5-7]。而miRNA-28-5p在胆管细胞癌的作用仍罕见报道。本研究旨在探讨miRNA-28-5p在肝内胆管细胞癌中的表达情况，对患者预后预测的作用，以及其对肿瘤增殖、迁移、侵袭的影响。

  • 1 资料与方法

  • 1.1 一般资料

  • 回顾性收集2017年10月—2020年12月在我院接受根治性切除的胆管细胞癌患者112例。从手术标本中获取了配对的癌组织和癌旁正常组织，并立即放入液氮中保存于-80℃。本研究纳入的所有患者在接受手术治疗前均未接受包括化疗、放疗或免疫治疗在内的各种治疗。所有患者在术后按照中国临床肿瘤学会（CSCO）指南接受了标准化治疗（吉西他滨加顺铂作为一线治疗）。所有患者均接受了手术切除，并且至少有3年的随访信息可供分析，随访数据第1年每3个月收集1次，而后间隔6个月收集1次。

  • 1.2 细胞系及细胞培养

  • 将胆管癌细胞系TFK-1、RBE、HuH28、HuCCT-1及QBC939培养于含有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺和25 µg/ml庆大霉素的Dulbecco's改良的DMEM培养基。正常胆管上皮细胞HIBEpic在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中培养。所有细胞均在37℃和5% CO2孵育箱中培养。

  • 1.3 qRT-PCR检测miR-28-5p表达水平

  • 从胆管细胞癌组织和细胞系中使用Trizol试剂按照试剂说明书进行总RNA提取。cDNA通过ThermoScript RT-PCR系统合成。qRT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq II试剂在ABI 7500系统上进行。以U6基因作为内参基因，使用2−ΔΔCt计算miR-28-5p相对表达水平。

  • 1.4 CCK-8细胞增殖实验

  • 使用CCK-8试剂检测miR-28-5p对细胞增殖的影响。转染后的细胞以5000个细胞/孔的密度悬浮在96孔板中，于37℃、5% CO2的孵育箱中培养。在细胞接种后的0、24、48和72 h，向每个孔中加入CCK-8试剂，并孵育2 h。使用微板分光光度计在450 nm处测量吸光度值。

  • 1.5 Transwell检测miR-28-5p对细胞迁移和侵袭的影响

  • 对于Transwell侵袭实验，上层孔预涂Matrigel，而迁移实验则不添加Matrigel。共使用5×104个细胞在无血清培养基中放置于上层孔中，在37℃和5%CO2下孵育。含有10% FBS的培养基被用作诱导剂，加入到底部孔中。孵育24 h后，穿过膜底面的迁移/侵袭细胞被固定、染色，，随机选择5个视野并计数。

  • 1.6 统计学方法

  • 使用SPSS 22.0软件进行统计分析。使用Kolmogorov-Smirnov检验验证变量的正态性，P>0.05为正态分布数据。连续变量以均值±标准差表示，比较采用t检验。采用Kaplan-Meier方法计算生存曲线，采用Cox比例风险模型分析患者不良预后的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

  • 2 结果

  • 2.1 miR-28-5p在胆管细胞癌组织和细胞系中的表达情况

  • 通过qRT-PCR分析显示，与癌周正常组织相比，胆管细胞癌患者肿瘤组织中miRNA-28-5p的表达水平明显下调（P<0.001，图1A）。在TFK-1、RBE、HuCCT-1、QBC939及Huh28等5种胆管癌细胞系中，miRNA-28-5p的表达水平均显著低于正常胆管上皮细胞HIBEpic（P<0.001，图1B）。

  • 图1 miR-28-5p在胆管癌组织及细胞系中的表达情况

  • 2.2 miRNA-28-5p下调与胆管细胞癌患者不良预后相关

  • Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，miRNA-28-5p低表达胆管细胞癌患者的总生存率显著低于miRNA-28-5p高表达的患者（P<0.001，图2）。利用单变量及多变量Cox回归分析显示：淋巴结转移、TNM分期晚及miRNA-28-5p低表达是患者不良预后的独立危险因素（表1）。

  • 图2 miR-28-5p表达与胆管细胞癌总生存期关系分析

  • 2.3 miRNA-28-5p表达下调促进胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭

  • 使用miRNA-28-5p抑制剂在Huh28及QBC939细胞系中下调miRNA-28-5p表达，并使用miRNA-28模拟子在TFK-1及HuCCT-1细胞系中上调miRNA-28-5p的表达（图3A）。CCK-8实验表明，miRNA-28-5p的过表达可抑制胆管癌细胞的增殖，而下调miRNA-28-5p可促进胆管癌细胞的增殖（图3B）。Transwell迁移和侵袭实验表明，miRNA-28-5p的过表达可抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭能力，而抑制miRNA-28-5p表达则可促进胆管癌细胞的迁移和侵袭（图4）。

  • 表1 影响患者不良预后的Cox回归分析

  • 图3 过表达或敲降miR-28-5p对胆管癌细胞增殖能力的影响

  • 图4 过表达或敲降miR-28-5p对胆管癌细胞迁移及侵袭能力的影响

  • 3 讨论

  • miR-28是编码基因位于染色体3q28的内含子型miRNA。miRNA通过RNA聚合酶II在染色体上的基因区域进行转录，产生具有5'帽子结构和3'多聚腺苷酸尾的pri-miRNA。RNA特异性内核糖核酸酶III和DGCR8辅因子结合形成微处理器复合物，然后剪切pri-miRNA产生具有发夹结构的前体miRNA。而后Dicer RNA酶切割前体miRNA产生成熟的miRNA[8]。成熟的miRNA双链包括约22个碱基对，1个5'臂和1个3'臂。miR-28-5p和miR-28-3p是从前体miR-28的发夹结构的2个对立臂中产生的成熟miRNA。两者在功能和稳定性方面的生物学特性有所不同。它们可靶向癌症相关的基因，从而参与了肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化等过程。而根据深度测序数据，miR-28-5p参与癌症相关基因调控的频率比miR-28-3p更高[8]。

  • 研究表明，miR-28-5p在肿瘤中可发挥抑癌基因的作用[8]。miR-28-5p在包括前列腺癌、肾癌及肝癌等多种恶性肿瘤中的表达发生下调，从而促进肿瘤的增殖、侵袭及转移能力[7，9-10]。本研究显示，miR-28-5p在胆管细胞癌组织的表达水平发生显著下调，与上述研究结果一致。临床分期较晚的患者通常预后较差，因此寻找能够准确预测患者预后的标志物可以增加早期干预的机会，提高患者的生存率。此外，先前研究表明，miRNA-28-5p的低表达与胃癌患者的不良预后相关[11]。本研究显示，高表达miRNA-28-5p的胆管细胞癌患者的预后显著优于低表达患者，并且Cox回归分析证明miRNA-28-5p表达下调是患者不良预后的独立危险因素。

  • 此外，本研究通过上调或下调miR-28-5p在胆管癌细胞系中的表达水平，初步探索了其在胆管细胞癌发生发展中的功能。实验结果显示，抑制miR-28-5p表达可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达miR-28-5p则可抑制肿瘤细胞的这些生物学行为。这一结果也与miR-28-5p在其他多种肿瘤中的作用一致。例如，miR-28-5p通过靶向抑制WSB2基因抑制乳腺癌细胞迁移能力[12]。Almeida等[13]报道，miR28-5p可通过靶向CCND1基因抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭及转移能力。Cui等[14]报道在结肠癌中，LncRNA-UCA1可通过抑制miR-28-5p的表达导致HOXB3基因上调，从而促进肿瘤细胞的增殖及转移能力。

  • 综上所述，本研究证明miR-28-5p在胆管细胞癌中的表达发生显著下调，并与胆管细胞癌患者的不良预后相关。此外，miR-28-5p在胆管细胞癌中发挥抑癌基因的作用，其表达下调可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。提示miR-28-5p有作为胆管细胞癌患者的预后标志物和潜在治疗靶点的前景。

  • 参考文献

    • [1] Banales JM,Cardinale V,Carpino G,et al.Expert consensus document:Cholangiocarcinoma:current knowledge and future perspectives consensus statement from the European Network for the Study of Cholangiocarcinoma(ENS-CCA)[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2016,13(5):261-280.

    • [2] Morise Z,Sugioka A,Hoshimoto S,et al.Patient with advanced intrahepatic cholangiocarcinoma with long-term survival successfully treated with a combination of surgery and chemotherapy[J].J Hepatobiliary Pancreat Surg,2008,15(5):545-548.

    • [3] Razumilava N,Gores GJ.Cholangiocarcinoma[J].Lancet,2014,383(9935):2168-2179.

    • [4] Wu ZW,Jiang SM,Chen Y.Non-coding RNA and Drug resistance in cholangiocarcinoma[J].Noncoding RNA Res,2024,9(1):194-202.

    • [5] Yang MH,Yao Y,Eades G,et al.MiR-28 regulates Nrf2 expression through a Keap1-independent mechanism[J].Breast Cancer Res Treat,2011,129(3):983-991.

    • [6] Bartolomé-Izquierdo N,de Yébenes VG,Álvarez-Prado AF,et al.MiR-28 regulates the germinal center reaction and blocks tumor growth in preclinical models of non-Hodgkin lymphoma[J].Blood,2017,129(17):2408-2419.

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图1 miR-28-5p在胆管癌组织及细胞系中的表达情况

图2 miR-28-5p表达与胆管细胞癌总生存期关系分析

图3 过表达或敲降miR-28-5p对胆管癌细胞增殖能力的影响

图4 过表达或敲降miR-28-5p对胆管癌细胞迁移及侵袭能力的影响

表1 影响患者不良预后的Cox回归分析

图表 1/1

  • 基本信息

    中图分类号: R735.8
    文献标识码: A
    DOI: 10.3969/j.issn.1007-6948.2024.04.017

    稿件历史

    收稿日期: 2024-04-28

  • 参考文献

    • [1] Banales JM,Cardinale V,Carpino G,et al.Expert consensus document:Cholangiocarcinoma:current knowledge and future perspectives consensus statement from the European Network for the Study of Cholangiocarcinoma(ENS-CCA)[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2016,13(5):261-280.

    • [2] Morise Z,Sugioka A,Hoshimoto S,et al.Patient with advanced intrahepatic cholangiocarcinoma with long-term survival successfully treated with a combination of surgery and chemotherapy[J].J Hepatobiliary Pancreat Surg,2008,15(5):545-548.

    • [3] Razumilava N,Gores GJ.Cholangiocarcinoma[J].Lancet,2014,383(9935):2168-2179.

    • [4] Wu ZW,Jiang SM,Chen Y.Non-coding RNA and Drug resistance in cholangiocarcinoma[J].Noncoding RNA Res,2024,9(1):194-202.

    • [5] Yang MH,Yao Y,Eades G,et al.MiR-28 regulates Nrf2 expression through a Keap1-independent mechanism[J].Breast Cancer Res Treat,2011,129(3):983-991.

    • [6] Bartolomé-Izquierdo N,de Yébenes VG,Álvarez-Prado AF,et al.MiR-28 regulates the germinal center reaction and blocks tumor growth in preclinical models of non-Hodgkin lymphoma[J].Blood,2017,129(17):2408-2419.

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    • [8] Hosseini SF,Javanshir-Giv S,Soleimani H,et al.The importance of hsa-miR-28 in human malignancies[J].Biomedecine Pharmacother,2023,161:114453.

    • [9] Zhang JB,Yao Y,Li HZ,et al.MiR-28-3p inhibits prostate cancer cell proliferation,migration and invasion,and promotes apoptosis by targeting ARF6[J].Exp Ther Med,2021,22(5):1205.

    • [10] Zhou SL,Hu ZQ,Zhou ZJ,et al.MiR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis[J].Hepatology,2016,63(5):1560-1575.

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    • [13] Almeida MI,Nicoloso MS,Zeng LZ,et al.Strand-specific miR-28-5p and miR-28-3p have distinct effects in colorectal cancer cells[J].Gastroenterology,2012,142(4):886-896.

    • [14] Cui MF,Chen MY,Shen ZM,et al.LncRNA-UCA1 modulates progression of colon cancer through regulating the miR-28-5p/HOXB3 axis[J].J Cell Biochem,2019,120(5):6926-6936.


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